用于选择性扩增核酸的寡核苷酸的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年10月20日提交的美国临时申请第62/575,051号的权益，所述申请以引用的方式并入。

本发明大体上涉及用于对核酸进行选择性扩增和计数的方法和组合物。

背景技术：

许多最常见疾病都存在基因基础。早期检测为治疗成功的关键因素。基因生物标记促进早期检测。技术和临床研究方面的进步已使得各种类型的rna分子(包括mrna和mirna)作为疾病的生物标记而越来越有吸引力。此外，与蛋白质生物标记相比，rna生物标记可以提供更好的灵敏度和特异性并且分析起来相对便宜。

用于分析rna的现有方法具有若干缺点。举例来说，测序mirna的方法涉及使用rna连接酶将已知序列连接到rna分子的末端，但连接反应的效率通常较差且取决于给定mirna末端的序列而变化。mrna可以通过全转录组鸟枪法测序(wholetranscriptomeshotgunsequencing)来测序，但所述方法产生来自所有转录物的序列信息，而不仅仅是诊断相关序列。因为给定疾病的靶点生物标记通常表示一小组mrna群，所以要花费不成比例的分析时间量来舍弃不相关mrna。mrna群还可以通过与微阵列杂交来分析，但所述方法具有有限的灵敏度和吞吐量。另外，微阵列的形成是劳动密集型的，并且一旦制成就无法轻易地进行调适，因此其并不非常适合于诊断具有不同组的生物标记mrna的多种疾病。另一方面，更灵敏且相对便宜的定量pcr(qpcr)具有同时分析多个mrna生物标记的有限能力。因此，甚至一小组mrna生物标记的分析也需要并行地进行多个qpcr反应，使得其对于大多数诊断来说并不可行。归因于现有rna分析方法的技术、物流和财务障碍，本可以在早期检测到的基因疾病未被诊断，并且如心脏病、癌症和呼吸道疾病的病况每年继续使数百万人丧生和丧失能力。

技术实现要素：

本发明提供用于从核酸分子(如mirna或mrna)的混合物扩增仅含有所关注序列的那些分子的组合物和方法。本发明的方法选择性地保护靶点诊断序列，同时允许非靶点序列降解。在一个方面，本发明的方法部分地依赖于将dc转化成du并随后使含有的du序列降解和/或使含有du的序列不能充当dna聚合酶的模板。举例来说，含有所关注的rna的样品暴露于包含与靶点rna互补的序列和用作模板依赖性碱基延伸的引发位点的部分的构建体。此杂交混合物接着用亚硫酸氢盐处理，所述亚硫酸氢盐将未配对胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶。接着，通过例如使用通用引物的pcr扩增不含尿嘧啶的寡核苷酸以由配对寡核苷酸产生dna分子集合。因此，扩增dna分子的集合仅包括含有在寡核苷酸的汇集中展现并且存在于起始rna分子群中的序列的dna分子。通过对扩增dna分子集合中的物种计数，可以确定起始群中所关注的不同rna物种的数目和相对丰度。本发明还提供用于进行此类方法的寡核苷酸。

在另一实例中，使用具有与靶点rna序列杂交的中心区的模板。中心区在任一端上藉由3'和5'区定界。3'区可为任何适当长度，但优选地包含至少约10个碱基。3'区可以含有所有四个沃森-克里克碱基(watson-crickbase)的混合物或可缺乏胞嘧啶。5'区通常长于3'区但应为至少约10个碱基(因此可与3'区长度相同)。在其中使用多个模板的优选实施例中，所有3'区共有共同序列。5'区还可由所有四个沃森-克里克碱基构成，但必须含有胞嘧啶。靶点rna粘合于模板的中心区，dna聚合酶用于使用5'区作为模板进行模板依赖性碱基延伸。在延伸之后，用亚硫酸氢钠或等效处理(如胞嘧啶脱氨酶)处理样品以将dc残基转化成du。将所暴露的dc残基转化成du，但保护呈双链(即，归因于碱基延伸)的那些残基。未经粘合和延伸的rna经酶降解或不能够在后续pcr中扩增。仅将保留且随后分析经保护的模板。

作为替代方案，本发明涵盖使用具有靶点特异性环区和通用(即，共同)茎序列的茎-环结构，所述茎序列含有用于pcr的通用引发位点和茎的互补(双链)部分中的限制位点。茎-环构建体粘合于靶点并且暴露于限制酶，所述限制酶攻击茎的互补部分中的共同限制位点。限制酶从任何未配对的茎-环结构去除引发位点。在靶点存在下，茎-环探针受限制酶的保护并且因此可以扩增。因此，所关注的靶点受到保护且经选择性地扩增且从样品拉出。

因为本发明的组合物和方法允许所关注的核酸选择性扩增，所以其适用于诊断与基因改变相关的疾病(如心脏病、癌症和呼吸道疾病)。所要求的方法通过消除对不相关信息筛查的需要而加快诊断筛选。本发明的方法的另一优点为使用通用pcr引物扩增不同rna物种允许在相同反应中扩增大量rna物种。因此，可以在单一分析中分析给定疾病的整个生物标记组。另外，起始群中的不同rna物种以非偏置、序列非依赖性的方式展现于dna分子的扩增集合中，这允许所述方法检测一组生物标记内的不同rna分子的数目和丰度方面的较小差异。

在一方面，本发明提供识别核酸分子的混合物中的靶点的方法，所述方法包括以下步骤：提供核酸分子的混合物；向混合物中添加非天然存在的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括含有至少一个胞嘧啶的5'区、与靶点的一部分互补的中心区和3'区，使得寡核苷酸粘合于靶点；将混合物中的未配对胞嘧啶转化成尿嘧啶；并且检测寡核苷酸，由此识别混合物中的靶点。所述方法可以包括使用寡核苷酸的5'区作为模板延伸粘合靶点的3'端。

混合物中的核酸可以是单链或双链的。如果混合物的核酸以双链形式提供，那么本发明的方法可以包括变性步骤。

用于本发明的构建体可以是dna、rna或含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的混合核酸。对于dna寡核苷酸，3'区可以含有天然存在于dna中的四种碱基，即腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶，或3'区可以不含胞嘧啶和/或可以仅含有腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。

靶点核酸分子可以是dna、rna或含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的混合核酸。rna分子可以是mrna、mirna、pirna、sirna、shrna、trna、rrna、snrna或snorna。

检测包括扩增不含尿嘧啶的核酸分子，例如dna或rna。核酸分子可以通过pcr扩增。pcr引物可以含有与寡核苷酸的5'区和3'区中的序列相同或互补的序列。检测可以包括使含有尿嘧啶的核酸分子(例如dna或rna)降解。降解可以包括用尿嘧啶-dna糖基化酶、dna核酸外切酶、dnaap裂解酶、热或碱性条件处理混合物。

在另一方面，本发明提供识别核酸分子的混合物中的靶点的方法，所述方法包括以下步骤：提供核酸分子的混合物；向混合物中添加非天然存在的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括不含胞嘧啶的5'区、含有一个或多个胞嘧啶且与靶点的一部分互补的中心区和不含胞嘧啶的3'区，使得所述寡核苷酸粘合于靶点，由此在寡核苷酸的中心区中的一个或多个胞嘧啶与靶点中的一个或多个鸟嘌呤之间形成一个或多个碱基对；将混合物中的未配对胞嘧啶转化成尿嘧啶；并且检测寡核苷酸，由此识别混合物中的靶点。

在另一方面，本发明提供用于从核酸分子的混合物识别靶点的非天然存在的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括含有至少一个胞嘧啶的5'区、与靶点核酸分子的一部分互补的中心区和3'区。

在另一方面，本发明提供用于从核酸分子的混合物识别靶点的非天然存在的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括不含胞嘧啶的5'区、含有至少一个胞嘧啶且与靶点核酸分子的一部分互补的中心区和不含胞嘧啶的3'区。

在另一方面，本发明提供由rna分子的混合物制成靶点库的方法，所述方法包括以下步骤：提供rna分子的混合物；向所述混合物添加多个非天然存在的寡核苷酸，每一寡核苷酸含有：含有一个或多个胞嘧啶的共同5'区、与靶点的一部分互补的中心区和共同3'区，使得寡核苷酸中的一个或多个与靶点粘合；将混合物中的未配对胞嘧啶转化成尿嘧啶；并且选择不含尿嘧啶的寡核苷酸以用于制成核酸库。

在另一方面，本发明提供由rna分子的混合物制成靶点库的方法，所述方法包括以下步骤：提供rna分子的混合物；向混合物中添加多个非天然存在的寡核苷酸，每一寡核苷酸含有不含胞嘧啶的共同5'区、含有一个或多个胞嘧啶且与靶点的一部分互补的中心区和不含胞嘧啶的共同3'区，使得一个或多个寡核苷酸与靶点粘合，由此在所述寡核苷酸的中心区中的一个或多个胞嘧啶与靶点中的一个或多个鸟嘌呤之间形成碱基对；将混合物中的未配对胞嘧啶转化成尿嘧啶；并且选择不含尿嘧啶的寡核苷酸以用于制成核酸库。优选地，通过将亚硫酸氢根离子添加到混合物而将未配对胞嘧啶转化成尿嘧啶。

在另一方面，本发明提供用于由rna分子的混合物制成靶点库的非天然存在的寡核苷酸的汇集，每一寡核苷酸包括含有至少一个胞嘧啶的共同5'区、与靶点的一部分互补的中心区和共同3'区。

在另一方面，本发明提供用于由rna分子的混合物制成靶点库的非天然存在的寡核苷酸的汇集，每一寡核苷酸包括不含胞嘧啶的共同5'区、含有至少一个胞嘧啶且与靶点的一部分互补的中心区和不含胞嘧啶的共同3'区。

下文在其具体实施方式中提供本发明的其它方面和优点。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施例的非天然寡核苷酸的示意图。

图2为根据本发明的一个实施例的非天然寡核苷酸的示意图。

图3说明根据本发明的一个实施例，使用寡核苷酸来识别核酸的混合物中的靶点的方法。

图4说明根据本发明的一个实施例，使用寡核苷酸来识别核酸的混合物中的靶点的方法。

图5说明本发明的一个实施例，其中茎-环结构与限制酶结合使用以选择性地保护靶点序列。

具体实施方式

本发明提供用于从核酸分子的混合物选择性扩增一个或多个靶点的方法和组合物。举例来说，rna可从生物样品选择性扩增。本文所提供的方法和组合物允许同时从核酸混合物扩增多个物种，从而避免了对分析一组靶点进行多个并行扩增步骤的需要。另外，经扩增材料仅包括所关注的分子，其通常包含存在于起始材料中的一小组分子。因此，所述方法和组合物通过消除检查大量的未提供信息的物种的需要而简化下游分析。

本发明的组合物包括允许从单链核酸分子的混合物选择性扩增靶点的寡核苷酸。寡核苷酸含有策略性定位的胞嘧啶碱基，当寡核苷酸粘合于其靶点时，所述胞嘧啶碱基与互补鸟嘌呤碱基配对。然而，当寡核苷酸与偏离靶点物种不完全地匹配或根本不与核酸杂交时，此类胞嘧啶中的一个或多个保持不配对。在使寡核苷酸与混合物中的核酸杂交之后，处理混合物以将未配对的胞嘧啶转化成尿嘧啶，但使配对的胞嘧啶保持完整。这可以用亚硫酸氢根离子或用胞嘧啶脱氨酶实现。不含尿嘧啶的寡核苷酸接着通过聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)扩增以获得不含不相关物种的靶点的汇集。

图1为根据本发明的一个实施例的非天然寡核苷酸101的示意图。寡核苷酸101包括含有至少一个胞嘧啶的5'区103、与靶点核酸分子的一部分互补的中心区105和3'区107。寡核苷酸101可以是dna、rna或含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的混合核酸。优选地，寡核苷酸101为dna。

寡核苷酸101的5'区103的长度可为10-20个核苷酸或更长。举例来说但不限于，5'区103可以含有至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸或至少40个核苷酸。5'区105含有至少一个胞嘧啶，且其可以含有至少2个胞嘧啶、至少3个胞嘧啶、至少4个胞嘧啶、至少5个胞嘧啶或至少6个胞嘧啶。

寡核苷酸101的3'区107的长度可以短到10-15个核苷酸。举例来说但不限于，3'区107可以含有至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸或至少40个核苷酸。对于dna寡核苷酸，3'区107可以含有天然存在于dna中的四种碱基，即腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶，或其可以仅含有腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。

寡核苷酸101的中心区105与靶点核酸分子的一部分互补。互补性是指核酸的单链以反向平行方式与核酸的另一链形成碱基对的能力。一般来说，碱基对形成于腺嘌呤与胸腺嘧啶之间、腺嘌呤与尿嘧啶之间以及胞嘧啶与鸟嘌呤之间。然而，腺嘌呤可以与鸟嘌呤形成碱基对，并且中心区可以含有一个或多个与靶点的互补区中的鸟嘌呤形成碱基对的腺嘌呤。

中心区105可以含有不含胞嘧啶的一个或多个部分。不含胞嘧啶部分可以在中心区105的5'部分或中心区105的3'部分处。不含胞嘧啶部分可以含有10个或更少核苷酸、9个或更少核苷酸、8个或更少核苷酸、7个或更少核苷酸、6个或更少核苷酸、5个或更少核苷酸、4个或更少核苷酸、3个或更少核苷酸或2个或更少核苷酸。中心区105的不含胞嘧啶部分可以含有一个或多个腺嘌呤，其在靶点的互补区中形成与鸟嘌呤的碱基对。

图2为根据本发明的一个实施例的非天然寡核苷酸201的示意图。寡核苷酸201包括不含胞嘧啶的5'区203、含有至少一个胞嘧啶且与靶点核酸分子的一部分互补的中心区205和不含胞嘧啶的3'区207。寡核苷酸201可以是dna、rna或含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的混合核酸。优选地，寡核苷酸201为dna。

寡核苷酸201的5'区203的长度可以短到10-15个核苷酸。举例来说但不限于，5'区203可以含有至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸或至少40个核苷酸。对于dna寡核苷酸，5'区203可以含有腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶的任何序列或组合。

寡核苷酸201的3'区207的长度可以短到10-15个核苷酸。举例来说但不限于，3'区207可以含有至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸或至少40个核苷酸。

寡核苷酸201的中心区205含有至少一个胞嘧啶，并且其可以含有至少2个胞嘧啶、至少3个胞嘧啶、至少4个胞嘧啶、至少5个胞嘧啶或至少6个胞嘧啶。然而，中心区205可以含有不含胞嘧啶的一个或多个部分。不含胞嘧啶部分可在中心区205的5'部分或中心区205的3'部分处。不含胞嘧啶部分可以含有10个或更少核苷酸、9个或更少核苷酸、8个或更少核苷酸、7个或更少核苷酸、6个或更少核苷酸、5个或更少核苷酸、4个或更少核苷酸、3个或更少核苷酸或2个或更少核苷酸。中心区205的不含胞嘧啶部分可以含有一个或多个腺嘌呤，其在靶点的互补区中形成与鸟嘌呤的碱基对。

在另一方面，本发明提供使用上文所描述的寡核苷酸来识别核酸分子的混合物中的靶点的方法。

图3说明根据本发明的一个实施例，使用寡核苷酸来识别核酸的混合物中的靶点的方法301。在此实施例中，寡核苷酸包括上文针对寡核苷酸101所描述的特征。方法301尤其可用于识别mirna的混合物中的靶点。

在第一步骤303中，将寡核苷酸添加到单链核酸的混合物并且使其粘合于混合物中的核酸。基于寡核苷酸的中心区与靶点313的一部分之间的互补性，寡核苷酸的拷贝311a与靶点313核酸杂交。由于寡核苷酸与偏离靶点315核酸之间的部分互补性，寡核苷酸的拷贝311b与偏离靶点315核酸部分地杂交。寡核苷酸的拷贝311c未能与混合物中的核酸杂交。

单链核酸可以是dna、rna或含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的混合核酸。核酸可以双链分子形式提供并且然后变性。因此，在一些实施例中，所述方法包括变性步骤。可以通过加热、改变ph或所属领域中已知的任何其它方式来实现变性。在核酸为rna的实施例中，rna可以是一定rna类型或子类别。举例来说但不限于，rna可以是mrna、mirna、pirna、sirna、shrna、trna、rrna、snrna或snorna。

所述方法可以包括延伸步骤305，其中使用寡核苷酸的粘合拷贝311a的5'区作为模板来延伸靶点313核酸的3'端。可以使用任何适合的rna聚合酶或dna聚合酶进行延伸305。偏离靶点核酸315的3'端由于寡核苷酸的粘合拷贝311b与偏离靶点315核酸之间的不完全互补性而不延伸。

在另一步骤307中，将寡核苷酸中的未配对胞嘧啶转化成尿嘧啶。优选地，通过将亚硫酸氢根离子添加到混合物中来实现转化307，这引起胞嘧啶脱氨基。可以钠离子、锂离子、钾离子、铵离子、四烷基铵离子、镁离子、锰离子或钙离子的一种或多种盐形式提供亚硫酸氢根离子。亚硫酸氢盐可以固体、溶液、凝胶或所属领域中已知的任何其它形式提供。

如上文关于寡核苷酸101所描述，寡核苷酸的5'区包括一个或多个胞嘧啶，并且寡核苷酸的中心区可以包括一个或多个胞嘧啶。粘合于靶点313核酸的寡核苷酸的拷贝311a中的胞嘧啶经碱基配对且因此受保护以免亚硫酸氢盐脱氨基。然而，结合于偏离靶点核酸的寡核苷酸的拷贝311b的5'区中的一个或多个胞嘧啶暴露于亚硫酸氢盐且因此经脱氨基；可存在于寡核苷酸的拷贝311b的中心区中的未配对胞嘧啶也经脱氨基。类似地，不与核酸杂交的寡核苷酸的拷贝311c中的胞嘧啶也经脱氨基。

稳定双链双螺旋体的形成有助于保护胞嘧啶免于氧化。可从双螺旋体的熔融温度推断的双链核酸双螺旋体的稳定性很大程度上取决于互补区的长度。举例来说，mirna通常含有约22个核苷酸，并且甚至具有与其靶点完全互补的中心区的寡核苷酸具有相对较低的熔融温度。然而，通过使用具有20个核苷酸的5'区的寡核苷酸，双链互补性的长度在延伸步骤305之后几乎加倍，这提高双螺旋体的熔融温度并且提供对碱基配对胞嘧啶的更好保护。因此，对于检测小核酸(如mirna)，宜包括延伸步骤305并且使用具有相对较长5'区的寡核苷酸，例如包括20个或更多个核苷酸的5'区。

在另一步骤309中，通过pcr选择性扩增与靶点313核酸杂交的寡核苷酸的拷贝311a。第一pcr引物317与寡核苷酸的3'区中的序列互补，并且第二pcr引物319与寡核苷酸的5'区中的序列互补。

选择性扩增可通过各种方法实现，包括方法的组合。在一些方法中，将无法使用尿嘧啶作为模板的聚合酶(如热稳定dna聚合酶)用于pcr扩增。第一引物的拷贝317a粘合于与靶点313核酸杂交的寡核苷酸的拷贝311a的3'区；第一引物的另一拷贝317b粘合于与偏离靶点315核酸部分杂交的寡核苷酸的拷贝311b的3'区；并且第一引物的另一拷贝317c粘合于不与核酸杂交的寡核苷酸的拷贝311c。聚合酶能够使用作为引物的拷贝317a和作为模板的拷贝311a来合成全长互补链，因为寡核苷酸的拷贝311a不含尿嘧啶。相比之下，聚合酶在从第一引物的拷贝317b和317c延伸期间停滞，因为寡核苷酸的拷贝311b和311c包括尿嘧啶碱基，并且因此聚合酶不能够合成用于寡核苷酸的拷贝311b和311c的全长互补链。

选择性扩增的其它方法包括降解含有尿嘧啶的dna。举例来说，可以用尿嘧啶dna糖基化酶处理混合物，所述尿嘧啶dna糖基化酶从dna链切除尿嘧啶。混合物接着可以用dna-(脱嘌呤或脱嘧啶)裂解酶(ap裂解酶)处理，所述裂解酶切断缺乏碱基的dna链的糖-磷酸主链。另外或替代地，在尿嘧啶dna糖基化酶处理之后，混合物可暴露于热和/或碱性条件以在无碱基位点处裂解dna。

所述方法可以包括rna降解步骤。rna降解步骤可以包括用核糖核酸酶(rnase)处理混合物。举例来说但不限于，rnase可以是rnasea、rnaseh、rnaseiii、rnasel、rnasep、rnasephym、rnaset1、rnaset2、rnaseu2或rnasev。

图4说明根据本发明的一个实施例，使用寡核苷酸来识别核酸的混合物中的靶点的方法401。在此实施例中，寡核苷酸包括上文针对寡核苷酸201所描述的特征。方法401尤其适用于识别mrna的混合物中的靶点。

在第一步骤403中，将寡核苷酸添加到单链核酸的混合物并且使其粘合于混合物中的核酸。基于寡核苷酸的中心区与靶点413的一部分之间的互补性，寡核苷酸的拷贝411a与靶点413核酸杂交。由于寡核苷酸与偏离靶点415核酸之间的部分互补性，寡核苷酸的拷贝411b与偏离靶点415核酸部分地杂交。寡核苷酸的拷贝411c未能与混合物中的核酸杂交。

单链核酸可以是任何类型的核酸，如上文关于方法301所描述。核酸可以双链分子形式提供并且变性，如上文关于方法301所描述。

在另一步骤407中，将寡核苷酸中的未配对胞嘧啶转化成尿嘧啶。可通过将亚硫酸氢根离子添加到混合物来实现转化407，如上文关于方法301所描述。

如上文关于寡核苷酸201所描述，寡核苷酸的5'和3'区不含胞嘧啶，并且寡核苷酸的中心区包括一个或多个胞嘧啶。粘合于靶点413核酸的寡核苷酸的拷贝411a中的胞嘧啶经碱基配对且因此受保护以免亚硫酸氢盐脱氨基。然而，结合于偏离靶点核酸的寡核苷酸的拷贝411b的中心区中的一个或多个胞嘧啶暴露于亚硫酸氢根并且因此经脱氨基。类似地，不与核酸杂交的寡核苷酸的拷贝411c中的胞嘧啶也经脱氨基。

在另一步骤409中，与靶点413核酸杂交的寡核苷酸的拷贝411a通过pcr选择性扩增。第一pcr引物与寡核苷酸的3'区中的序列互补，并且第二pcr引物与寡核苷酸的5'区中的序列互补。选择性扩增可通过如上文关于方法301所描述的各种方法实现。

图5展示本发明的实施例501，其中茎-环结构用作捕获靶点序列的探针。茎-环结构503a、503b具有靶点特异性环区505和通用(即，共同)茎序列507，其含有用于pcr的通用引发位点和茎的互补(双链)部分中的限制位点509。茎-环构建体粘合511到靶点并且暴露513于限制酶，所述限制酶攻击茎的互补部分中的共同限制位点。限制酶从任何未配对的茎-环结构去除引发位点。在靶点存在下，茎-环探针受保护以免于限制酶并且因此可以扩增。因此，所关注的靶点受到保护且经选择性地扩增515且从样品抽出。如图中所展示，探针a与靶点杂交，因此双螺旋茎无法形成，因此保护探针免于限制酶并且允许其扩增。

在另一方面，本发明提供用于由rna分子的混合物制成靶点库的非天然存在的寡核苷酸的汇集。汇集可以包括具有与寡核苷酸101相同的结构的寡核苷酸：每一寡核苷酸包括含有至少一个胞嘧啶的共同5'区、与靶点的一部分互补的中心区和共同3'区。

汇集的寡核苷酸的5'区的长度可为10-20个核苷酸或更长。举例来说但不限于，5'区可以含有至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸或至少40个核苷酸。5'区含有至少一个胞嘧啶，且其可以含有至少2个胞嘧啶、至少3个胞嘧啶、至少4个胞嘧啶、至少5个胞嘧啶或至少6个胞嘧啶。

汇集的寡核苷酸的3'区的长度可以短到10-15个核苷酸。举例来说但不限于，3'区可以含有至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸或至少40个核苷酸。对于dna寡核苷酸，3'区可以含有天然存在于dna中的四种碱基，即腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶，或其可以仅含有腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。

汇集的寡核苷酸的中心区与靶点核酸分子的部分互补。汇集中的每一寡核苷酸可以具有不同中心区。汇集中的每一寡核苷酸可以具有与靶点的不同部分互补的中心区。汇集中的每一寡核苷酸可以具有与不同靶点的一部分互补的中心区。

中心区可以含有不含胞嘧啶的一个或多个部分。不含胞嘧啶部分可以在中心区的5'部分或中心区的3'部分处。不含胞嘧啶部分可以含有10个或更少核苷酸、9个或更少核苷酸、8个或更少核苷酸、7个或更少核苷酸、6个或更少核苷酸、5个或更少核苷酸、4个或更少核苷酸、3个或更少核苷酸或2个或更少核苷酸。中心区的不含胞嘧啶部分可以含有一个或多个腺嘌呤，其在靶点的互补区中形成与鸟嘌呤的碱基对。

寡核苷酸的汇集可以设计成识别与疾病或医学病况有关的靶点。举例来说，寡核苷酸的汇集可用于识别基于基因的疾病(如心脏病、癌症或呼吸道疾病)的生物标记。寡核苷酸的汇集可用于识别基因改变，包括取代、插入、缺失、截短、单核苷酸多态性、拷贝数的改变、表达的改变等。

在另一方面，本发明提供用于由rna分子的混合物制成靶点库的非天然存在的寡核苷酸的汇集。汇集可以包括具有与寡核苷酸201相同的结构的寡核苷酸：每一寡核苷酸包括不含胞嘧啶的共同5'和3'区和含有一个或多个胞嘧啶且与靶点的一部分互补的中心区。

汇集的寡核苷酸的5'区的长度可以短到10-15个核苷酸。举例来说但不限于，5'区可以含有至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸或至少40个核苷酸。对于dna寡核苷酸，5'区可以含有腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶的任何序列或组合。

汇集的寡核苷酸的3'区的长度可以短到10-15个核苷酸。举例来说但不限于，3'区可以含有至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸或至少40个核苷酸。

汇集的寡核苷酸的中心区与靶点核酸分子的部分互补。汇集中的每一寡核苷酸可以具有不同中心区。汇集中的每一寡核苷酸可以具有与靶点的不同部分互补的中心区。汇集中的每一寡核苷酸可以具有与不同靶点的一部分互补的中心区。

汇集的寡核苷酸的中心区含有至少一个胞嘧啶，并且其可以含有至少2个胞嘧啶、至少3个胞嘧啶、至少4个胞嘧啶、至少5个胞嘧啶或至少6个胞嘧啶。然而，中心区可以含有不含胞嘧啶的一个或多个部分。不含胞嘧啶部分可以在中心区的5'部分或中心区的3'部分处。不含胞嘧啶部分可以含有10个或更少核苷酸、9个或更少核苷酸、8个或更少核苷酸、7个或更少核苷酸、6个或更少核苷酸、5个或更少核苷酸、4个或更少核苷酸、3个或更少核苷酸或2个或更少核苷酸。中心区的不含胞嘧啶部分可以含有一个或多个腺嘌呤，其在靶点的互补区中形成与鸟嘌呤的碱基对。

寡核苷酸的汇集可以设计成识别与疾病或医学病况有关的靶点。举例来说，寡核苷酸的汇集可用于识别基于基因的疾病(如心脏病、癌症或呼吸道疾病)的生物标记。寡核苷酸的汇集可用于识别基因改变，包括取代、插入、缺失、截短、单核苷酸多态性、拷贝数的改变、表达的改变等。

在另一方面，本发明提供使用基于寡核苷酸101的寡核苷酸汇集由rna分子的混合物制成靶点库的方法，如上文所描述。此类方法基于由核酸混合物识别靶点的方法301。

所述方法包括提供rna分子的混合物。rna可以是mrna、mirna、pirna、sirna、shrna、trna、rrna、snrna或snorna。优选地，rna为mirna。

所述方法包括向混合物中添加寡核苷酸的汇集，其中每一寡核苷酸含有：含有一个或多个胞嘧啶的共同5'区、与靶点的一部分互补的中心区和共同3'区，使得寡核苷酸中的一个或多个与靶点粘合。汇集的寡核苷酸的中心区与靶点核酸分子的部分互补。汇集中的每一寡核苷酸可以具有不同中心区。汇集中的每一寡核苷酸可以具有与靶点的不同部分互补的中心区。汇集中的每一寡核苷酸可以具有与不同靶点的一部分互补的中心区。

所述方法包括将混合物中的未配对胞嘧啶转化成尿嘧啶。可通过将亚硫酸氢根离子添加到混合物来实现转化，如上文关于方法301所描述。

所述方法包括选择不含尿嘧啶的寡核苷酸以用于制成核酸库。选择可以通过如上文关于方法301所描述，选择性pcr扩增已与靶点杂交的汇集中的寡核苷酸来进行。

所述方法可以包括使用寡核苷酸的5'区作为模板延伸粘合靶点的3'端。可以如上文关于方法301所描述进行延伸。

寡核苷酸可以是dna、rna或含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的混合核酸。

所述方法可以包括对库中的靶点进行计数。例如但非限制性地，计数可以包括以下中的任一种：对扩增靶点的总数计数；比较扩增靶点的数目与添加到混合物的寡核苷酸的物种的数目；比较不同扩增靶点的绝对或相对丰度；以及对从同一靶点的非依赖性扩增得出的靶点产物的数目计数。

所述方法可以包括对库中的靶点进行测序。所述方法可以包括检测疾病或医学病况的变化生物标记。举例来说，所述方法可以包括识别基因改变，包括取代、插入、缺失、截短、单核苷酸多态性、拷贝数的改变、表达的改变等。

所述方法可以包括提供疾病或医学病况的诊断、预后或治疗过程。

在另一方面，本发明提供使用基于寡核苷酸201的寡核苷酸汇集由rna分子的混合物制成靶点库的方法，如上文所描述。此类方法基于由核酸混合物识别靶点的方法401。

所述方法包括提供rna分子的混合物。rna可以是mrna、mirna、pirna、sirna、shrna、trna、rrna、snrna或snorna。优选地，rna为mrna。

所述方法包括向混合物中添加寡核苷酸的汇集，其中每一寡核苷酸含有不含胞嘧啶的共同5'和3'区和含有一个或多个胞嘧啶且与靶点核酸分子的一部分互补的中心区，使得寡核苷酸中的一个或多个与靶点粘合。汇集中的每一寡核苷酸可以具有不同中心区。汇集中的每一寡核苷酸可以具有与靶点的不同部分互补的中心区。汇集中的每一寡核苷酸可以具有与不同靶点的一部分互补的中心区。

所述方法包括将混合物中的未配对胞嘧啶转化成尿嘧啶。可通过将亚硫酸氢根离子添加到混合物来实现转化，如上文关于方法301所描述。

所述方法包括选择不含尿嘧啶的寡核苷酸以用于制成核酸库。选择可以通过如上文关于方法301所描述，选择性pcr扩增已与靶点杂交的汇集中的寡核苷酸来进行。

寡核苷酸可以是dna、rna或含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的混合核酸。

所述方法可以包括对库中的靶点进行计数。例如但非限制性地，计数可以包括以下中的任一种：对扩增靶点的总数计数；比较扩增靶点的数目与添加到混合物的寡核苷酸的物种的数目；比较不同扩增靶点的绝对或相对丰度；以及对从同一靶点的非依赖性扩增得出的靶点产物的数目计数。

所述方法可以包括对库中的靶点进行测序。所述方法可以包括检测疾病或医学病况的变化生物标记。举例来说，所述方法可以包括识别基因改变，包括取代、插入、缺失、截短、单核苷酸多态性、拷贝数的改变、表达的改变等。

所述方法可以包括提供疾病或医学病况的诊断、预后或治疗过程。

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等效方案

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