腺病毒及其用途的制作方法

文档序号：21107113发布日期：2020-06-16 21:23阅读：154来源：国知局

本发明涉及生物技术。更具体地说，涉及腺病毒载体诸如复制缺陷型腺病毒载体在宿主中递送抗原并引发免疫应答的领域和用途。

背景技术：

重组腺病毒载体广泛应用于基因治疗应用和疫苗。基于adv-5载体的疫苗已显示出在多种动物模型中引发强有力的和保护性的免疫应答(参见例如wo2001/02607；wo2002/22080；shiver等人,nature[自然]415:331(2002)；letvin等人,ann.rev.immunol.[免疫学年鉴]20:73(2002)；shiver和emini,ann.rev.med.[医学年鉴]55:355(2004))。然而，基于重组adv-5载体的疫苗的效用将可能受到人群中adv-5特异性中和抗体(nab)的高血清阳性率的限制。在小鼠、恒河猴和人的研究中，抗adv-5免疫的存在已经显示出基本上抑制了基于adv-5的疫苗的免疫原性。

一种在先前已被最常见的人腺病毒(例如adv-5)感染或治疗的个体中规避预先存在的免疫性的有前景的策略涉及开发来自腺病毒血清型的重组载体，这些腺病毒血清型未遇到这种预先存在的免疫性。一种这样的策略是基于使用猿猴腺病毒，因为这些腺病毒通常不感染人并且在人样品中表现出低血清阳性率。猿猴腺病毒可应用于人类用途，因为已表明这些病毒可在体外感染人细胞(wo2003/000283、wo2004/037189)。

因此，本领域需要可大量生产的、在宿主中不会遇到预先存在的免疫、但仍具有免疫原性并能够诱导针对由插入载体中的异源核酸编码的抗原的强烈免疫应答的替代性腺病毒载体。

技术实现要素：

已经分离了新型猿腺病毒，这些腺病毒在系统发育上与人腺病毒c种属于同一组。已经开发了含有新的猿腺病毒分离株的新型核酸序列的腺病毒载体以满足尚未满足的需要。提供了编码新型猿腺病毒分离株的六邻体多肽的分离的核酸序列。在某些实施例中，六邻体多肽包括具有seqidno:1的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。在某些实施例中，六邻体多肽包含bz1六邻体多肽的氨基酸序列(seqidno:2)。

还提供了编码新型猿腺病毒分离株的纤维多肽的分离的核酸序列。在某些实施例中，纤维多肽包含bz28纤维多肽的氨基酸序列(seqidno:3)。

本发明的实施例还包括由本发明的核酸序列编码的分离的纤维多肽和六邻体多肽。

本文进一步提供了分离的核酸，这些分离的核酸包含编码本文披露的六邻体多肽中的至少一种的核酸序列，以及编码本文披露的纤维多肽中的至少一种的核酸序列。在某些实施例中，本文提供了包含本文所述的分离的核酸的载体。在一个实施例中，该载体是病毒载体。在另一个实施例中，该载体是表达载体。在一个优选的实施例中，该载体是腺病毒载体。更优选地，该载体进一步包含至少一种转基因。

还提供了包含本文所述的载体的重组细胞。这样的细胞可以用于重组蛋白生产、重组蛋白表达，或载体或病毒颗粒的生产。还提供了生产载体的方法。这些方法包括(a)使本文披露的重组细胞在用于生产载体的条件下生长；以及(b)从该重组细胞中分离该载体。

在某些实施例中，提供了包含本文披露的载体的免疫原性组合物。还提供了在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，这些方法包括向该受试者施用本文披露的免疫原性组合物。

在某些实施例中，提供了腺病毒载体，这些腺病毒载体包含(a)至少一个转基因；以及(b)根据本发明的实施例的编码六邻体多肽的核酸序列。六邻体多肽可以例如包含具有seqidno:1的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。在某些实施例中，六邻体多肽包含bz1六邻体多肽的氨基酸序列(seqidno:2)或bz28六邻体多肽的氨基酸序列(seqidno:5)。

在某些实施例中，提供了腺病毒载体，这些腺病毒载体包含(a)至少一个转基因；以及(b)根据本发明的实施例的编码纤维多肽的核酸序列。在某些实施例中，纤维多肽包含选自bz1(seqidno:4)或bz28纤维多肽(seqidno:3)的氨基酸序列。本发明的实施例还包括腺病毒载体，这些腺病毒载体包含：(a)至少一个转基因；(b)根据本发明的实施例的编码六邻体多肽的核酸序列；以及(c)根据本发明的实施例的编码纤维多肽的核酸序列。

在某些实施例中，本文提供的腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒载体(rad)。在一个实施例中，腺病毒载体可以包含e1缺失。在某些实施例中，本文提供的腺病毒载体可进一步包含e3缺失。腺病毒载体可以是包含来自一种或多种猿猴腺病毒(sadv)诸如黑猩猩腺病毒(例如chad3)、大猩猩腺病毒或恒河猴腺病毒(例如，rhad51、rhad52或rhad53)的腺病毒核酸序列的猿猴腺病毒载体。腺病毒载体可以是包含来自一种或多种人腺病毒(例如，hadv-4、hadv-5、hadv-26、hadv-35)的腺病毒序列的人腺病毒载体。优选地，腺病毒载体是包含一个或多个人腺病毒核酸序列的嵌合腺病毒载体。人腺病毒核酸序列可以例如来自人腺病毒-4(hadv-4)、人腺病毒-5(hadv-5)、人腺病毒-26(hadv-26)或人腺病毒-35(hadv-35)。腺病毒载体可以例如包含人腺病毒-5(hadv-5)e4orf6和orf6/7。

在某些实施例中，转基因与反向末端重复序列(itr)相邻定位。在某些实施例中，转基因位于e1缺失处或附近、e3缺失处或附近、和/或右itr(ritr)附近。

在某些实施例中，本文提供的腺病毒载体包含seqidno:9或seqidno:10的核酸序列。

还提供了包含本文所述的腺病毒载体和药学上可接受的载剂的免疫原性组合物或疫苗。进一步提供了用于在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法。这些方法包括向该受试者施用本文披露的疫苗。进一步提供了生产疫苗的方法。这些方法包括将本文披露的腺病毒载体与药学上可接受的载剂组合。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本申请的优选实施例的以下详细描述。然而，应当理解，本申请不限于附图中所示的精确实施例。

图1显示由bz1/bz28.fluc诱导的细胞和体液免疫应答。图1a显示实验设置。图1b显示免疫后2周时由ad26.fluc和bz1/bz28.fluc诱导的针对载体编码的插入物(即，fluc，萤火虫萤光素酶)的细胞免疫应答，如通过干扰素γ(ifn-γ)elispot分析所测定的。图1c显示用ad26.fluc、bz1/bz28.fluc和空ad26载体免疫后2周在小鼠中诱导的fluc特异性igg抗体滴度的图。

图2显示在用腺病毒载体ad35、ad26、ad5、ad4和bz1/bz28免疫的小鼠中诱导的同源和异源腺病毒中和滴度。

图3显示ad26和bz1/bz28在200个来自年龄为18-55岁、生活在美国(us)和欧盟(eu)的成人的人类群组血清样品中的血清阳性率。将这些血清中针对每种载体测得的中和滴度分成四个类别(<16(无中和)、16至300、300至1,000、1000至4000和>4000)，如在所示的图表中表示的。

图4显示质粒pbz1_bz28f的示意图。

图5显示质粒pbz1_bz28f.5ixp的示意图。

图6显示新型载体bz1/bz28.fluc在生产细胞系sper.c6中的生产率。

具体实施方式

本披露至少部分地基于分离和鉴定分入人腺病毒c种的新的猿腺病毒血清型，以及构建和评价包含编码猿六邻体和纤维多肽的可变区的核酸的疫苗载体。另外，本披露至少部分地基于包含大猩猩腺病毒骨架和黑猩猩腺病毒六邻体序列的嵌合腺病毒载体的创建。这些腺病毒载体能够引发免疫应答，而且在人体中具有低血清阳性率。这些腺病毒载体可以被配制成疫苗并用于诱导针对感兴趣的特异性抗原的保护性免疫。

在背景技术和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献各自通过援引以其全文并入本文。包括在本说明书中的对文件、法案、材料、装置、制品等的讨论用于提供本发明的背景的目的。这种讨论不承认任何或所有这些事项形成关于所披露或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。

除非另外定义，否则本文所用的所有科学和技术术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文所用的某些术语具有说明书中阐述的含义。

必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种”和“该”包括复数指示物。

除非另有说明，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围，应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，数值典型地包括列举值±10％。例如，1mg/ml的浓度包括0.9mg/ml至1.1mg/ml。同样地，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所用，数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围，该范围内的所有单个数值，包括值的这些范围内的整数和分数，除非上下文另有明确指示。

除非另外指明，否则在一系列要素前面的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个要素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验便确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同方案。这些等同方案也旨在包括在本发明中。

如本文所用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或它们的任何其他变化，将被理解为意味着包括所述整数或整数组，而不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放性的。例如，包含元件的清单的组合物、混合物、工艺、方法、物品或设备不一定限制于仅那些元件，而可以包括不是此类组合物、混合物、工艺、方法、物品或设备明确列出的或固有的其他元件。此外，除非明确地说明是相反的，否则“或”是指包括在内的或，而不是指排他性的或。例如，以下项中的任一者满足条件a或b：a是真(或存在)并且b是假(或不存在)，a是假(或不存在)并且b是真(或存在)，以及a和b二者都是真(或存在)。

如本文所用，多个引用的要素之间的连接术语“和/或”应被理解为涵盖单独的和组合的选项两者。例如，当两种要素由和/或连接时，第一选项是指在不具有第二要素的情况下第一要素的应用。第二选项是指在不具有第一要素的情况下第二要素的应用。第三选项是指第一要素和第二要素一起的应用。这些选项中的任一个应被理解为属于该含义之内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。这些选项中的多于一个的同时应用也应被理解为属于该含义之内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，贯穿说明书和权利要求书所用的术语“由……组成”指示包括任何列举的整数或整数组，但不能将另外的整数或整数组添加至指定的方法、结构或组合物。

如本文所用，贯穿说明书和权利要求书所用的术语“基本上由……组成”指示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不实质性改变所指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见m.p.e.p.§2111.03。

如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选哺乳动物，最优选人，其将或已经通过根据本发明实施例的方法接种。如本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更优选地是人。

词语“右”、“左”、“下”和“上”表示所参考的附图中的方向。

应当理解的是，当提及优选的发明的组分的规格或特征时，在此使用的术语“约”、“大约”、“总体上”、“基本上”、以及类似术语，指示描述的规格/特征不具有严格的界限或参数，并且并不从其排除功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员将理解的那样。在最低程度上，包括数值参数的此类引用将包括将不改变最低有效位数的变化，使用本领域接受的数学的和产业的原理(例如化整误差、测量误差或其他系统误差、制造公差等)。

在两个或更多个核酸或多肽序列(例如六邻体和纤维多肽以及编码它们的多核苷酸)的上下文中，术语“相同的”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查所测量的。

对于序列比较，典型地，一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机；如果需要，指定子序列坐标；以及指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可以例如通过smith&waterman,adv.appl.math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法、通过needleman&wunsch,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源性比对算法、通过pearson&lipman,proc.nat’l.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的类似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现形式(gap、bestfit、fasta和tfasta，威斯康星遗传学软件包(wisconsingeneticssoftwarepackage),遗传学计算机课题组(geneticscomputergroup),威斯康星州麦迪逊科学大道575号(575sciencedr.,madison,wi))、或通过目视检查(一般参见currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学实验室指南],f.m.ausubel等人编,currentprotocols[实验室指南],格林出版联合公司(greenepublishingassociates,inc.)和约翰威利父子公司(johnwiley&sons,inc.)的合资公司,(1995年增刊)(ausubel))来进行。

适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的实例是blast和blast2.0算法，这些算法描述于altschul等人(1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志]215:403-410和altschul等人(1997)nucleicacidsres.[核酸研究]25:3389-3402。用于进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)公开获得。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为w的短字来鉴定高得分序列对(hsp)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，这些序列对匹配或满足一些正值阈值得分t。t被称为邻近字分值阈值(altschul等人，同上)。这些初始的邻近字命中将作为种子，以用于启动搜索以发现包含它们的更长的hsp。然后，只要累积比对得分可以增加，字命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。

对于核苷酸序列，累积得分使用参数m(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和n(错配残基的罚分；总是<0)来计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当存在以下情况时，停止字命中在每个方向上的扩展：累积比对得分从其最大获得值下降数量x；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或者到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定比对的灵敏度和速度。blastn程序(用于核苷酸序列)使用11的字长(w)、10的期望值(e)、m＝5、n＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，blastp程序使用3的字长(w)、10的期望值(e)和blosum62评分矩阵作为默认值(参见henikoff&henikoff,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89:10915(1989))。

除了计算序列同一性百分比之外，blast算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如karlin&altschul,proc.nat’l.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90:5873-5787(1993))。blast算法提供的相似性的一种量度是最小和概率(p(n))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。

两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一个核酸编码的多肽与由第二个核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性，如下所述。因此，例如，如果某多肽和第二多肽仅因保守取代而不同，则两种肽通常基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交，如下所述。

如本文所用，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”是指该接种疫苗的受试者能够控制对其进行了疫苗接种的致病因子的感染。致病因子可以是例如抗原基因产物或抗原蛋白，或其片段。通常，已经出现了“保护性免疫应答”的受试者仅出现轻度至中度临床症状或根本没有症状。通常，对某种因子具有“保护性免疫应答”或“保护性免疫”的受试者不会由于所述因子的感染而死亡。

术语“佐剂”定义为一种或多种引起免疫系统刺激的物质。在此上下文中，使用佐剂来增强对本发明的腺病毒载体的免疫应答。

如本文所用，术语“抗原基因产物或其片段”或“抗原蛋白”可包括细菌、病毒、寄生虫、或真菌蛋白、或其片段。优选地，抗原性蛋白或抗原性基因产物能够在宿主中产生保护性免疫应答，例如诱导针对疾病或感染(例如细菌、病毒、寄生虫或真菌疾病或感染)的免疫应答，和/或在受试者中产生针对疾病或感染的免疫(即，接种疫苗)，其保护受试者抵抗疾病或感染。

腺病毒载体

暴露于某些腺病毒已经导致针对某些腺病毒血清型的免疫应答，这可以影响腺病毒载体的功效。因为人腺病毒感染在人类中是常见的，所以在人群中抗人腺病毒的中和抗体的流行率高。预计个体中存在这种中和抗体会降低基于人腺病毒骨架的基因转移载体的功效。一种避免功效降低的方法是替换腺病毒衣壳蛋白上的表位，这些表位是中和抗体的靶标。衣壳蛋白上的靶序列可以用来自其他腺病毒的蛋白序列替换，这些腺病毒具有低流行性，并因此而言，针对这些腺病毒的中和抗体在人群中很少。

“衣壳蛋白”是指腺病毒衣壳上的蛋白(例如bz1、bz28、hadv-4)或其功能片段或衍生物，其参与确定特定腺病毒的血清型和/或向性。衣壳蛋白典型地包括纤维蛋白、五邻体蛋白和/或六邻体蛋白。在某些实施例中，衣壳蛋白是腺病毒的完整或全长衣壳蛋白。在其他实施例中，衣壳蛋白是腺病毒的全长衣壳蛋白的片段或衍生物。在某些实施例中，由本发明的腺病毒载体编码的六邻体、五邻体和纤维具有相同或不同的腺病毒背景(即，bz1六邻体和bz28纤维、bz1六邻体和bz1纤维、bz28六邻体和bz1纤维、bz28六邻体和bz28纤维等)。

“六邻体多肽”指腺病毒六邻体外壳蛋白、其功能片段和衍生物。

“纤维多肽”指腺病毒纤维蛋白、其功能片段和衍生物。

针对腺病毒的中和抗体的一个靶标是主要外壳蛋白，即六邻体蛋白。用来自稀有腺病毒的六邻体蛋白替换六邻体蛋白，更优选地替换六邻体蛋白中定义血清型并结合中和抗体的可变序列，诸如从本文所述的猿猴中分离的那些，可以允许构建将不易被人类中常见的抗体中和的腺病毒载体。

针对腺病毒的中和抗体的第二个靶标是纤维蛋白。用来自非人源的稀有腺病毒的纤维序列替换纤维蛋白，更优选地替换纤维蛋白中的可变序列，诸如从本文所述的猿猴中分离的那些，也可以允许构建将不易被人类中常见的抗体中和的腺病毒载体。上述纤维替换与六邻体替换的组合可赋予对通常在人中发现的抗体的中和的额外抗性。

本公开提供了编码六邻体和/或纤维多肽的分离的核酸序列，这些六邻体和/或纤维多肽源自分离的猿猴腺病毒血清型；以及包含这些分离的核酸序列中的至少一种的腺病毒载体。

“腺病毒载体”指衍生自或包含腺病毒基因组的至少一部分的重组载体。

在优选的实施例中，分离的核酸序列编码六邻体多肽，这些六邻体多肽包括具有seqidno:1的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。在某些实施例中，六邻体多肽包含选自bz1六邻体多肽(seqidno:2)或bz28六邻体多肽(seqidno:5)的氨基酸序列。

在优选的实施例中，分离的核酸序列编码纤维多肽。纤维多肽可以例如包含选自bz1纤维多肽(seqidno:4)或bz28纤维多肽(seqidno:3)的氨基酸序列。

在优选的实施例中，提供了分离的核酸，其包含编码至少一种本文披露的六邻体多肽的核酸序列和编码至少一种本文披露的纤维多肽的核酸序列。

在优选的实施例中，提供了载体，优选腺病毒载体，其根据本发明的实施例包含编码六邻体多肽的分离的核酸序列和/或编码纤维多肽的分离的核酸序列中的至少一种。腺病毒载体可以例如包含bz1六邻体多肽(seqidno:2)或bz28六邻体多肽(seqidno:5)。腺病毒载体可以例如包含bz1纤维多肽(seqidno:4)或bz28纤维多肽(seqidno:3)。在某些实施例中，腺病毒载体包含编码六邻体多肽的核酸，其中该六邻体多肽包含选自bz1六邻体多肽(seqidno:2)或bz28六邻体多肽(seqidno:5)的氨基酸序列；以及编码纤维多肽的核酸，其中该纤维多肽包含选自bz1纤维多肽(seqidno:4)或bz28纤维多肽(seqidno:3)的氨基酸序列。腺病毒载体可以例如包含至少一个转基因；以及编码六邻体多肽和/或纤维多肽的核酸序列，其中六邻体多肽包括本文披露的含六邻体高变区多肽，并且纤维多肽包括本文所述的纤维多肽。

典型地，本发明的腺病毒载体包含在例如质粒、粘粒或杆状病毒载体上的完整重组腺病毒基因组。本发明的核酸分子可以呈rna形式或呈通过克隆而获得或以合成方式而产生的dna形式。dna可以是双链的或单链的。

普通技术人员将认识到，衍生自多种血清型的元件可以组合在单个腺病毒载体中，例如人或猿猴腺病毒。因此，可以产生组合了来自不同血清型的期望性质的嵌合腺病毒载体。因此，在一些实施例中，本发明的嵌合腺病毒载体可以将不存在预先存在的猿猴六邻体和/或纤维多肽序列免疫性与现有腺病毒载诸如rad4、rad5、rad26或rad35的高水平抗原递送和呈递能力相结合。

用作疫苗的腺病毒载体的优点包括易于操纵、良好的大规模可制造性以及基于多年的研究、开发、制造和临床试验经验的优异安全记录，这些临床试验使用了许多已报道的腺病毒载体。被用作疫苗的腺病毒载体通常提供对转基因编码的蛋白的良好免疫应答，包括细胞免疫应答。根据本发明的腺病毒载体可以基于任何类型的腺病毒，并且在某些实施例中是人腺病毒，其可以属于任何组或血清型。在优选的实施例中，重组腺病毒基于来自a、b、c、d、e、f或g组的人腺病毒。在其他优选的实施例中，重组腺病毒基于人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49或50。在其他实施例中，它是可以为任何血清型的猿猴腺病毒，诸如黑猩猩或大猩猩腺病毒。在某些实施例中，重组腺病毒基于黑猩猩腺病毒1、3、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50、67型或sa7p。

在更优选的实施例中，第二组合物的黑猩猩腺病毒载体是chadv3。重组黑猩猩腺病毒血清型3(chad3或cad3)是亚群c腺病毒，其性质类似于人腺病毒血清型5(ad5)的性质。chad3在评估丙型肝炎病毒(hcv)候选疫苗的人类研究中已显示出是安全的和免疫原性的(barnese等人2012sciencetranslationalmedicine[科学转化医学]4:115ra1)。据报道，基于chad3的疫苗能够诱导与人ad5载体疫苗相当的免疫应答。参见例如peruzzid等人2009vaccine[疫苗]27:1293-300和quinnkm等人2013jimmunol[免疫学杂志]190:2720-35；wo2005/071093；wo2011/0130627等。

腺病毒载体、其构建方法及其繁殖方法是本领域所熟知的，并且描述于例如美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191和6,113,913，以及thomasshenk,“adenoviridaeandtheirreplication”[腺病毒及其复制],m.s.horwitz,“adenoviruses”[腺病毒],分别第67和68章，见于virology[病毒学],b.n.fields等人编，第3版，纽约雷文出版社有限公司(ravenpress,ltd.,newyork)(1996)，以及本文提及的其他参考文献。典型地，腺病毒载体的构建涉及使用标准分子生物学技术，诸如以下文献中所述的那些技术：sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual[分子克隆，实验室手册],第2版,纽约冷泉港的冷泉港出版社(coldspringharborpress,coldspringharbor,n.y.)(1989)；watson等人,recombinantdna[重组dna],第2版,scientificamericanbooks[科学美国人](1992)；和ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学实验室指南],纽约威利国际科学出版公司(wileyintersciencepublishers,ny)(1995)；以及本文提及的其他参考文献。

在某些实施例中，腺病毒载体包含e1缺失和/或e3缺失。e1或e3缺失可以例如包括基因的完全缺失或部分缺失，其使得e1或e3基因产物具有功能缺陷。因此，在某些实施例中，腺病毒是复制缺陷型的，例如因为它在基因组的e1区含有缺失。如技术人员已知的，在缺失来自腺病毒基因组的必需区域的情况下，由这些区域编码的功能必须优选的是由生产细胞反式提供，即，当e1、e2和/或e4区域的部分或全部从腺病毒中缺失时，这些区域必须存在于生产细胞中，例如整合到其基因组中，或呈所谓的辅助腺病毒或辅助质粒形式。这些腺病毒还可以具有在e3区域中的缺失，该缺失对于复制是非必要的，因此不必补充这种缺失。e1、e2、e3和e4区域中的一个或多个也可以通过其他方法失活，诸如通过将感兴趣的转基因(通常与启动子连接)插入待失活的区域。

可以使用的生产细胞(有时在本领域中以及在本文还称为‘包装细胞’或‘补充细胞’)可以是可在其中繁殖所希望的腺病毒的任何生产细胞。例如，在生产细胞中完成重组腺病毒载体的繁殖，这些生产细胞补充腺病毒中的缺陷。此类生产细胞优选地在其基因组中至少具有腺病毒e1序列，并因而能够补充在e1区域中具有缺失的重组腺病毒。可以使用任何补充e1的生产细胞，诸如由e1永生化的人类视网膜细胞，例如911或per.c6细胞(参见美国专利5,994,128)、e1转化的羊水细胞(参见欧洲专利1230354)、e1转化的a549细胞(参见例如wo98/39411、美国专利5,891,690)、gh329:hela(gao等人,2000,humgenether[人类基因治疗]11:213-19)、293等。在某些实施例中，生产细胞是例如hek293细胞、或per.c6细胞、或911细胞、或it293sf细胞等。在(kovesdi等人,2010,viruses[病毒]2:1681-703)中对生产细胞中的腺病毒载体的生产进行了综述。

在某些实施例中，腺病毒载体是包含一个或多个人腺病毒核酸序列的嵌合腺病毒载体。人腺病毒核酸可以选自例如人腺病毒-4(ad-4)、人腺病毒-5(ad-5)、人腺病毒-26(ad-26)或人腺病毒-35(ad-35)。在某些实施例中，e1缺陷型腺病毒载体包含人ad5的腺病毒的e4-orf6编码序列。这使得此类腺病毒可在表达ad5的e1基因的熟知的补充细胞系中繁殖，诸如293细胞或per.c6细胞(参见例如fallaux等人,1998,humgenether[人类基因治疗]9:1909-17；havenga等人,2006,jgenvirol[普通病毒学杂志]87:2135-43；wo03/104467，它们通过援引以其全文并入本文)。

在某些实施例中，腺病毒载体包含转基因。“转基因”是指异源核酸，它是不天然存在于载体中的核酸，并且根据本发明，转基因可编码在受试者中引发免疫应答的抗原性基因产物或抗原性蛋白。转基因可以例如通过标准分子生物学技术引入载体中。例如，可将转基因克隆到腺病毒载体的缺失的e1或e3区域中，或e4区域与ritr之间的区域中。通常，转基因可操作地连接至表达控制序列。在优选的实施例中，转基因在转基因插入位点被插入。

如果需要，可以对根据本发明实施例的六邻体或纤维核酸序列、和/或转基因进行密码子优化，以确保在所治疗的宿主(例如人)中的正确表达。密码子优化是广泛应用于本领域的技术。

转基因可以在腺病毒衍生的启动子(例如，主要晚期启动子)的控制下(即，可操作地连接)，或者可以在异源启动子的控制下。合适的异源启动子的实例包括cmv启动子和rsv启动子。优选地，启动子位于表达盒内的感兴趣的异源基因的上游。

在优选的实施例中，腺病毒载体包含seqidno:9或seqidno:10的核酸序列。

免疫原性组合物

免疫原性组合物是用于本发明的包含免疫有效量的纯化的或部分纯化的人或猿猴(例如大猩猩)腺病毒载体的组合物。所述组合物可以根据本领域熟知的方法被配制成疫苗(也称为“免疫原性组合物”)。此类组合物可以包含佐剂以增强免疫应答。鉴于本披露，可以通过本领域技术人员熟知的技术确定制剂中每种组分的最佳比率。

鉴于本披露，根据本发明的实施例的免疫原性组合物可以使用本领域技术人员已知的方法制备。液体药物组合物通常包含液体载剂，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇，诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

可用于本发明的免疫原性组合物可以包含佐剂。适于根据本发明共同施用的佐剂应该是在人中潜在安全、耐受良好且有效的佐剂，包括qs-21、detox-pc、mpl-se、mogm-csf、titermax-g、crl-1005、gerbu、teramide、psc97b、adjumer、pg-026、gsk-i、as01、as03、as04、as15、gcmaf、b-alethine、mpc-026、adjuvax、cpgodn、betafectin、alum和mf59。

其他可以施用的佐剂包括凝集素、生长因子、细胞因子和淋巴因子，诸如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(pdgf)、粒细胞集落刺激因子(gcsf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)、肿瘤坏死因子(tnf)、表皮生长因子(egf)、il-i、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10和il-12或其编码核酸。

本发明的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应该是无毒的，并且不应该干扰活性成分的功效。载剂或其他材料的确切性质可以取决于施用途径，例如肌内、皮下、经口、静脉内、皮肤、粘膜内(例如，肠)、鼻内或腹膜内途径。

诱导保护性免疫的方法

本发明的另一个一般方面涉及在需要的受试者中诱导免疫应答的方法。这些方法可以例如包括向受试者施用包含本文所述的腺病毒载体和药学上可接受的载剂的疫苗。本文还提供了生产疫苗的方法。这些方法包括将本文所述的腺病毒载体与药学上可接受的载剂组合。

根据本发明的实施例的任何免疫原性组合物(包括但不限于本文所述的那些)均可在本发明方法中用作疫苗。

包含载体的免疫原性组合物/疫苗的施用典型地是肌内或皮下。然而，也可以设想其他施用方式，诸如静脉内、皮肤、皮内或鼻。免疫原性组合物的肌内施用可以通过使用针注射腺病毒载体的混悬液来实现。一种替代方案是使用无针注射装置来施用组合物(使用例如biojector^tm)或含有疫苗的冷冻干燥粉末。

对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在病痛部位的注射，载体将呈肠胃外可接受的水溶液的形式，它是无热原的并具有合适的ph、等渗性和稳定性。本领域技术人员完全能够使用例如等渗媒介物诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸盐林格氏注射液来制备适合的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。还可以使用缓释制剂。

典型地，施用将具有预防性目的，以在感染或发展症状之前产生针对感兴趣的抗原(例如，细菌、病毒、寄生虫和/或真菌病原体)的免疫应答。可根据本发明治疗或预防的疾病和病症包括免疫应答可在其中起到保护或治疗作用的那些。在其他实施例中，腺病毒载体可被施用用于暴露后预防。

将含有人或猿猴(例如大猩猩)腺病毒载体的免疫原性组合物施用给受试者，从而在受试者中产生对感兴趣的抗原的免疫应答。足以诱导可检测的免疫应答的组合物的量被定义为组合物的“免疫有效剂量”或“有效量”。本发明的免疫原性组合物可以诱导体液以及细胞介导的免疫应答。在典型的实施例中，免疫应答是保护性免疫应答。

施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于正治疗的疾病的性质和严重度。治疗处方(例如剂量等的决定)是在全科医生和其他医师、或在兽医环境中是兽医的职责范围内的，并且典型地考虑了待治疗的病症、个体患者的状况、递送部位、施用方法以及医师已知的其他因素。以上提及的这些技术和方案的实例可以在remington'spharmaceuticalsciences[雷明顿药学大全],第16版，osol,a.编,1980中找到。

在产生腺病毒载体和任选将此类颗粒配制成组合物后，可以将这些载体施用给个体，特别是人或其他灵长类动物。可以对人或另一种哺乳动物施用，例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、绵羊、山羊、猪、马、牛、驴、猴、狗或猫。向非人哺乳动物的递送不必是为了治疗目的，而是可以用于实验环境，例如研究对腺病毒载体的免疫应答机制。

在一个示例性方案中，腺病毒载体以约100μl至约10ml范围内的体积施用(例如肌内)，该体积的浓度为约10⁴至10¹²个病毒颗粒/ml。优选地，腺病毒载体以0.1-2.0ml范围内的体积施用。例如，腺病毒载体可以100μl、500μl、1ml、2ml施用。更优选地，腺病毒载体以0.5ml的体积施用。任选地，腺病毒载体以10⁷vp/ml、10⁸vp/ml、10⁹vp/ml、10¹⁰vp/ml、5x10¹⁰vp/ml、10¹¹vp/ml或10¹²vp/ml的浓度施用。典型地，在一次施用期间，腺病毒载体以约10⁹至约10¹²个病毒颗粒(vp)的量，更典型地以约10¹⁰至约10¹²个vp的量施用于人受试者。

初始疫苗接种之后可以是从包含编码感兴趣抗原的相同腺病毒载体的疫苗/组合物或包含编码相同感兴趣抗原的不同腺病毒载体的疫苗/组合物的加强或激发。

如果需要，组合物可以存在于试剂盒、包装或分配器中，该试剂盒、包装或分配器可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，试剂盒可以包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。试剂盒、包装或分配器可附有施用说明书。

本发明的组合物可以单独施用或与其他治疗联合施用(同时地或按顺序)，这取决于待治疗的病状。

实施例

本发明还提供了以下非限制性实施例。

实施例1是一种分离的核酸序列，该分离的核酸序列编码六邻体多肽，该六邻体多肽包括具有seqidno:1的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。

实施例2是如实施例1所述的分离的核酸序列，其中该六邻体多肽包含bz1六邻体多肽的氨基酸序列(seqidno:2)。

实施例3是如实施例1或2所述的分离的核酸序列，该分离的核酸序列进一步包含编码纤维多肽的核酸序列。

实施例4是如实施例3所述的分离的核酸序列，其中该纤维多肽包含选自bz1纤维多肽(seqidno:4)或bz28纤维多肽(seqidno:3)的氨基酸序列。

实施例5是一种分离的核酸序列，该分离的核酸序列编码包含bz28纤维多肽的氨基酸序列(seqidno:3)的纤维多肽。

实施例6是一种载体，该载体包含如实施例1-5中任一项所述的核酸。

实施例7是如实施例6所述的载体，该载体是腺病毒载体，并且进一步包含至少一个转基因。

实施例8是一种重组细胞，该重组细胞包含如实施例6或7所述的载体。

实施例9是一种生产载体的方法，该方法包括：(a)使如实施例8所述的重组细胞在用于生产该载体的条件下生长；以及(b)从该重组细胞中分离该载体。

实施例10是一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含如实施例7所述的载体。

实施例11是一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例10所述的免疫原性组合物。

实施例12是一种腺病毒载体，该腺病毒载体包含(a)至少一个转基因；以及(b)编码六邻体多肽的核酸序列，该六邻体多肽包括具有seqidno:1的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。

实施例13是如实施例12所述的腺病毒载体，其中该六邻体多肽包含bz1六邻体多肽的氨基酸序列(seqidno:2)。

实施例14是如实施例12或13所述的腺病毒载体，该腺病毒载体进一步包含编码纤维多肽的核酸序列。

实施例15是如实施例14所述的腺病毒载体，其中该纤维多肽包含选自bz1纤维多肽(seqidno:4)或bz28纤维多肽(seqidno:3)的氨基酸序列。

实施例16是一种腺病毒载体，该腺病毒载体包含(a)至少一个转基因；以及(b)编码纤维多肽的核酸序列，该纤维多肽包含bz28纤维多肽的氨基酸序列(seqidno:3)。

实施例17是一种腺病毒载体，该腺病毒载体包含(a)至少一个转基因；(b)编码六邻体多肽的核酸序列，该六邻体多肽包含选自bz1六邻体多肽(seqidno:2)或bz28六邻体多肽(seqidno:5)的氨基酸序列；以及(c)编码纤维多肽的核酸序列，该纤维多肽包含选自bz1纤维多肽(seqidno:4)或bz28纤维多肽(seqidno:3)的氨基酸序列。

实施例18是如实施例12-17中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体进一步包含e1缺失。

实施例19是如实施例12-18中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体进一步包含e3缺失。

实施例20是如实施例12-19中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体是包含一个或多个人腺病毒核酸序列的嵌合腺病毒载体。

实施例21是如实施例20所述的腺病毒载体，其中该人腺病毒核酸序列来自人腺病毒-4、人腺病毒-5、人腺病毒-26或人腺病毒-35。

实施例22是如实施例21所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含人腺病毒-5(hadv-5)e4orf6。

实施例23是如实施例12-22中任一项所述的腺病毒载体，其中该转基因与反向末端重复序列(itr)相邻。

实施例24是如实施例23所述的腺病毒载体，其中转基因位于e1缺失处或附近、e3缺失处或附近和/或itr附近。

实施例25是如实施例12-24中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含选自seqidno:9或seqidno:10的核酸序列。

实施例26是一种疫苗，该疫苗包含如实施例12-25中任一项所述的腺病毒载体和药学上可接受的载剂。

实施例27是一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例26所述的疫苗。

实施例28是一种生产疫苗的方法，该方法包括将如实施例12-25中任一项所述的腺病毒载体与药学上可接受的载剂组合。

实施例29是一种分离的六邻体多肽，该分离的六邻体多肽包括具有seqidno:1的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。

实施例30是如实施例29所述的分离的六邻体多肽，其中该六邻体多肽包含bz1六邻体多肽的氨基酸序列(seqidno:2)。

实施例31是一种分离的纤维多肽，其中该纤维多肽包含bz28纤维多肽的氨基酸序列(seqidno:3)。

实例

实例1：基于新型腺病毒分离株bz1的骨架并包含新型腺病毒分离株bz28的纤维序列的e1和e3缺失型载体的生成

鉴定了新的大猩猩腺病毒分离株bz1(也称为jad4-wt)，并对其基因组进行了完整测序。还鉴定了新的黑猩猩分离株bz28(也称为jad5-wt)，并对其纤维基因及其一部分六邻体基因进行了测序。发现新的腺病毒分离株bz1和bz28均在系统发育上属于人腺病毒c种(hadv-c)。确定bz1的全基因组核苷酸序列为seqidno:6。确定bz28的纤维和(部分)六邻体核苷酸序列分别为seqidno:3和seqidno:5。

用于生成基于bz1/bz28的腺病毒载体的单质粒系统的描述

pbz1_bz28f(seqidno:9；图4)和pbz1_bz28f.5ixp(seqidno:10；图5)是各自携带全长、e1和e3缺失型基于bz1分离株的腺病毒载体基因组的质粒，其中纤维编码序列被bz28分离株的序列替换。这些质粒中包含的基于bz1/bz28的腺病毒载体基因组序列分别在seqidno:11和seqidno:12中列出。在这些质粒的每一个中，腺病毒载体基因组的侧翼是两个swai限制性酶切位点(即一个swai位点位于载体基因组的任一端)。这些swai位点是为了在病毒拯救之前通过转染合适的e1补充细胞(例如hek293、911和per.c6细胞)来促进从质粒骨架上切除腺病毒载体基因组。这些质粒所包含的腺病毒载体基因组进一步携带某些限制性酶切位点，这些限制性酶切位点在e1缺失的位置中以及在右反向末端重复序列(ritr)附近被引入。在完整的腺病毒基因组质粒的情况下，将这些限制性酶切位点选择为独特的。它们代表“转基因插入位点”，这些位点允许通过标准分子克隆技术容易地构建携带一个或多个转基因表达盒的腺病毒载体，该一个或多个转基因表达盒插入在所述相应位置中的任一个处或其任何组合中。腺病毒载体设计和质粒构建在以下章节中更详细地描述。

基于bz1/bz28的腺病毒载体基因组设计

bz1/bz28和bz1/bz28.5ixp腺病毒载体基因组(即，分别为seqidno:11和seqid:12)各自设计为包含e1缺失、e3缺失、不同的转基因插入位点以及天然e4开放阅读框(orf)6和orf6/7被人腺病毒-5(hadv-5)的开放阅读框替换。使每种腺病毒的e1区域缺失，并用包含asisi限制性酶切位点序列的转基因插入位点替换。通过在每个腺病毒的反向末端重复序列(itr)附近插入paci限制性酶切位点序列，产生另一个转基因插入位点。腺病毒载体基因组进一步包含(bz1)e4orf6和orf6/7编码区序列被人腺病毒-5(hadv-5)的相应序列替换。seqidno:7所示的hadv-5替换序列由genbank序列ac_000008的核苷酸32914-34077组成。

设计和构建了两种类型的e1区域缺失。pbz1_bz28f所包含的基于bz1/bz28的腺病毒载体基因组携带对应于seqidno:6的核苷酸491至3324的移除的e1区域缺失。相比之下，pbz1_bz28f.5ixp所包含的基于bz1/bz28的腺病毒载体基因组携带较大的包含e1区域的序列缺失，从而移除了bz1的所有e1编码序列(即，seqidno:6的核苷酸491至3484)。此外，该后一个腺病毒载体基因组还被设计成携带e1b55k与pix编码序列之间的非编码序列段被hadv-5的非编码序列段替换(即，对应于seqidno:6的核苷酸3485至3574的序列被genbankac_000008的核苷酸3510至3608替换(即，被seqidno:8替换))。

包含基于bz1/bz28的腺病毒载体基因组的单质粒的构建

通过若干基因合成步骤(由金斯瑞公司执行)和标准分子克隆程序构建了pbz1_bz28f(seqidno:9)。首先，进行几个连续的基因合成和亚克隆步骤，它们一起导致pbr322(genbank登录号-j01749.1)的2.3-kbpecori-ndei片段被8.1-kbp的合成核苷酸序列替换，该合成核苷酸序列包含swai限制性位点侧接序列，该侧接序列包含设计的bz1/bz28腺病毒载体基因组的左端部分和右端部分，其中所述左端部分包含上述e1缺失，并且所述右端部分包含上述e3缺失、bz28纤维替换、hadv-5e4orf6和orf6/7替换、以及与ritr相邻的paci限制性位点插入(在右端部分内)。所得质粒即bz1/bz28中间质粒1的核苷酸序列在seqidno:13中列出。其次，将bz1病毒基因组的12.3-kbpnhei-asci限制性片段(seqidno:6)连接到nhei和asci消化的bz1/bz28中间质粒1中，从而产生bz1/bz28中间质粒2。第三，将bz1病毒基因组的11.8-kbpndei-hpai限制性片段连接到ndei和hpai消化的bz1/bz28中间质粒2中，从而产生bz1/bz28中间质粒3。第四，将bz1病毒基因组的3.3-kbpndei-ndei限制性片段连接到ndei消化的bz1/bz28中间质粒3中，从而产生最终的质粒pbz1_bz28f(seqidno:9)。

pbz1_bz28f.5ixp(seqidno:10)通过以下标准基因合成和分子克隆程序构建。首先，合成由修饰的bz1/bz28载体基因组片段组成的2927bpdna片段(seqidno:14)，该载体基因组片段包含hadv-5的某些pix启动子序列(即，seqidno:8所示的那些)，并作为asisi-sali限制性片段连接到asisi和sali消化的bz1/bz28中间质粒2中，从而产生bz1/bz28.5ixp中间质粒1。第二，将bz1病毒基因组的15.2-kbpsali-sali限制性片段(seqidno:6)连接到sali消化的bz1/bz28.5ixp中间质粒1中，从而产生bz1/bz28.5ixp中间质粒2。第三，将bz1病毒基因组的10.0-kbpclai-spei限制性片段连接到clai和spei消化的bz1.bz28.5ixp中间质粒2中，从而产生最终的质粒pbz1_bz28f.5ixp(seqidno:10)。

pbz1_bz28f.fluc(seqidno:15)和pbz1_bz28f.rsvf-2a-gluc(seqidno:16)是pbz1_bz28f衍生的质粒，它们各自带有基于bz1/bz28的腺病毒载体基因组，该腺病毒载体基因组装备有在e1缺失位置插入的转基因表达盒。这些质粒内携带的腺病毒载体基因组序列分别在seqidno:17和seqidno:18中列出。pbz1_bz28f.fluc携带萤火虫萤光素酶(fluc)的转基因表达盒。该盒由巨细胞病毒主要立即早期启动子(即“cmv启动子”)驱动，并含有sv40衍生的聚腺苷酸化信号。pbz1_bz28f.rsvf-2a-gluc携带“rsv-fa2-2a-gluc”的转基因表达盒(rsvf-2a-gluc)，它是由呼吸道合胞病毒株a2融合糖蛋白、口蹄疫病毒2a肽和高斯(gaussia)萤光素酶(gluc)构成的嵌合蛋白。像fluc盒一样，该盒也由cmv启动子驱动，并携带sv40聚腺苷酸化信号。另外，该盒在其5’非翻译区中包含含有人载脂蛋白a1基因的内含子2的序列。将fluc和rsvf-2a-gluc表达盒各自通过若干标准基因合成和分子克隆步骤构建，然后将它们连接到pbz1_bz28f的独特asisi限制性酶切位点中，从而分别生成pbz1_bz28f.fluc和pbz1_bz28f.rsvf-2a-gluc。

基于bz1/bz28的腺病毒载体的生成和生产

通过将相应的腺病毒载体基因组质粒(即，pbz1_bz28f.fluc和pbz1_bz28f.rsvf-2a-gluc)转染到补充e1的per.c6细胞中，生成了分别包含腺病毒载体基因组序列seqidno:17和seqidno:18的腺病毒载体bz1/bz28.fluc(也称为jad4c5nvt003)和bz1/bz28.rsvf-2a-gluc(也称为jad4c5nvt001)。在转染到per.c6细胞(这些细胞在补充了10％胎牛血清(fbs)和10mmmgcl2的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(dmem)中作为贴壁细胞培养物生长)中之前，用swai消化腺病毒载体基因组质粒以从质粒释放相应的腺病毒载体基因组。使用lipofectamine转染试剂(加利福利亚州卡尔斯巴德的英杰公司(invitrogen；carlsbad,ca))，根据标准程序进行转染。在收获病毒拯救转染后，通过在per.c6细胞培养物上的连续几轮感染而进一步扩增病毒。如前所述(havenga等人,“novelreplication-incompetentadenoviralb-groupvectors:highvectorstabilityandyieldinper.c6cells[新的无复制能力的腺病毒b组载体：在per.c6细胞中的高载体稳定性和产率]”j.gen.virol.[普通病毒学杂志]87(8):2135-43(2006))，使用两步氯化铯(cscl)密度梯度超速离心程序从粗病毒收获物中纯化病毒。病毒颗粒(vp)滴度通过先前描述的基于分光光度法的程序进行测量(maizel等人,“thepolypeptidesofadenovirus:i.evidenceformultipleproteincomponentsinthevirionandacomparisonoftypes2,7a,and12,”[腺病毒的多肽：i.病毒体中多种蛋白组分的证据以及2、7a和12型的比较]virology[病毒学],36(1):115-25(1968))。

实例2：由bz1/bz28.fluc诱导的细胞和体液免疫应答

使用萤火虫萤光素酶(fluc)作为载体编码的(模型)疫苗抗原，评估了新型腺病毒载体bz1/bz28的细胞和体液免疫原性。用ad26.fluc(阳性对照)或bz1/bz28.fluc(均以每只小鼠10⁹和10¹⁰个病毒颗粒)或用不编码转基因的阴性对照载体(空ad26，每只小鼠10¹⁰个病毒颗粒)对balb/c小鼠进行肌内免疫。在两周后处死小鼠并收集血样和脾细胞(图1a)。

通过fluc特异性elispot试验评估了针对载体编码的抗原的细胞免疫诱导。为此，将分离的脾细胞用跨越fluc蛋白的15mer重叠肽刺激过夜，并通过离体elispot试验测定细胞免疫应答，该试验测量ifn-γ分泌细胞的相对数量(图1b)。结果表明，在较高剂量免疫(10¹⁰)下，由bz1/bz28诱导的细胞免疫应答大约与ad26.fluc所见的应答一样高。相比之下，在较低剂量免疫(10⁹)下，bz1/bz28.fluc比ad26.fluc产生了强得多的应答。

bz1/bz28诱导针对其编码的抗原的体液免疫的能力通过测量针对fluc所产生的抗体来评估。在fluc特异性igg抗体elisa中测试来自免疫小鼠的血清(在2周时收集)。图1c显示，在每只小鼠10¹⁰vp下，表达萤火虫萤光素酶的bz1/bz28载体引发的终点滴度高于ad26.fluc基准。正如预期的那样，在用不编码萤火虫萤光素酶的空载体免疫的小鼠血清中未检测到fluc特异性抗体滴度。

总体而言，数据显示bz1/bz28载体可诱导针对载体编码的抗原的强有力的细胞和体液免疫应答，其大小高于基于hadv-26的基准载体所诱导的应答。这些免疫应答清楚地表明了bz1/bz28载体在小鼠中的强有力的免疫原性。

实例3：对新型和现有腺病毒载体之间的血清交叉中和的评估

由于它们作为新腺病毒疫苗载体的潜在用途，本文产生的新型bz1/bz28腺病毒载体优选地在血清学上不同于目前已经开发作为疫苗载体(诸如基于人腺病毒血清型hadv-5和hadv-35的载体)的现有腺病毒载体。因此，在新型bz1/bz28腺病毒载体以及基于hadv-4、hadv-5、hadv-26和hadv-35的几种现有载体之间进行了交叉中和测试。为此，在腺病毒中和试验中，针对每种不同的载体测试小鼠抗血清，每种抗血清针对这些腺病毒载体之一而产生。在将balb/c小鼠用每只小鼠10¹⁰个载体颗粒免疫后两周或八周时，从这些小鼠收集用于该试验的小鼠抗血清。如先前所述(spangers等人2003.j.clin.microbiol.[临床微生物学杂志]41:5046-5052)进行腺病毒中和试验。简而言之，从1:16稀释开始，将血清进行2倍系列稀释，然后与表达萤火虫萤光素酶(fluc)的腺病毒载体预混合，然后与a549细胞温育过夜(以每个细胞500个病毒颗粒的感染复数)。感染后24小时测得的被感染细胞裂解物中的萤光素酶活性水平代表载体感染效率。针对给定载体的中和滴度定义为能够使载体感染效率降低90％的最高血清稀释度。中和滴度可任意分为以下几类：<16(无中和)、16至200、200至2,000和>2,000。

结果表明，所测试的载体之间没有交叉中和作用(图2)。bz1/bz28显示出同源中和抗体应答，但未显示出与测试组中包括的人腺病毒载体即ad26、ad35、ad5和ad4的交叉中和。因此，该新腺病毒载体bz1/bz28可以潜在地与一种或多种这些或其他不同的腺病毒载体联合用于顺序免疫，例如在异源初免-加强疫苗接种方案的情况下，或者，可替代地或另外地，在一系列针对不同疾病或抗原的两个或更多个连续疫苗接种方案的情况下。

实例4：新型腺病毒载体的人血清阳性率

对于它们作为有效疫苗载体的潜在用途而言重要的是，本文所述的新型腺病毒载体不受疫苗目标群体中高水平的预先存在的抗载体体液免疫的妨碍。因此，在200个来自成年人的人群血清样品中评价了bz1/bz28载体的血清阳性率，这些成年人年龄为18-55岁，生活在美国(us)和欧盟(eu)。通过如先前所述的(sprangers等人2003.j.clin.microbiol.[临床微生物学杂志]41:5046-5052)标准腺病毒中和试验，测试了载体被人血清样品中和的情况。简而言之，从1:16稀释开始，将血清进行2倍系列稀释，然后与表达萤火虫萤光素酶(fluc)的腺病毒载体预混合，然后与a549细胞温育过夜(以每个细胞500个病毒颗粒的感染复数)。感染后24小时测得的被感染细胞裂解物中的萤光素酶活性水平代表载体感染效率。针对给定载体的中和滴度定义为能够使载体感染效率降低90％的最高血清稀释度。中和滴度可任意分为以下几类：<16(无中和)、16至300、300至1000、1000至4000和>4000。结果表明bz1/bz28在所研究的人类受试者中的血清阳性率与ad5相似(图3)。但是，与ad5相比，针对新型bz1/bz28载体所见的阳性中和滴度通常很低。例如，在所有测试的血清中，超过25％显示出>1000的ad5中和滴度，而只有约3％具有该水平的bz1/bz28中和滴度。

总体而言，上述数据表明，就预先存在的载体中和滴度水平而言，在所评估的疫苗目标群体中，可以认为针对bz1/bz28载体的预先存在的体液抗载体免疫相对较低，这表明这些载体在这些群体中具有作为有效疫苗载体的潜力。

实例5：在悬浮per.c6细胞中的腺病毒载体生产率

用于临床试验及其他方面的腺病毒载体需要在可扩展的无血清腺病毒生产平台中容易地生产至高滴度。悬浮-适应的per.细胞(本文也称为悬浮per.c6细胞或sper.c6)代表了这样的平台，因为它们已经显示出支持在生物反应器中大规模生产腺病毒载体，获得大量高滴度的临床级载体制备物，例如基于hadv-26或hadv-35的e1缺失型载体的制备物(ep2536829b1、ep2350268b1)。

作为关于本文所述的新型载体是否适合基于sper.c6细胞的生产工艺的初步评估，对在摇瓶中培养的sper.c6细胞进行了小规模载体生产率实验。这些生产率实验使用实例1中所述的新型腺病毒载体bz1/bz28的fluc编码形式进行。基于hadv-26的载体ad26.fluc用作基准对照。将以1×106个细胞/ml的密度接种在摇瓶中的总体积为10ml的补充了4mml-谷氨酰胺(龙沙集团(lonza))的培养基(可从龙沙集团获得)中的悬浮per.c6细胞培养物用不同的载体以不同的病毒颗粒(vp)-细胞比感染，然后温育4天。用于感染的不同vp-细胞比是70、150和900。每天采集被感染的细胞培养物的样品，并通过基于定量pcr(qpcr)的方案测定这些样品中的vp滴度，该方案采用对cmv启动子(其存在于所有测试的载体中)特异的引物和探针。该方案需要在qpcr之前对测试样品进行dna酶处理，以除去任何游离的载体dna(即未包装到病毒颗粒中的载体基因组)。

新型载体bz1/bz28.fluc所得的生产率结果如图6所示。在所测试的所有vp-细胞感染比和收获时间点下，bz1/bz28.fluc显示出比基准对照载体ad26.fluc更高的vp滴度。这些结果证明了新型bz1/bz28载体在基于sper.c6的无血清悬浮细胞培养模型上的良好生产率。

总之，如上所述，对由本发明的新型重组基于bz1/bz28的腺病毒载体诱导的体液和细胞免疫应答进行的研究清楚地表明这些载体在小鼠中的强有力的免疫原性。另外，这些载体证实不诱导针对某些现有腺病毒疫苗载体候选物(例如ad26、ad35和ad5)的交叉中和抗体应答，反之亦然。此外，当与ad5相比时，新载体在人体中显示出相对较低的预先存在的载体中和滴度水平。最后，这些新载体可以容易地以高产率产生。低血清阳性率、强有力的免疫原性和可生产性的组合表明本发明的新型腺病毒载体可用作针对多种病原体的新型疫苗载体候选物，并且可另外用于基因疗法和/或诊断。

本领域技术人员将理解，在不偏离本发明的广泛发明构思的情况下，可以对上述实施例进行改变。因此，应当理解，本发明不限于所披露的特定实施例，而是旨在涵盖由本说明书限定的本发明的精神和范围内的修改。

序列表

<110>扬森疫苗与预防公司

<120>腺病毒及其用途

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