本发明涉及人体软骨、骨损伤组织部位修复的技术领域，尤其是指一种环糊精-药物主客体超分子修饰的水凝胶的制备方法及应用。
背景技术：
临床最常用的治疗骨、软骨损伤的方法有物理疗法、药物治疗法(包括抗炎类药物、骨吸收抑制剂、金属酶抑制剂等)、手术移植法(包括镶嵌移植术、微骨折术、自体或异体骨移植)等，但这些方法都存在一些缺陷。物理疗法十分局限只能缓解疼痛，延缓病情。临床上药物治疗法疗效有限，对人体软骨的正常代谢存在一定副作用，不可长期使用。采用的手术移植法中，镶嵌移植术、微骨折术的组织适配性不好，复发率高、长期疗效差。自体或异体骨移植则面临供体有限，易发生免疫排斥反应引起并发症。随着材料学、组织工程学以及再生医学的发展，构建生物相容性优异的组织工程支架，并结合干细胞治疗手段为骨软骨缺损的临床治疗带来新的突破。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种环糊精-药物主客体超分子修饰的水凝胶的制备方法及应用，通过该方法可制得能够原位注射、紫外光照快速交联成型制备载药且封装细胞的水凝胶，其生物相容性良好且能支持干细胞增殖与定向分化，在基质成分上，选取组织相容性优异且能模拟组织成分的基质材料。
为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：环糊精-药物主客体超分子修饰的水凝胶的制备方法，首先，采用同时含异氰酸酯和碳碳双键官能团的化合物与β-环糊精反应，获得双键改性后的β-环糊精分子；然后在水相中使双键改性的β-环糊精与相应的亲脂药物疏水包合，获得主客体超分子的“纳米药物盒子”，将其加入到预交联的水凝胶溶液中，在引发剂存在下进一步紫外光交联，实现环糊精-药物主客体超分子修饰的载药水凝胶体系的构建。
进一步，所述亲脂药物有含有苯环基团的kartogenin或褪黑素，亲脂药物分子量均<500。
进一步，通过改变异氰酸酯化合物与β-环糊精的摩尔配比调节平均双键接枝个数为1～3个，选用的异氰酸酯化合物有甲基丙烯酸异氰基乙酯或异氰酸酯丙烯酸乙酯。
进一步，所述“纳米药物盒子”与水凝胶溶液中的水凝胶基质网络键合，形成载药水凝胶体系。
进一步，所述水凝胶基质由接枝双键后明胶和透明质酸组成，能够封装具有快速增殖和多项分化潜能的干细胞，包括脂肪间充质干细胞(adscs)和骨髓间充质干细胞(bmscs)。
进一步，所述引发剂选用水溶性无细胞毒性的生物用引发剂，有i2959或lap，紫外光照强度范围在5.6mw～15.0mw。
上述制得的水凝胶具有良好生物相容性，支持干细胞的生长与分化，用于人体软骨、骨或骨软骨的界面组织部位的修复，在组织修复中，能够封装具有快速增殖和多项分化潜能的干细胞，通过在损伤组织中原位注射及通过紫外光照快速交联固化填补损伤。
本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
本发明以生物相容性优异的光交联水凝胶为基质材料，通过共价键合引入了一种环糊精-药物主客体超分子作为“药物盒子”，得到机械强度和载药密度可调的载药水凝胶，药物包合在β-环糊精的疏水空腔中，不影响其作用效果的同时实现缓释，延长作用效果。光交联水凝胶溶液中包载干细胞，可原位注射紫外光固化，对损伤部位进行填充修复。本发明将干细胞、生物材料、亲脂药物分子(调节干细胞分化)三者进行有机结合，具有重要的研究意义和临床实践价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所提供的环糊精-药物主客体超分子修饰的水凝胶的制备方法，具体是：采用同时含异氰酸酯和碳碳双键官能团的化合物与β-环糊精反应，获得双键改性后的β-环糊精衍生物(后边简写为β-cd-aoi)；然后在水相中使环糊精衍生物与亲脂药物疏水包合获得主客体超分子，将其加入到预交联的水凝胶溶液中。待加入干细胞混合分散均匀后，注射到组织缺损部位，并在光引发剂作用下紫外交联固化，形成载药载干细胞的β-环糊精-药物主客体超分子修饰的水凝胶体系，用来修复组织损伤。
其中，同时含异氰酸酯和碳碳双键官能团的化合物有甲基丙烯酸异氰基乙酯或异氰酸酯丙烯酸乙酯。亲脂药物有kartogenin或褪黑素，亲脂药物分子量<500。调控异氰酸酯化合物与β-环糊精的摩尔配比，得到不同平均双键接枝个数的β-环糊精范围：1～2个。水凝胶基质由接枝双键后明胶、透明质酸组成。光交联引发剂可选用水溶性无细胞毒性的生物用引发剂：i2959、lap。紫外光照强度范围在5.6mw～15.0mw。水凝胶封装具有快速增殖和多项分化潜能的干细胞，可采用脂肪间充质干细胞(adscs)、骨髓间充质干细胞(bmscs)等。
从以下实施案例将进一步理解本发明。
实施案例1
一、光交联水凝胶原料的制备
(1)将4g(400-1000kda)的透明质酸溶于dpbs溶液中与8.7ml过量甲基丙烯酸酐混合，调节ph至7.5-8.5，4℃下反应3h后室温反应过夜，乙醇沉淀，水中透析5天除去小分子残留，冻干得双键改性后的透明质酸粉末即hama。
(2)将真空干燥完全除去水分后的β-环糊精(1eq)与甲基丙烯酸异氰基乙酯(2eq)在dmf溶剂中充分溶解混合后，加入微量的sn(oct)2(3μm)作为催化剂，在氮气气氛的保护下室温反应4h。然后将产物倒入10倍体积的冰丙酮沉淀，真空干燥得到β-环糊精双键改性产物：β-cd-aoi。
二、亲脂药物与的主客体结合
在避光低温的条件下，将β-cd-aoi与亲脂性药物分子kartogenin在超纯水中搅拌24h，形成透明均一的溶液。冻干得白色粉末于-80℃温度下保存。
三、制备载细胞的β-环糊精-药物主客体超分子修饰的水凝胶
将β-cd-aoi与kartogenin形成的主客体超分子分散于2％hama的溶液中，加入0.5％的i2959引发剂，以上试剂和材料均进行无菌处理。最后加入干细胞adscs混合均匀后，注射到软骨损伤缺口处，在15mw的紫外光下，室温交联1min。加快软骨修复进程。
实施案例2
一、光交联水凝胶原料的制备
(1)gelma的合成：首先将明胶(typea,15g)溶解于150ml的dpbs溶液中(ph7.4)，在40℃下与甲基丙烯酸酐反应3h后加入过量的25℃dpbs溶液稀释终止反应进程，于40℃透析5天，冻干备用。
(2)与实施案例1不同的是本实施案例采用异氰酸酯丙烯酸乙酯与β-环糊精反应，且投料比为β-环糊精：异氰酸酯丙烯酸乙酯＝1：1。
二、亲脂药物与β-环糊精的主客体结合
与实施案例1不同的是本实施案例是将β-cd-aoi与褪黑素在超纯水中搅拌24h，形成主客体超分子。冻干备用。
三、制备载细胞的环糊精-药物主客体超分子修饰的水凝胶
与实施案例1不同的是，得到主客体超分子分散于10％gelma的溶液中，加入0.5％的lap引发剂后与干细胞bmscs混合均匀后，紫外光强度采用10.0mw，注射于骨缺损处，交联2min，用于骨组织的修复。
实施案例3
与实施案例1、2不同的是，本实施案例是结合前面两者，将β-cd-aoi与褪黑素的主客体超分子分散于10％gelma的溶液中，加入0.5％的i2959引发剂，与干细胞bmscs混合均匀后注射到骨软骨缺损的下层处，根据在5.6mw的紫外光下，室温交联2min。将β-cd-aoi与kartogenin的主客体超分子分散于2％hama的溶液中，加入0.5％的i2959引发剂，加入干细胞bmscs混合均匀并注射至gelma初步交联水凝胶的上层，2min后在5.6mw的紫外光下，室温交联5min。得到β-环糊精-药物主客体超分子修饰的双相水凝胶，当用于骨软骨修复时要考虑骨与软骨层的厚度，注射相应的光交联水凝胶溶液。可用于同时修复骨软骨层的损伤。
以上所述实施例只为本发明之较佳实施例，并非以此限制本发明的实施范围，故凡依本发明之形状、原理所作的变化，均应涵盖在本发明的保护范围内。