一种基于RAA荧光法快速检测人鼻病毒的引物、探针及检测试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是涉及一种基于raa荧光法检测人鼻病毒的引物、探针及检测试剂盒。

背景技术：

人鼻病毒(humanrhinovirus，hrv)与流感病毒、呼吸道合胞病毒仪器被认为是儿童呼吸道感染的主要致病病毒，是引起呼吸道感染最主要病毒之一。人鼻病毒是在1956年由price组织培养的方法分离出第一株后，先后从感冒患者中分离出多种细胞株，至今鉴定的血清型已超过120多种，是人类血清型最多的病毒，c型基因变化显著。人鼻病毒与其他呼吸道病毒相比，可导致大约三分之二的普通感冒以及其他疾病。人鼻病毒不仅是婴儿和儿童上呼吸道感染的重要病原，还能引起肺炎、细支气管炎、哮喘急性发作。而在成年人中多引起伴有免疫力低下或慢性阻塞性肺疾病患者的下呼吸道感染。人鼻病毒的感染具有自限性，有时会引起诸如包囊纤维化等并发症，并且多与其他呼吸道病毒合并感染，例如呼吸道合胞病毒、腺病毒以及副流感病毒等。人鼻病毒主要通过呼吸道传播，感染后表现为普通感冒，临床症状如头疼、喷嚏、流涕、咽喉肿痛等。症状一般在16h内出现，并在24-48h达到高峰，病程可持续一周。人鼻病毒感染在四个季节均可发生，通常在春季和秋季达到高峰。

人鼻病毒属小核糖核酸病毒科肠道病毒属，是小核糖核酸病毒家族9个种属之一。该病毒是一种单股正链的rna病毒，基因组大约7200bp，具有单一的开放性读码框和一股短肽构成的5'非编码区。其直径约为25-30nm，呈二十面体对称结构，无脂质被膜，由4种蛋白亚单位vp1、vp2、vp3和vp4构成了60个壳粒的原体。其中vp1是产生保护性抗体的主要抗原。基于对vp4/vp2基因片段的系统进化分析，可将人鼻病毒分为a、b、c三个亚型，三个亚型的基因组具有相同的基因结构。由于没有脂质包膜，鼻病毒在有机溶剂如乙醚、氯仿、乙醇以及5％的苯中失去活性。人鼻病毒有相应的热敏感性，但加热到50℃-56℃会丧失感染性。

近年来，在国内外均有过人鼻病毒暴发流行的报道，严重威胁着人类特别是的健康。目前，人鼻病毒的实验室检测方法主要包括病毒分离培养法检测、血清学诊断、血清抗体检测及分子生物学方法检测。

1病毒分离培养法

病毒分离通常是人鼻病毒感染检测的金标准。该方法是将临床标本接种于敏感细胞，通过观察细胞病变，可以观察期致病性，同时还可以使病毒增值。人鼻病毒最初是从原代猴肾细胞中分离出来的。现阶段人胚肺成纤维细胞、部分hela克隆细胞和人胚肾细胞系最常用于临床试验中的人鼻病毒培养。但是由于细胞病变一般2-7天出现，因此该方法周期较长，且比较繁琐，不宜用于人鼻病毒的快速检测。

2血清抗体检测

病毒的血清学诊断，通常需要在得病后的1-2周才能检测到，iga主要出现在鼻腔的分泌物中，而igg主要出现在血清中。人鼻病毒的多种血清型及缺乏共同的抗原将会导致盲目的血清学实验毫无意义。

3分子生物学方法

3.1逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)

rt-pcr是以待检测病毒rna为模板，先利用逆转录酶进行逆转录反应生成cdna，再以相应的特异性引物对cdna进行扩增，鉴定样本中是否存在人鼻病毒核酸。张志勇等收集的重庆医科大学儿童医院呼吸科住院的部分急性呼吸道感染患儿的鼻咽深部吸取物390份，并针对5'utr保守区设计引物，以rna为模板建立了rt-pcr法。结果390例样本中阳性61例，阳性率为15.6％。阳性经过测序与genbank比对均证实为人鼻病毒。

3.2实时荧光定量rt-pcr

实时荧光定量pcr是在pcr体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。赖建辉等以人鼻病毒5'utr为检测靶基因，设计引物和探针，建立了实时荧光定量rt-pcr法检测人鼻病毒，评价该方法的特异性、灵敏性和重复性，并用该方法对384份临床呼吸道感染样本进行检测。结果该病毒与流感病毒、合胞病毒等均无交叉反应，具有较好的特异性，并且检测下限可达10拷贝/μl。表明该方法具有快速、灵敏、特异性强等优点，适用于人鼻病毒的早期诊断。

3.3全基因组测序技术

通过对人鼻病毒全基因组序列测定，不仅可以发现病毒的变异与重组，还可以追溯到某种基因型的起源是否存在病毒的多条传播链。jennifer等通过测定hrv-a101的全基因组序列发现，其是由hrv65和hrv-78重组形成的一个新基因型，hrv-a101的5'utr部分与hrv-78相一致，编码区和3'utr部分与hrv-65相一致。

综上所述，传统的检测方法受制于其血清型多(至少有100多个)，检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制，且c型鼻病毒在传统的细胞培养中并不能生长，这样就会造成c型鼻病毒漏检。由于人鼻病毒具有众多血清型，缺乏合适的交叉反应抗原，使得血清型方法检测人鼻病毒抗体受到很大限制。分子生物学诊断方法可以在病毒血症时期检测到病毒的感染，并且快速灵敏，目前已被广泛的应用于人鼻病毒的检测。依据聚合酶链式反应(pcr)检测人偏肺病毒的几种分子方法如rt-pcr、实时荧光定量rt-pcr已经建立起来，大大缩短了检测的时间。但是这些方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，但是这些方法不仅需要相关的昂贵仪器设备且需要有专业技术人员操作，因此在基层和现场的检测应用受到很大限制；整体实验时间在2－4小时。等温核酸技术中的lamp方法克服了pcr技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点。但是，lamp技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，假阳性率也比较高，容易发生交叉污染。

重组酶介导的等温核酸扩增技术(简称为raa技术)是一种利用重组酶代替pcr高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止dna链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以dna为模板合成目的产物，反应在30-42℃下条件下进行5-20分钟完成扩增。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种基于raa荧光法检测人鼻病毒的引物。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种基于raa荧光法检测人鼻病毒的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为：ctggygacagtgttcyagcctgcgtggctgc；所述下游引物序列为：acacggacacccaaagtagtyggtcccrtc。

本发明的第二个目的在于，针对现有技术的不足，提供一种基于raa荧光法检测人鼻病毒的探针。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种基于raa荧光法检测人鼻病毒的探针，其特征在于，所述探针的序列为：gtgtgctcgyyttgagtcctccggcccctgaatgcggctaacctt。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：

优选地，所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数29bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数13bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔3个碱基gaa，中间位置的碱基a用四氢呋喃残基替换。

优选地，所述荧光报告基团包括fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5，优选为fam或hex。

优选地，所述荧光淬灭基团包括tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl，优选为bhq1或bhq2。

优选地，修饰后的探针优选为：gtgtgctcgyyttgagtcctccggcccc(bhq1-dt)g(thf)a(fam-dt)gcggctaacctt。

本发明还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种基于raa荧光法检测人鼻病毒的检测试剂盒。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种基于raa荧光法检测人鼻病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：引物、如前文所述的探针、raa荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为：ctggygacagtgttcyagcctgcgtggctgc；所述下游引物序列为：acacggacacccaaagtagtyggtcccrtc。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：

优选地，所述上游引物和下游引物的浓度分别优选为0.01～0.1mm，更优选为0.05mm。

优选地，所述探针的浓度优选为0.02～0.07mm，更优选为0.03mm。

优选地，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为300mm的tris-hcl缓冲液(ph＝8.0)、浓度为280mm的mgac和质量分数为20％的peg20000。

优选地，所述阳性质控品中含有人鼻病毒的基因组dna；所述人鼻病毒的基因组dna的浓度为1×10⁴copies/ul。

优选地，所述阴性质控品为ddh2o或纯化水。

本发明提供一种基于raa荧光法检测人鼻病毒的引物、探针及检测试剂盒，所述引物和探针适用于raa荧光法检测，并且能够准确地检测出人鼻病毒，特异性能够达到100％，所述检测试剂盒能够方便快速且准确地鉴定人鼻病毒，操作方便，检测时间短，15min内可以完成检测，无需像pcr一样通过高温95℃变性使dna解旋，再在50～60℃退火，最后在72℃完成延伸，只需在30～42℃下进行等温扩增即可完成检测。也无需像lamp技术一样使用4-6条引物在65℃情况下进行扩增且容易产生假阳性。

检测试剂盒所用的检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，研究表明本发明提供的基于raa荧光法快速检测人鼻病毒的试剂盒，检测人鼻病毒时与其他呼吸道病毒如腺病毒(ad)、人偏肺病毒(mpv)、人博卡病毒(bov)、呼吸道合胞病毒(rsv)、甲流病毒、乙流病毒无交叉反应，具有特异性强，特异性达100％。灵敏度高，每反应检测灵敏度达到为10copies。

本发明提供的基于raa荧光法快速检测人鼻病毒的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。

附图说明

图1为不同引物组合质粒dna检测结果。

图2为不同浓度质粒dna灵敏度检测结果。

图3为与常规荧光定量pcr的比较试验结果。

图4为人鼻病毒质粒dna重复性检测结果。

图5为人鼻病毒的特异性检测结果。

图6为人鼻病毒样本rna检测结果。

具体实施方式

参照附图和具体实施例对本发明作进一步地详细地描述。

本发明提供了一种基于raa荧光法快速检测人鼻病毒的引物、探针及检测试剂盒，其实现方法有以下几个步骤：

1)选择正确的人鼻病毒保守序列进行引物探针设计；

2)选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团；

3)合成引物探针；

4)合成阳性质粒；

5)制备阳性质粒标准品；

6)筛选灵敏度高的引物探针；

7)用筛选出来的引物探针进行raa荧光检测实验；

8)提取人鼻病毒样本rna进行验证。

根据基因名称人鼻病毒，在genebank中找到相应的全基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用dnastar软件进行同源性分析和b1ast序列分析，筛出人鼻病毒高度保守序列如下：

tagacctggcagatgaggctggaaaatccccactggcgacagtgttccagcctgcgtggctgcctgcacacccatacgggtgtgaagccaaatattggacaaggtgtgaagagccccgtgtgctcgtcttgagtcctccggcccctgaatgcggctaaccttaaccccacagccattgcttgcattccagcaagtctatggtcgtaatgagcaattgtgggatgggaccgactactttgggtgtccgtgtttcacttt

以高度保守序列作为检测目的基因，合成阳性质粒并进行引物探针设计；

引物设计包括上游引物和下游引物，设计上游引物为ctggygacagtgttcyagcctgcgtggctgc；下游引物为acacggacacccaaagtagtyggtcccrtc；

根据以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成dna质粒，质粒大小250bp；

1、引物探针设计

采用raa技术引物及探针设计原则进行的设计，通过筛选和评价，确定上游引物：

5’-ctggygacagtgttcyagcctgcgtggctgc-3’

下游引物：

5’-acacggacacccaaagtagtyggtcccrtc-3’

探针序列为：

gtgtgctcgyyttgagtcctccggcccctgaatgcggctaacctt

2、选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团

根据实验仪器采用的是无锡奇天生物科学仪器有限公司生产的raa-f1620荧光基因检测仪，所检测的荧光为fam荧光，因此荧光修改基团选为fam，荧光淬灭基团选为bhq1；

也可以根据仪器检测荧光的性能，将荧光修饰基团选择为hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5；荧光淬灭基团选择tamra、eclipse、bhq2、bhq3或dabcyl；

但优选荧光修饰基团为fam、hex，优选荧光淬灭基团为bhq1、bhq2。

3、探针的修饰方法优选包括：荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数14bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数29bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔3个碱基gac，其中碱基a用四氢呋喃残基替换；经过修饰的探针为：gtgtgctcgyyttgagtcctccggcccc(bhq1-dt)g(thf)a(fam-dt)gcggctaacctt；

4、引物探针及质粒均委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

5、质粒阳性标准品制备

重组质粒通过转接大肠杆菌培养并提取，得到质粒后用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算，按浓度梯度稀释制备成1.0×10¹copies/ul-1.0×10¹⁰copies/ul备用。

6、组成试剂盒

基于raa荧光法快速检测人鼻病毒的试剂盒，包括raa荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阳性质控品、阴性质控品，引物和探针；

上游引物和下游引物的浓度独立优选为0.02～0.1mm，更优选为0.05mm。

探针的浓度优选为0.02～0.07mm，更优选为0.03mm。

试剂盒中包括raa荧光通用反应试剂，raa荧光通用反应试剂优选为经过低温冷冻干燥的冻干粉。本发明实施例中raa荧光通用反应试剂购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为f00001，反应规格为50ul,使用前用反应缓冲液进行重溶。

重溶raa反应缓冲液优选包括以下含量的组分：浓度为300mm的tris-hcl(ph＝8.0)缓冲液、浓度为280mm的mgac和质量分数为20％的peg20000。本发明中，tris-hcl缓冲液、mgac和peg20000的浓度均为终浓度。本发明对tris-hcl缓冲液、mgac和peg20000的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明实施例中tris-hcl、和peg20000的购自sigma-aldrich，mgac购自国药沪试。

试剂盒包括阳性质控品。阳性质控品中优选含有人鼻病毒的基因组dna。人鼻病毒的基因组dna的浓度优选为1×10⁴copies/ul。本发明实施例中阳性质控品通过重组质粒转接大肠杆菌培养并提取。

试剂盒包括阴性质控品。阴性质控品优选为ddh2o或纯化水。

在本发明中，上述方案的raa荧光法检测人鼻病毒的试剂盒的使用方法，优选包括如下步骤：

(1)提取待测样品(人鼻病毒样本)，按rna提取方法(采用市售商品化的病毒核酸提取试剂)进行提取，按提取试剂盒说明书进行操作。本发明中采用西安天隆的核酸自动提取仪，选用西安天隆的配套病毒rna核酸提取试剂进行rna的提取；提取得到的rna-20℃保存备用；待测样本由浙江国际旅行保健中心提供。

(2)将检测仪器raa-f1620接通电源进行预热，对反应参数进行设置，反应参数设置为39℃，反应时间：20min。

(3)将提取得到的rna进行体外反转录，反转录酶选promegam-mlv(200u/μl)或takaram-mlv(200u/μl)，体外反转录过程中加入反转录酶的量按不同厂家的说明书中的推荐使用量。本发明中的优选方法是直接在每个raa荧光通用反应试中加入反转录酶0.1-0.5μl，优选为加入0.3μl；直接实现一步法rt-raa检测人鼻病毒；

(4)在42.7μl反应缓冲液中加入1μl探针和1μl引物，0.3μl反转录酶充分混合后添加到raa荧光通用反应试剂中混合；得到反应预混液；

(5)将5μl步骤(1)中得到的rna提取液与步骤(3)中得到的反应混合液充分混合，得到的反应体系进行放入检测仪器raa-f1620进行检测荧光信号；

(6)根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，将斜率值k≥20时，判定为阳性。斜率值k＜20时判定为阴性；也可以按按扩增曲线来判定，有明显扩增的判定为阳性，无扩增的判定为阴性。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：引物筛选实验

上游引物：

f1:5’-gtgttcyagcctgcgtggctgcctgcacac-3’

f2:5’-ctggygacagtgttcyagcctgcgtggctgc-3’；

f3:5’-cactggygacagtgttcyagcctgcgtggc-3’；

下游引物：

r1:5’-acacggacacccaaagtagtyggtcccrtc-3’；

r2:5’-gaaacacggacacccaaagtagtyggtccc-3’；

r3:5’-gtyggtcccrtcccacaattgctcattacgac-3’；

探针序列为：

gtgtgctcgyyttgagtcctccggcccctgaatgcggctaacctt

采用荧光报告基团(fam)和荧光淬灭基团(bhq1)修饰探针；

修饰后的探针为：

gtgtgctcgyyttgagtcctccggcccc(bhq1-dt)g(thf)a(fam-dt)gcggctaacctt；

试剂盒组成如表1所示，表1为试剂盒成分表：

表1

制备好的重组质粒工作标准品，分别为：

工作标准品1，含有0.2×10³copies/ul人鼻病毒质粒非传染性dna片段。

引物筛选实验的实施方法为：

(1)反应缓冲液的配制

从试剂盒中反应缓冲液管里吸取430μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlpe管，再加入20μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.05mm，引物的浓度为0.03mm)，再加入50μl工作标准品，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。

(2)raa荧光反应试剂重溶

准备9个raa荧光基础反应试剂，吸取步骤1中混匀的反应缓冲液50μl分别加入到准备好的9个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为raa反应体系。

(3)反应

在以上9个配制好的raa荧光基础反应试剂试管放入raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图1所示。结果显示引物对f2/r1扩增效果最好，表明为本发明的最佳引物。

实施例2：灵敏度实验

上游引物：

5’-ctggygacagtgttcyagcctgcgtggctgc-3’

下游引物：

5’-acacggacacccaaagtagtyggtcccrtc-3’

探针序列为：

gtgtgctcgyyttgagtcctccggcccctgaatgcggctaacctt

采用荧光报告基团(fam)和荧光淬灭基团(bhq1)修饰探针；

修饰后的探针为：

gtgtgctcgyyttgagtcctccggcccc(bhq1-dt)g(thf)a(fam-dt)gcggctaacctt；

试剂盒组成如表1所示。

制备好的重组质粒工作标准品，分别为：

工作标准品1，含有0.2×10⁶copies/ul人鼻病毒质粒非传染性dna片段。

工作标准品2，含有0.2×10⁵copies/ul人鼻病毒质粒非传染性dna片段。

工作标准品3，含有0.2×10⁴copies/ul人鼻病毒质粒非传染性dna片段。

工作标准品4，含有0.2×10³copies/ul人鼻病毒质粒非传染性dna片段。

工作标准品5，含有0.2×10²copies/ul人鼻病毒质粒非传染性dna片段。

工作标准品6，含有0.2×10¹copies/ul人鼻病毒质粒非传染性dna片段。

灵敏度实验的实施方法为：

(1)反应缓冲液的配制

从试剂盒中反应缓冲液管里吸取344μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlpe管，再加入16μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.05mm，引物的浓度为0.03mm)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。

(2)raa荧光反应试剂重溶

准备7个raa荧光基础反应试剂，吸取步骤1中混匀的反应缓冲液45μl分别加入到准备好的7个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为raa反应体系。

(3)加样反应

在以上7个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中分别加入5μl阴性质控品、5μl标准工作品6、5μl标准工作品5、5μl标准工作品4、5μl标准工作品3、5μl标准工作品2、5μl标准工作品1为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μl。

将反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图2所示。结果显示最快5分钟明显有扩增，15分钟内所有标准工作品均有扩增，每个反应管灵敏度可以达到1.0×10¹copies，即在每个反应管中存在10copies，就可以在15分钟内检测出来，表明本发明灵敏度高。

(4)常规荧光定量pcr比较试验

以上海之江人鼻病毒核酸检测试剂盒为比较试剂盒，根据试剂盒说明书配置反应体系(19μl反应液、1μl酶液、)，在反应体系中分别加入5μl阴性质控品、5μl标准工作品6、5μl标准工作品5、5μl标准工作品4、5μl标准工作品3、5μl标准工作品2、5μl标准工作品1为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为25μl。

将反应管放入abivii7荧光pcr仪中，设定反应条件为45℃-10min、95℃-15min；再按95℃-15sec→60℃-60sec循环40次。检测结果如图3所示。结果显示上海之江人鼻病毒核酸检测试剂盒灵敏度下限为1.0×10²copies，而本发明灵敏度可以达到1.0×10¹copies，表明本发明灵敏度高于传统荧光pcr检测方法。

实施例3：重复性实验

引物探针及阳性质控品序列与实施例2相同。

试剂盒组成如表1所示。

重复性实验的实施方法为：

(1)反应缓冲液配制：

从试剂盒中反应缓冲液管里吸取215μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlpe管，再加入10μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.03mmol/，引物的浓度为0.05mm)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。

(2)raa荧光基础反应试剂重溶

准备4个raa荧光基础反应试剂，每次吸取45μl步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的4个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为raa反应体系，并做好标记。

(3)加样反应

在以上4个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中分别加入5μl阴性质控品、其他3个反应管中分别加入5μl人鼻病毒质粒dna；每加好一个样就盖好管子盖子。加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μl。

混匀的4个反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图4所示。结果显示扩增反应重复性好。

实施例4：特异性实验

引物探针及阳性质控品序列与实施例2相同。

试剂盒组成如表1所示。

特异性实验的实施方法为：

特异性实验中腺病毒(ad)、人偏肺病毒(mpv)、人博卡病毒(bov)、呼吸道合胞病毒(rsv)、甲流病毒、乙流病毒样本来源

其中呼吸道合胞病毒(rsv)、腺病毒(ad)的rna由中国疾病预防控制中心病毒病预防所提供，人偏肺病毒(mpv)、人博卡病毒(bov)、甲流病毒、乙流病毒、人鼻病毒样本由浙江国际旅行保健中心提供，并通过西安天隆全自动核酸提取仪提取病毒rna，-80℃保存备用。

实施方法：

(1)反应缓冲液的配制

样本rna反应缓冲液配制：从试剂盒中反应缓冲液管里吸取360μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlpe管，再加入18μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.03mmol/，引物的浓度为0.05mm)，再加入2.7μlpromegam-mlv(200u/μl)反转录酶，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。

(2)raa荧光基础反应试剂重溶

准备8个raa荧光基础反应试剂，每次吸取45μl步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的8个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为raa反应体系，并做好标记。

(3)加样反应

在以上8个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中分别加入5μl阴性质控品、5μl腺病毒(ad)rna、5μl人偏肺病毒(mpv)rna、5μl人博卡病毒(bov)rna、5μl呼吸道合胞病毒(rsv)rna、5μl甲流病毒rna、5μl乙流病毒rna、5μl人鼻病毒rna；每加好一个样就盖好管子盖子，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μl。

(4)检测

将混匀的8个反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图5所示。结果显示只有人鼻病毒样本rna有扩增，为阳性，其他样本如腺病毒(ad)、人偏肺病毒(mpv)、人博卡病毒(bov)、呼吸道合胞病毒(rsv)、甲流病毒、乙流病毒样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。表明本发明提供的检测方法特异性强。

实施例5：样本实验

引物探针及阳性质控品序列与实施例2相同。

试剂盒组成如表1所示。

样本实验的实施方法为：

(1)反应缓冲液配制：

从试剂盒中反应缓冲液管里吸取128.1μl反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlpe管，再加入6μl探针与引物的混合物(探针的浓度为0.03mmol/，引物的浓度为0.05mm)，再加入0.9μlpromegam-mlv(200u/μl)反转录酶，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。

(2)raa荧光基础反应试剂重溶

准备3个raa荧光基础反应试剂，每次吸取45μl步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的3个raa荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为raa反应体系，并做好标记。

(3)加样反应

在以上3个配制好的raa荧光基础反应试剂试管中分别加入5μl阴性质控品、其他2个反应管中分别加入5μl提取好的人鼻病毒样本rna和5μl阳性质控品；每加好一个样就盖好管子盖子。加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μl。

将混匀的3个反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图6所示。结果显示人鼻病毒样本rna和阳性质控品有扩增，阴性质控品无扩增，能满足快速检测人鼻病毒样本rna的目的。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江国际旅行卫生保健中心(浙江出入境检验检疫局口岸门诊部)

江苏奇天基因生物科技有限公司

<120>一种基于raa荧光法快速检测人鼻病毒的引物、探针及检测试剂盒

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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