猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法及其应用与流程

本发明涉及生物分子学领域，特别是指猪δ冠状病毒taqman荧光定量rt-pcr检测方法及其应用。

背景技术：

猪δ冠状病毒pdcov是一种新发的猪肠道冠状病毒，属于冠状病毒科，deltacoronavirus病毒属，为有囊膜的单股正链rna病毒。pdcov最早于2012年从猪粪便样品中检测到，并进行了病毒全基因组序列测定。2014年，美国俄亥俄州、伊利诺伊州等猪场相继爆发仔猪腹泻，之后20多个州的猪场都检测到pdcov，并首次分离到pdcov。随后在韩国、泰国等多个亚洲国家也检测到pdcov感染仔猪，我国也普遍存在pdcov感染的现象。pdcov可以感染各个年龄段的猪，但以新生仔猪为主，临床症状主要表现为腹泻、呕吐。与猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，pedv）及传染性胃肠炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirus,tgev）引发的疾病症状非常相似，是当前严重危害世界各国养猪业的重要病毒性腹泻病毒之一，给猪场带来了一定的经济损失。

目前，pdcov的检测方法主要有elisa、rt-pcr、巢氏rt-pcr等，这些方法在pdcov的检测中发挥了重要作用，但存在敏感性不高、稳定性较差的问题。本申请旨在建立一种快速、高效、特异性检测pdcov的taqman荧光定量rt-pcr检测方法，并用此方法对河南地区收集的100份猪场临床样品进行检测，为pdcov流行病学调查提供一定的理论依据。

技术实现要素：

本发明提供了猪δ冠状病毒taqman荧光定量rt-pcr检测方法及其应用，以pdcov防控为目的，选取pdcovm基因的保守序列，建立了taqman荧光定量rt-pcr检测方法，可用于该病毒的分子流行病学调查和疫病的监测监控，了解该病毒在我国的流行情况，解决了快速、灵敏检测猪δ冠状病毒的技术问题。

本发明的技术方案如下：

猪δ冠状病毒taqman荧光定量rt-pcr检测方法，步骤如下：

（1）猪δ冠状病毒的荧光定量引物和探针的设计；

（2）荧光定量rt-pcr检测分别以浓度梯度为1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μl的标准质粒为模板，以猪δ冠状病毒的定量引物为引物，并加入taqman探针、2×premixextaq和去离子水组成的反应体系进行荧光定量rt-pcr；

（3）以荧光定量rt-pcr检测到的ct值为y轴，以标准质粒的浓度为x轴，建立标准曲线，其标准方程为y=-3.272x+42.37，相关系数r²为0.992；

（4）将步骤（2）反应体系中的标准质粒换成待测质粒，按照步骤（2）中的体系和反应条件进行荧光定量rt-pcr，并记下ct值，代入标准方程即得待测质粒的浓度，即为待测样品中猪δ冠状病毒的浓度。

所述步骤（1）中荧光定量引物为pdcov-f2序列如gactccttgcagggattatgg所示和pdcov-r2序列如gcttaacgactggtgtgagaa所示；taqman探针序列如fam-atgggtacatggaggtgcattccc-tamra所示。

所述步骤（2）中荧光定量rt-pcr的反应体系为：2×premixextaq12.5μl，浓度为10μmol/l的引物pdcov-f2/pdcov-r2，各1μl，浓度为5μmol/l的taqman探针1μl，cdna模板2μl，加去离子水至25μl；反应程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

所述步骤（2）中标准质粒的制备方法为：根据genbank中登录的pdcov基因组序列及其m基因序列，设计m基因的引物，以pdcov阳性样品cdna为模板，扩增得到包含m基因全长的一段序列片段（715bp序列如seqidno:1所示），然后将该片段克隆到pmd18-t载体中，筛选阳性克隆并进行测序验证，所得重组质粒即为标准质粒。

所述m基因的引物为pdcov-f1：ctatgtctgacgcagaagagtg、pdcov-r1：gatgtgccgcttattgca。

所述的猪δ冠状病毒taqman荧光定量rt-pcr检测方法在快速、灵敏检测猪δ冠状病毒中的应用，所述荧光定量rt-pcr检测方法的最低检测限为10拷贝/μl。

本发明的有益效果在于：

（1）本申请所建立的taqman荧光定量pcr检测方法，最低检测限为10拷贝/μl，具有极高的敏感性，敏感性远远高于常规pcr检测方法。此外，相较于染料荧光pcr检测方法，taqman探针定量pcr技术具有更高的稳定性与特异性，批内与批间重复试验的变异系数cv均小于1%，重复性更高，因此通过临床样本检测的验证，确保了所建立方法的可靠性。

（2）用本申请所建立的taqman探针荧光定量pcr检测方法和实验室已有的sybrgreeni荧光定量pcr检测方法，同时对100份猪腹泻病料样品核酸进行检测，发现二者的检出结果一致，阳性检出率为23%（23/100），与韩丽等报道的河南省111份腹泻病料中pdcov的阳性率为19.82%，韦学雷等报道的河南省176份猪腹泻病料中pdcov阳性率为18.18%相比，感染率已经有了明显升高。

（3）本申请的样品均为爆发腹泻的猪群中收集得到，表明pdcov是当前引起猪群腹泻的重要病原之一，河南省不同地区猪场的pdcov的感染情况当前较为普遍，且有上升的趋势，pdcov在仔猪体内的感染及致病性是不容忽视的问题，在猪病防控中应当引起重视。也进一步证实此次建立的taqman探针荧光定量pcr检测方法灵敏性更高，可用于临床pdcov的流行病学调查和监测，对于该病原的监视和流行趋势判断可提供一定的技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为pdcovtaqman探针荧光定量rt-pcr标准曲线。

图2为pdcovtaqman探针荧光定量rt-pcr敏感性试验图。

图3为pdcovtaqman探针荧光定量rt-pcr特异性试验图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样品与毒株临床检测样品为2017-2018年河南不同地区爆发腹泻猪场采集的粪样、肠道组织等病料。pdcov(ch-01)、pedv、tgev、猪圆环病毒2型（porcinecircovirustype2，pcv2）、猪圆环病毒3型（porcinecircovirustype3，pcv3）、猪伪狂犬病毒（pseudorabiesvirus，prv）、猪瘟病毒（classicalswinefevervirus，csfv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiverespiratorysyndromevirus，prrsv）均由河南省动物性食品安全重点实验室鉴定并保存。

1.1.2主要试剂及仪器反转录试剂盒购自qiagen生化科技公司（北京）；premixextaq^tm、pmd18-t载体、dh5α感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司；dl2000dnamarker购自康为世纪生物科技有限公司（北京）；dna凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物公司；rna提取试剂盒购自上海捷瑞生物技术有限公司；cfx96实时荧光定量pcr仪购自bio-rad公司（美国）。

1.1.3标准质粒构建根据genbank中登录的pdcov基因组序列（jq065043）及相应的m基因序列，设计引物（表1），以pdcov阳性样品cdna为模板，扩增得到包含m基因片段（715bp序列如seqidno:1所示），将该片段克隆到pmd18-t载体中，筛选阳性克隆并进行测序验证。将所得重组质粒用nanodrop测定浓度，计算拷贝数，稀释成1.0×10⁰-1.0×10⁹拷贝/μl，作为模板标准品。

表1pdcovm基因引物

1.1.4定量引物、探针的设计与合成根据1.1.3中构建的标准质粒中pdcov基因序列，应用primer5.0基因分析软件设计一对特异性引物和taqman探针（表2）。引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表2pdcov定量引物与探针

1.2试验步骤

1.2.1荧光定量pcr反应条件与反应体系优化荧光定量pcr仪上对反应条件与反应体系进行优化。以1.0×10⁵拷贝/μl的标准质粒为模板，在25μl反应体系中分别加入终浓度为0.20、0.40、0.60、1.00μmol/l的引物f2/r2和终浓度为0.10、0.20、0.30、0.40μmol/l的探针，选取最佳引物浓度与探针浓度。此外，荧光定量pcr分别以54、56、58、60、62℃的熔解温度进行反应，确定最佳的熔解温度。

通过对不同浓度引物、探针、熔解温度的反应条件与反应体系进行优化，最终确定优化后的最佳反应体系为2×premixextaq12.5μl，f2/r2（10μmol/l）各1μl，taqmanprobe（5μmol/l）1μl，cdna模板2μl，加去离子水至25μl。最终确定的反应参数为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

1.2.2构建标准曲线以1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μl的标准质粒为模板，采用优化后的反应体系与反应条件进行荧光定量pcr扩增，根据所得的ct值与标准质粒浓度之间的线性关系，进行标准曲线绘制。

按照优化后的taqman荧光定量pcr检测方法，对1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μl的标准质粒进行定量检测，以ct值为y轴，以1.00×lg（标准质粒，拷贝/μl）为x轴建立标准曲线，其标准方程为y=-3.272x+42.37，相关系数r²为0.992（图1），表明ct值与模板量之间呈良好的线性关系。本方法判定标准：ct值低于35，且出现典型的扩增曲线的样品为阳性；ct值大于35或无有效ct值的样品判为阴性。

1.2.3敏感性试验以1.0×10⁰-1.0×10⁹拷贝/μl的标准质粒为模板，进行该检测方法的敏感性测定，根据所得溶解曲线，获得本申请所建立检测方法的最低检出拷贝数。

以1.0×10⁰-1.0×10⁹拷贝/μl的标准质粒为模板，使用建立的taqman荧光定量pcr检测方法，进行敏感性检测。结果显示最低检出量为1.0×10¹拷贝/μl（图2），敏感性高于本实验室之前建立的pdcovsybrgreenі荧光定量检测方法。

1.2.4特异性试验按照建立的荧光定量pcr反应体系，分别以保存的阳性pedv、tgev、pcv2、pcv3、prv、csfv、prrsv核酸为模板，同时设1.0×10⁴拷贝/μl标准质粒为阳性对照，以去离子水为阴性对照，进行pcr扩增以检测该方法的特异性。

以1.0×10⁴拷贝/μl标准质粒为阳性对照，按照建立的荧光定量pcr反应体系，检测pedv、tgev、pcv2、pcv3、prv、csfv、prrsv核酸样品，未出现阳性扩增（图3），结果表明建立的方法具有良好的特异性。

1.2.5重复性试验选取1.0×10²、1.0×10⁴、1.0×10⁵拷贝/μl的标准质粒分别作为模板，进行3次批内与批间荧光定量pcr反应扩增，根据ct值计算批内与批间的变异系数，进行该方法重复性的验证。

选取1.0×10³、1.0×10⁵、1.0×10⁸拷贝/μl的标准质粒分别作为模板，进行3次批内与批间荧光定量pcr反应扩增，同一质粒浓度的ct值在批次内与批次间都较为稳定，进行统计学分析，计算批内与批间的变异系数，发现3次重复的变异系数（cv）均小于1%（表3），表明本方法的重复性较好。

表3荧光定量pcr批内、批间重复性检测

1.2.6临床样本检测应用本申请建立的taqman荧光定量pcr方法检测2017-2018年间河南省不同猪场收集的100份腹泻病料，与本实验室已经建立的pdcovsybrgreenі荧光定量检测方法进行比较，验证该方法的临床检测效果。

取2017-2018年间河南省不同猪场收集的100份腹泻病料，应用本申请建立的taqman荧光定量pcr方法进行检测，结果显示，pdcov的阳性检出率为23%（23/100），与本实验室已经建立的pdcovsybrgreenі荧光定量检测方法结果一致，随机选取3份阳性样本，经测序鉴定后，证实为pdcov，表明此次建立的方法可用于pdcov的临床流行病学调查。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>河南农业大学

<120>猪δ冠状病毒taqman荧光定量rt-pcr检测方法及其应用

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<212>dna

<213>deltacoronavirus病毒属

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<221>cds

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