本发明涉及由α-愈创木烯生产莎草薁酮的方法、α-愈创木烯在生产莎草薁酮中的用途、香料或香精成分和这类香料或香精成分的用途。
莎草薁酮((3s,5r,8s)-3,8-二甲基-5-丙-1-烯-2-基-3,4,5,6,7,8-六氢-2h-薁-1-酮)为最初在香附子(cyperusrotundus)块茎中发现的倍半萜。该化合物具有强烈的辛辣胡椒籽香气和木香气味。随后又发现它是黑胡椒和白胡椒、马郁兰、牛至、迷迭香、罗勒、百里香、老鹳草、沉香木(agarwood)、广藿香油和甲位甲基桂醇油(cyprioloil)的成分。此外，在展现胡椒的辛香的不同葡萄酒、主要是syrah(shiraz)葡萄酒中检测到莎草薁酮。该倍半萜在水中的香气检测阈值为8ng/l，这是迄今为止发现的任何天然产物中最低的(j.agric.foodchem.2008，56，3738-3744及其中引用的参考文献)。
此外，对葡萄柚、橙子、苹果和芒果的香气进行的研究揭示出存在莎草薁酮。感官分析表明，该化合物以甚至低于阈值的水平添加到这些水果的模型饮料中时不会直接赋予木香，但会对饮料的整体香味产生显著影响，从而有助于它们更好地接近水果的自然香味(j.agric.foodchem.2017，65，4464-4471)。
尽管具有这些极具吸引力的特性，但到目前为止，莎草薁酮尚未在香料和香精工业中用作成分。造成这种情况的主要原因是，没有可靠的方法可以以期望的嗅觉质量生产足量的这种材料。
据推测，在自然界中，莎草薁酮由α-愈创木烯通过c(3)位的烯丙位氧化形成，所述c(3)位的烯丙位氧化通过空气氧化、活性氧(ros)或酶促氧化进行(j.agric.foodchem.2014，62，10809-10815；j.nat.prod.2015，78，131-145；j.exp.bot.2016，67，787-798)。这种转化也可以通过化学合成来实现。
α-愈创木烯为各种精油例如愈创木油或广藿香油的成分。尽管它已广泛用于香料和香精领域，但迄今仍不能将其用作莎草薁酮工业生产的前体。首先，可以从中提取α-愈创木烯的植物材料的供应受到严重限制，因为这些植物材料中许多是从濒临灭绝的物种中收获的，其开发受到严格控制。此外，从植物提取物中分离α-愈创木烯是困难的，并且是获取该前体的主要障碍。而且，这种提取物的质量经常存在相当大的波动。例如，据报道，愈创木的气味伴有“熏火腿”样味道，可以想象是在愈创木的强制性蒸馏期间添加无机酸至蒸馏水中以提高蒸馏的收率和速度导致的(s.arctander，perfumeandflavormaterialsofnaturalorigin1994，alluredpublishingcorporation，carolstream，il，usa)。产生这种“熏火腿”样味道的杂质难以在转化后从α-愈创木烯或从莎草薁酮中分离。
因此，本发明所要解决的问题在于克服现有技术中的上述缺陷。特别地，本发明所要解决的问题在于提供一种用于香料和香精工业的莎草薁酮的生产方法，更具体地，是在基本上不存在引起令人不安的气味、特别是在上述举出的“熏火腿”样的气味的杂质的情况下。有利地，该方法被认为可以生产大量的莎草薁酮。此外，该方法应该是环境友好的、安全的且具有成本效益的。
通过根据权利要求1的方法解决了这些问题。在该方法中，特别是通过c(3)位的氧化由α-愈创木烯生产莎草薁酮。α-愈创木烯由前体通过倍半萜合酶生产，其中所述倍半萜合酶在微生物中产生。
在本发明的上下文中，术语“倍半萜合酶”是指能够从前体合成倍半萜α-愈创木烯的多肽。
此外，“α-愈创木烯由前体通过倍半萜合酶生产”应理解为使该前体与倍半萜合酶相互接触以实现α-愈创木烯的形成。
本发明的另一个方面涉及用于生产莎草薁酮的方法，所述方法包括以下步骤：
-在微生物中产生倍半萜合酶；
-通过使得到的倍半萜合酶与前体接触生产α-愈创木烯；
-特别是通过c(3)位的氧化由得到的α-愈创木烯生产莎草薁酮。
通过使用在微生物中产生的倍半萜合酶，可以独立于天然来源的原料，更具体地通过生物技术方法得到α-愈创木烯。没有这种限制，可以使用环境友好的方法以工业化规模生产大量的莎草薁酮，而不受体量的限制。这使得该化合物的可持续生产成为可能，特别是作为香料和香精工业中的一种成分。此外，由于不需要提取植物材料，因此可以在受控条件下以稳定的质量提供所需的α-愈创木烯，并且基本上不存在引起令人不安、特别是上述提及的“熏火腿”-样气味的杂质。
可以在适于产生α-愈创木烯的条件下，特别是在体内培养微生物。其优点在于，可以在相同的生物转化中实现倍半萜合酶和α-愈创木烯的生产，这使整个过程更有效。此外，避免了分离倍半萜合酶。
在一个优选的实施方案中，在适合于也产生前体，特别是由糖产生前体的条件下培养微生物。合适的糖的实例包括、但不限于蔗糖、果糖、木糖、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖和其它含葡萄糖的聚合物。
另一方面，还可以在生产α-愈创木烯之前从微生物中分离出倍半萜合酶。尽管然后需要另外的转化，但是α-愈创木烯的形成可以在更加可控的条件下离体进行。
可以通过使用标准蛋白质或酶提取技术从表达它的任何微生物中提取来得到离体形成α-愈创木烯所需的倍半萜合酶。如果微生物是将倍半萜合酶释放入培养基中的细胞，则可以单纯地从培养基中收集倍半萜合酶，例如通过离心，任选地随后进行洗涤步骤并重新悬浮在适合的缓冲溶液中。如果微生物在其自身中积累多肽，则可以通过破坏或裂解细胞并从细胞裂解物中进一步提取多肽来获得倍半萜合酶。
然后可以使倍半萜合酶以分离的形式或与其它蛋白质一起(例如在从培养的微生物得到的粗蛋白提取物中)悬浮在最佳ph的缓冲溶液中。如果适合，可以添加盐、bsa和其它种类的酶促辅助因子以优化酶活性。特别地，酶促辅助因子可以为mg2+盐。
然后可以将所述前体添加到悬浮液或溶液中，然后将其在最佳温度下温育，例如在15-40℃之间，优选在25-35℃之间，更优选在30℃下温育。温育后，可通过标准分离方法，例如溶剂萃取和蒸馏，任选地从溶液中除去多肽后，从温育溶液中分离α-愈创木烯和任选的其它倍半萜副产物。
所述微生物可以为重组微生物。术语“重组微生物”是指在有助于产生α-愈创木烯的条件下转化以表达倍半萜合酶的微生物。术语“转化”是指对微生物进行遗传改造的事实。优选地，所述微生物异源表达倍半萜合酶乃至过表达它。存在几种本领域已知的用于生成转基因微生物的方法。
重组微生物可以是细菌或酵母。更具体地，所述微生物可以选自大肠杆菌(escherichiacoli)、arxulaadeninivorans、博伊丁氏假丝酵母(candidaboidinii)、多形汉逊氏酵母(hansenulapolymorpha)、乳克鲁维氏酵母(kluyveromyceslactis)、巴斯德毕赤氏酵母(pichiapastoris)、啤酒糖酵母(saccharomycescerevisiae)和解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)。
优选地，所用的大肠杆菌得到行业和监管机构认可(包括、但不限于大肠杆菌k12或大肠杆菌bl21)。
所述前体可以是无环前体，特别是焦磷酸法呢酯。在本发明的一个优选实施方案中，其中α-愈创木烯在体内形成，所述微生物还能够优选从糖中生产焦磷酸法呢酯。
倍半萜合酶可以与seqidno.:2、seqidno.:4或seqidno.:6具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％的序列同一性。
seqidno.:2对应于酶vvguas，其得自葡萄(vitisvinifera)，如j.exp.bot.2016，67，799-808中所述。seqidno.:1表示相应的核酸序列。经证实vvguas产生α-愈创木烯作为主要产物，其具有45％的选择性。
seqidno.:4对应于酶acc3，其得自沉香属(aquilaria)植物，如plantphysiol.2010，154，1998-2007中所述。seqidno.:3表示相应的核酸序列。经证实acc3产生α-愈创木烯，其具有45％的选择性。
seqidno.:6对应于酶pattps717，其得自广藿香(pogostemoncablin)(广藿香(patchouli))如arch.biochem.biophys.2006，454，123-136中所述。seqidno.:5表示相应的核酸序列(另外参照ncbigenbank保藏号ay508730{版本：ay508730.1})。经证实pattps717产生α-愈创木烯，其具有13％的选择性。
两个肽或核苷酸序列之间的序列同一性是生成两个序列比对时在两个序列中相同氨基酸或核苷酸残基的数量的函数。将相同残基定义为在比对的给定位置在两个序列中相同的残基。如本文所用，序列同一性的百分比由最佳比对通过将两个序列之间相同的残基数除以最短序列中的残基总数再乘以100来计算。最佳比为对这样的比对，其中同一性百分比为最高可能性。可以将空位引入比对的一个或多个位上的一个或两个序列以得到最佳比对。然后将这些空位作为不相同的残基考虑在内，以计算序列同一性百分比。
为了确定氨基酸或核酸序列同一性的百分比目的而进行的比对可以使用计算机程序和例如公开可利用的计算机程序以各种方式实现。优选地，从国家生物技术信息中心(ncbi)获得的设置为默认参数的blast程序(femsmicrobiollett.1999，174，247-250)可用于获得肽或核苷酸序列的最佳比对，并用于计算序列同一性的百分比。
在本发明的上下文中，可以用编码倍半萜合酶的至少一种核酸转化能够产生倍半萜合酶的另一种微生物。
所述至少一种核酸可以与seqidno.:1，seqidno.:3或seqidno.:5具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％的序列同一性。
可以将“核酸”定义为包括单链或双链形式(dna和/或rna)的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。用于转化适合于产生倍半萜合酶的微生物细胞的重要工具为包含核酸的表达载体。如本文所用，“表达载体”包括任何线性或环状重组载体，包括、但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒、人工细菌或人工酵母染色体以及敲除或敲入构建体。本领域技术人员能够根据表达系统选择适合的载体。
可以通过外源或异源dna转化细菌或酵母细胞，此时这类dna被引入到细胞内。可以整合也可以不整合转化的dna，即共价连接入细胞基因组中。在原核生物和酵母中，例如，可以将转化的dna维持在附加型成分例如质粒上。关于真核细胞，稳定转染的细胞为这样的细胞，其中转染的dna已经整合入染色体，使得其被子细胞通过染色体复制遗传。真核细胞建立细胞系或克隆的能力证明了这种稳定性，所述细胞系或克隆由包含转化dna的子代细胞群组成。
在本发明的上下文中，可以用例如重组噬菌体dna、质粒dna、细菌人工染色体或粘粒dna表达载体转化细菌(例如大肠杆菌)。酵母(例如啤酒糖酵母)可用包含本公开的多核苷酸分子的重组酵母表达载体转化。根据所使用的微生物和相应的使用载体的不同，例如，该多核苷酸可以整合入染色体或线粒体dna中，或者可以例如在染色体外、例如以附加型方式维持，或者仅被短暂地包含。
可以通过使用众所周知的方法的简单测试方法来确定用于本发明用途的微生物的适合性。例如，可以在通常用于微生物繁殖的ph、温度和通气条件下，在丰富的培养基(例如lb培养基、细菌用胰胨酵母提取物培养基或营养培养基)中繁殖测试微生物。一旦选择产生期望的生物转化产物的微生物，则典型地通过生产细胞系经适合的表达系统和发酵大规模生产产物，即通过细胞培养物中的微生物生产。
为了进行细胞培养，可以使用所定义的基本培养基，例如m9a。m9a培养基的组分包含：14g/lkh2po4、16g/lk2hpo4、1g/l柠檬酸na3·2h2o、7.5g/l(nh4)2so4、0.25g/lmgso4·7h2o、0.015g/lcacl2·2h2o、5g/l葡萄糖和1.25g/l酵母提取物。另一方面，可以使用富含营养物的培养基，例如lb。lb培养基的组分包含：10g/l胰胨、5g/l酵母提取物和5g/lnacl。
可以使微生物以分批式、补料分批式或连续方法或其组合方式生长。典型地，使微生物在适合的营养源存在下在限定的温度下在发酵罐中生长期望的时间期限。如本文所用，术语“分批式培养”是其中在培养期间既不添加也不取出培养基的培养方法。如本文所用，术语“补料分批式”是指一种培养方法，其中在培养期间添加培养基，但不取出培养基。
本发明方法可以进一步包括在生产莎草薁酮之前，特别是通过蒸馏或色谱法纯化α-愈创木烯的步骤。有利地，用于生产莎草薁酮的α-愈创木烯具有10-95％、优选20-80％、更优选30-70％的纯度。
在本发明方法中，莎草薁酮可由α-愈创木烯通过氧化生产，所述氧化选自过渡金属催化、有机催化、铬氧化、硒氧化、锰氧化、空气氧化、酶促氧化、电化学氧化及其组合。相对于可用于进行该转化的方式，这赋予了极大的灵活性。
为了避免任何歧义，在本发明的上下文中，“α-愈创木烯在c(3)位的氧化”不应仅理解为在α-愈创木烯的c(3)位的亚甲基直接氧化为相应的羰基。这种转化也可以指一个过程，其中羰基通过中间体(例如仲醇)逐步形成。根据所使用的方法，可以分离出该中间体并将其进一步转化成莎草薁酮。
在本发明的上下文中，“空气氧化”应理解为以纯或稀释形式的分子氧(o2)、例如空气进行的任何氧化。
当由α-愈创木烯通过过渡金属催化生产莎草薁酮时，所述过渡金属可以选自铁、铜、钒、锰、钼、钴、钌、钯、铱、铑、钛、铬、金、锇及其组合。使用这些过渡金属，可以实现对产物莎草薁酮的高选择性和良好的收率。
特别地，可以通过铁卟啉催化由α-愈创木烯生产莎草薁酮，所述铁卟啉催化包括以下步骤：
-在溶剂中形成包含α-愈创木烯和铁(iii)-x卟啉配合物催化剂的混合物；
-将分子氧引入到所述混合物中；
-通过氧化α-愈创木烯的c(3)位进行莎草薁酮的生产。
铁卟啉催化为α-愈创木烯向莎草薁酮的转化提供了一种有效的方法，具有很好的选择性和收率。分子氧(o2)是一种出色的化学计量氧化剂，其易于获得，具有成本效益，对环境友好并且易于处理。铁(iii)-x卟啉配合物催化剂也显示出低毒性并且可以在低催化剂载量下使用。此外，粗产物的气味特征使得莎草薁酮的气味不会受到副产物的不利影响。作为结果，根据应用，所获得的产物无需纯化莎草薁酮即可用于香料和香精行业。然而，如果要纯化得到的莎草薁酮，则可以通过简单的蒸馏或通过柱色谱法实现。
在上述铁卟啉催化中，x可以选自cl、br、i、甲磺酸根离子、三氟甲磺酸根离子和羧酸根离子，优选cl、br和i。特别优选cl，因为对于这种阴离子，可以以低成本从商业来源得到在卟啉系统具有不同取代模式的多种铁(iii)-x卟啉配合物催化剂。
在上述铁卟啉催化中，混合物可另外包含碱配位化合物，优选为n-杂环，更优选为咪唑。这具有的优点在于在短的反应时间后可获得更好的收率和纯度。
一方面，将分子氧引入到所述混合物中的步骤可以包括将氧气鼓泡到混合物中。另一方面，将分子氧引入到所述混合物中的步骤还可以包括将空气鼓泡到混合物中。
将分子氧引入到所述混合物中的另一种选择在于在含氧气氛下剧烈搅拌混合物。已经发现，通过将空气或分子氧引入到所述反应混合物中，可以在上述铁卟啉催化中获得良好的结果。空气作为分子氧的来源，其具有的进一步的优点在于可以低成本大量获取。此外，它在操作上是安全的。
管不是必需的，但是该方法可以包括将混合物暴露于电磁辐射，优选uv光辐射或电磁光谱的可见范围内的辐射。用于使混合物暴露的电磁辐射的波长范围可以在约200nm至约800nm的范围。或者，该方法可以在黑暗中进行或在环境光条件下进行。在这些选项中进行选择的可能性使得能够选择最适合工业化生产的设置。
在铁卟啉催化中，溶剂选自水、丙酮、乙醇、2-丙醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、甲醇、甲基乙基酮、1-丁醇、叔丁醇及其混合物，优选乙醇/水混合物。这些溶剂可以弃去而不会破坏环境，或者可以在使用后容易地回收利用。乙醇/水混合物具有的进一步的优点在于可以以特别好的收率和纯度获得莎草薁酮。此外，如果乙醇:水的比例小于1:1，则可以获得不易燃的混合物。
另一方面，所述溶剂也可以选自环己烷、庚烷、甲苯、甲基环己烷、甲基叔丁基醚、异辛烷、乙腈、二甲苯、二甲亚砜、乙酸、乙二醇及其混合物。
优选地，所述催化剂是具有氯离子抗衡离子的铁(iii)卟啉配合物催化剂。此外，卟啉配合物可以是四苯基卟啉配合物。具体地，所述催化剂可以为氯(四苯基卟啉)铁(iii)。使用这种催化剂，在选择性、收率和产物纯度方面可以达到极好的结果。此外，如上所述，这种催化剂具有成本效益，并且可从商品来源获得。然而，在卟啉上具有不同取代模式的这种类型的催化剂可以由甚至更低廉的成分fe(ii)cl2和卟啉配体容易且几乎定量地制备。另外，可以使用具有低催化剂载量的氯(四苯基卟啉)铁-(iii)。此外，氯化血红素(heminechloride)可用作铁(iii)-x卟啉配合物催化剂。
或者，可以由α-愈创木烯通过钴催化生产莎草薁酮，所述钴催化特别地包括以下步骤：
-特别地在4-甲基-2-戊酮存在下，在溶剂中形成包含α-愈创木烯和至少一种钴(ii)配合物催化剂的混合物，所述钴(ii)配合物催化剂优选选自乙基己酸钴(ii)、乙酰丙酮钴(ii)、环烷酸钴(ii)及其混合物；
-将分子氧引入到所述混合物中；
-进行α-愈创木烯的c(3)位的氧化。
作为另一种替代选择，可以由α-愈创木烯通过铬氧化生产莎草薁酮，所述铬氧化特别地包括以下步骤：
-优选在c盐存在下，在溶剂中形成包含α-愈创木烯和至少一种铬试剂的混合物，所述铬试剂优选铬(vi)试剂，特别地选自氯铬酸吡啶鎓、氟铬酸吡啶鎓、重铬酸吡啶鎓、三氧化铬、铬酸钠及其混合物；
-进行α-愈创木烯的c(3)位的氧化。
使用这种方法，可以以良好的收率和纯度得到莎草薁酮。
此外，可以由α-愈创木烯通过有机催化生产莎草薁酮，所述有机催化特别地包括以下步骤：
-在溶剂中形成包含α-愈创木烯、有机催化剂和氧化剂的混合物，所述有机催化剂优选选自n-羟基邻苯二甲酰亚胺和四氯-n-羟基邻苯二甲酰亚胺；
-进行α-愈创木烯的c(3)位的氧化。
通过有机催化，无需使用昂贵且潜在地有害的重金属催化剂，即可由α-愈创木烯生产莎草薁酮。因此，该方法具有成本效益、环境友好性和操作安全性。
在有机催化中，氧化剂可以选自叔丁基氢过氧化物、过氧化氢、过氧化二苯甲酰、二叔丁基过氧化物、亚氯酸钠、分子氧及其混合物。所有这些氧化剂都是易于使用且使用安全的散装化学品。亚氯酸钠和分子氧还具有反应的后处理特别容易的优点。
在本发明的上下文中，也可以由α-愈创木烯通过电化学氧化生产莎草薁酮，所述电化学氧化特别地包括以下步骤：
-在溶剂中形成包含α-愈创木烯、电化学介体和电解质的混合物，所述电化学介体优选选自n-羟基邻苯二甲酰亚胺和四氯-n-羟基邻苯二甲酰亚胺；
-向所述混合物施加电流；
-进行α-愈创木烯的c(3)位的氧化。
电化学氧化的有代表性的实例描述在nature2016，533，77-81中。它使得能够由α-愈创木烯以良好的收率和选择性生产莎草薁酮。通过电化学氧化，不需要使用或较少使用化学计量的氧化剂，并且减少了废物的产生。
在上述电化学氧化中，混合物还可以包含碱，所述碱优选选自吡啶、2,6-二甲基吡啶(2,6-lutidinie)、2,4,6-三甲基吡啶(2,4,6-collidine)、三甲胺、dbu及其混合物。所述溶剂可以选自丙酮、乙腈、二氯甲烷、吡啶及其混合物。所述电解质可以选自libf4、liclo4及其混合物。
此外，在上述电化学氧化中，混合物另外包含助氧化剂，所述助氧化剂优选选自过氧化氢叔丁基(tert-butylhydroperoxide)、过氧化氢、过氧化二苯甲酰、过氧化二叔丁基(di-tert-butylperoxide)及其混合物。通过使用助氧化剂，可以实现提高的收率。
除化学合成外，还可以由α-愈创木烯通过酶促氧化生产莎草薁酮，特别是通过选自细胞色素p450的酶，优选α-愈创木烯3-氧化酶细胞色素p450、漆酶、里斯克非-血红素双加氧酶(rieskenon-hemedioxygenase)及其组合。α-愈创木烯3-氧化酶细胞色素p450(本文称作“α-愈创木烯2-氧化酶vvsto2”)描述在j.exp.bot.2016，67，787-798中。已经证实这种酶表现出极佳的底物-特异性和选择性。
α-愈创木烯在c(3)位被上述酶氧化还可以产生相应的仲醇。可以使用不同方法将该中间体进一步氧化成莎草薁酮，例如用醇氧化酶或醇脱氢酶氧化。
本发明方法可以进一步包括纯化所生产的莎草薁酮的步骤。这可以通过蒸馏或色谱法进行。蒸馏具有可以以低成本大规模进行的优点。色谱法的优点在于可以得到具有特别高纯度的材料。
本发明还涉及α-愈创木烯在生产莎草薁酮中的用途，特别是通过c(3)位的氧化来进行，其中α-愈创木烯由前体、特别是无环前体通过倍半萜合酶生产，其中所述倍半萜合酶在微生物中产生。
本发明的另一个方面涉及可通过上述方法获得的香料或香精成分。
本发明还涉及香料或香精成分，特别是如上所述的成分，其中莎草薁酮部分在10至95wt.-％，优选20至70wt.-％，甚至更优选25至50wt.-％的范围内。
所述香料或香精成分还可以包含酮5。
在这种香料或香精成分中，莎草薁酮与酮5的重量比可以在20:1至1:1、优选10:1至2:1、甚至更优选5:1至3:1的范围内。
本发明还涉及包含如上所述的香料或香精成分的消费品，并涉及这种香料或香精成分的用途。
本发明还涉及用于生产香料或香精组合物和/或消费品的方法，所述方法包括通过上文所述的方法由α-愈创木烯生产莎草薁酮。
根据以下代表性实施方案的描述，本发明的其它方面和特定特征将变得显而易见。
采用的分析方法
极性gcms：
35℃/2min，10℃/min至50℃，2.5℃/min至240℃，240℃/5min。thermoscientifictsq8000evo+trace1310系统。极性柱：varianvf-wax(极性，peg相)。柱尺寸：30m长，0.25mmid，0.25μm薄膜厚度。注射器：无分流。流量：1.2ml/min。载气：氦气。注射体积：1μl。注射器温度：230℃。传输线：250℃。ms-四极杆(quadrupol)：160℃。ms-源：230℃。电离模式：电子轰击(ei)，在70ev。
通过这种方法，鉴定了得到的产物。忽略了次要和不确定的副产品，并且未给出它们的百分比(通常<10％)。除了α-愈创木烯1和莎草薁酮2外，副产物包括莎草薁醇(rotundol)3、环氧-愈创木烯4、酮5、羟基-莎草薁酮6和紫堇酮7。
如下文所定义的组分1-7是文献中已知的，除了被分离且其结构得到证实的酮5之外。
非极性gc：
100℃/2min，15℃/min至240℃，240℃/5min。thermofocusgc。非极性柱：agilenttechnologiesj&wscientificdb-5(非极性，5％苯基甲基聚硅氧烷)。柱尺寸：30m长，0.32mmid，0.25μm薄膜厚度。注射器：分流。注射器温度：240℃。检测器：fid。检测器温度：270℃。注射体积：1μl。载气：氦气。分流比：1/42.3。压力：70kpa。整合器：hewlettpackard。
通过该方法，测定了蒸馏后莎草薁酮2的底物纯度、转化率和gc-纯度(％rpa)。
α-愈创木烯的来源
通过重复的蒸馏从clearwoodtm中分离出α-愈创木烯，其纯度为37％-85％。通过gc和使用内标茴香醛的nmr测定纯度。其它成分为塞舌尔烯(seychellene)(≤33％)、α-广藿香烯(≤25％)和γ-广藿香烯(≤5％)。通过gc和使用内标茴香醛的nmr测定纯度。
clearwoodtm(cas1450625-49-6)为广藿香、木香家族中的香料成分，并且购自firmenich。包含约14wt.-％的α-愈创木烯1的倍半萜混合物通过糖的发酵得到(ip.comtechnicaldisclosureipcom000233341d)。
α-愈创木烯1的生物技术生产实例还在plantphysiol.2010，154，1998-2007；arch.biochem.biophys.2006，454，123-136和wo2005/052163a2中给出。
由α-愈创木烯1制备莎草薁酮2(铁卟啉催化)
在搅拌下将氯(四苯基卟啉)铁(iii)(17mg，0.024mmol)和咪唑(6.7mg，0.1mmol)添加到在1:1乙醇/水混合物(20ml)中的α-愈创木烯1(61％exclearwoodtm，1g，3mmol)中。在45℃将氧气鼓泡到淡绿色混浊混合物中。30min后，用氧气气球替代氧气进口。5小时后，gc显示完全转化为包含莎草薁酮2(24％)、环氧-愈创木烯4(3％)、酮5(6％)、羟基-莎草薁酮6(4％)、塞舌尔烯8(37％)的混合物。将暗棕色的混合物减压部分蒸发，将残余物用叔丁基甲基醚萃取。将合并的有机层用mgso4干燥，过滤并蒸发。将残余的棕色油(1.22g)在150-230℃/0.03mbar进行瓶-对-瓶(bulb-to-bulb)蒸馏，得到0.88g具有32％gc-纯度的莎草薁酮2(修正收率43％)(为红棕色油状物)和0.18g的棕色残余物。
由α-愈创木烯1制备莎草薁酮2(有机催化)
在正氮气流下在配备冷凝器的100ml圆底双颈烧瓶中，将α-愈创木烯1(37％exclearwoodtm，1.022g，1.85mmol)和nhpi(0.082g，0.5mmol)溶于乙腈(30ml)和水(15ml)。将该溶液加热至50℃，并分部分添加固体naclo2(0.678g，7.5mmol)。然后将反应混合物在50℃搅拌21h。然后，使溶液冷却至室温，倾倒在naoh(水溶液，2m)上。将产物用mtbe萃取并用盐水洗涤。将合并的有几层用mgso4干燥，过滤并蒸发。残余物(0.92g)的gcms显示已完全转化为包含莎草薁酮2(6％)、莎草薁醇3(1％)、环氧-愈创木烯4(1％)、酮5(1％)、羟基-莎草薁酮6(2％)、塞瑟尔烯(40％)、α-广藿香烯(11％)、α-广藿香酮(2％)和β-广藿香酮(2％)的混合物。将残余的棕色油状物(0.92g)在160-220℃/0.01mbar下瓶-对-瓶蒸馏，得到0.92g具有17％的gc-纯度的莎草薁酮2(33％修正收率)(为红棕色油状物)和90mg棕色残余物。
莎草薁酮2的嗅觉描述
(来自上文所述的铁卟啉催化，通过蒸馏纯化，在乙醇中稀释度1％，在吸墨纸上新鲜蘸取，在4h后和1周后)
酮5的合成和纯化
使用300wosramultravitalux灯的光照射并且在45℃下，在搅拌下将氧气鼓泡到氯(四苯基卟啉)铁(iii)(34mg，0.05mmol)、咪唑(6.7mg，0.1mmol)和α-愈创木烯91％(1g，4.5mmol)在聚乙二醇(20ml)中的混合物中。38小时后，gcms显示定量转化为莎草薁酮2(27％)、环氧-愈创木烯4(6％)、酮5(11％)、羟基-莎草薁酮6(19％)、紫堇酮7(1％)的混合物。将橙色产物混合物用叔丁基甲基醚相对水进行萃取。将合并的有机层用mgso4干燥，过滤并蒸发至0.7g的橙色油状物，将其通过快速色谱法纯化，其中使用30g硅胶15-40μm，应用己烷/乙酸乙酯梯度98:2至50:50。蒸发溶剂后，得到0.23g具有52-59％gc-纯度(13％修正)的莎草薁酮2和24mg具有71％(2％修正)gc-纯度的酮5。通过制备型gc进一步纯化酮5至>99.5％的纯度(包含小于0.03％的莎草薁酮2)，在吸墨纸上并且通过sniff-gc分析其气味，为木香，雪松味，干香，异甲基紫罗兰酮-愈创木脂味，烟熏味，果香，辛香。
酮5((4s,7r)-4-甲基-7-(丙-1-烯-2-基)-3,4,5,6,7,8-六氢薁-1(2h)-酮)的分析数据：1h-nmr(苯-d6，400mhz)：4.85-4.9(2s，2h)，3.1-3.14(2h)，2.5-1.4(10h)，1.75(s，3h)，0.9(d，3h)ppm；13c-nmr(苯-d6，100mhz)：206.5(s)，176.6(s)，150.3(s)，139.0(s)，108.9(t)，45.2(d)，36.4(d)，33.8(t)，32.1(t)，30.9(t)，29.5(t)，28.1(t)，20.4(q)，16.5(q)ppm；13c-nmr(cdcl3，100mhz)：209.3(s)，179.9(s)，150.6(s)，139.2(s)，108.9(t)，45.3(d)，36.85(d)，34.3(t)，32.3(t)，31.0(t)，30.15(t)，27.2(t)，20.6(q)，17.0(q)ppm；ir(cm-1)：2661(w)，2922(m)，2854(w)，1697(s)，1642(m)，1452(w)，1438(w)，1375(w)，1304(w)，1286(w)，1260(w)，1236(w)，1173(w)，1154(w)，1071(w)，1042(w)，1023(w)，992(w)，886(m)，532(w)；gcms(ei，m/z)：204(2％，[m]+)，189(11％，[m-15]+)，161(12％)，148(51％)，147(48％)，134(10％)，133(100％)，121(18％)，119(28％)，107(19％)，106(11％)，105(43％)，93(25％)，91(18％)，91(39％)，81(34％)，81(17％)，79(27％)，77(22％)；[α]d22＝-11.4(c0.35，chcl3)；hrms(esi)：c14h21o[m+h]+的计算值：205.1587；测定值：205.1586。
序列表
<110>givaudansa
<120>有机化合物中或与之相关的改进
<130>30932ep
<160>6
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