用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp(kompetitiveallelespecificpcr竞争性等位基因特异性pcr)标记引物组合及其应用。

背景技术：

西瓜枯萎病是导致全球西瓜产量和品质降低的最严重障碍。迄今为止没有一种化学农药可以有效控制枯萎病的发生。生产上主要靠嫁接栽培措施进行有效防治，但易降低西瓜品质。因此，选育抗枯萎病品种是有效控制西瓜枯萎病最安全、经济的途径。目前，野生西瓜材料中存在多个抗源，而利用野生西瓜回交选育又容易出现连锁累赘，且栽培西瓜与野生西瓜抗性机制不同，所以，运用来源于栽培西瓜的抗性基因进行抗病转育是目前常规育种的主要手段。但大多数适宜我国保护地栽培的优质西瓜品种尚未聚合枯萎病抗性，究其原因，主要是由于缺乏高效的分子标记辅助育种技术手段，育种效率较低。因此开发栽培西瓜抗枯萎病基因连锁标记，将有利于高效改良栽培西瓜的枯萎病抗性，为西瓜抗病分子育种提供技术支撑。

育种实践证明，针对目标基因的关键突变位点开发的功能型分子标记是分子标记辅助转育西瓜枯萎病抗性性状的前提条件。本实验室基于西瓜抗枯萎病基因fo-1连锁的snp位点开发了dcaps标记，并获得了国家发明专利(专利号：zl201310052303.3)。但上述标记需要对pcr产物进行酶切，并利用琼脂糖凝胶对目标片段进行分离检测等步骤，过程较为繁琐，造成这些标记在西瓜枯萎病抗性分子标记辅助育种方面的应用具有一定的局限性。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合及其应用。

一种用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记核心引物组合，所述西瓜枯萎病抗性基因为fo-1基因，所述kasp标记核心引物组合包括如下三条引物：

上游引物1的核心序列：

5’-gccgatagagaggaggactttgatgcctt-3’；

上游引物2的核心序列：

5’-gccgatagagaggaggactttgatgccta-3’；

序列表中序列3所示的下游引物：

5’-gttgcgcttttttgagcgacgaaataaattcttgc-3’。

一种用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，所述西瓜枯萎病抗性基因为fo-1基因，所述kasp标记引物组合包括如下三条引物：

序列表中序列1所示的上游引物1：

5’-gaaggtgaccaagttcatgctgccgatagagaggaggactttgatgcctt-3’；

序列表中序列2所示的上游引物2：

5’-gaaggtcggagtcaacggattgccgatagagaggaggactttgatgccta-3’；

序列表中序列3所示的下游引物：

5’-gttgcgcttttttgagcgacgaaataaattcttgc-3’。

一种用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒，所述西瓜枯萎病抗性基因为fo-1基因，所述试剂盒含有所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合。

作为优选的实施方式，所述试剂盒还包括荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a、淬灭探针b、高保真taq酶和dntp；

所述荧光探针a的序列为5′-gaaggtgaccaagttcatgct-3′，5′末端连接1个荧光基团fam；

所述荧光探针b的序列为5′-gaaggtcggagtcaacggatt-3′，5′末端连接1个荧光基团hex；

所述淬灭探针a的序列为5′-agcatgaacttggtcaccttc-3′，3′末端连接淬灭基团bhq；

所述淬灭探针b的序列为5′-aatccgttgactccgaccttc-3′，3′末端连接淬灭基团bhq。

上述用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，或者上述用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒在如下任一中的应用：

(1)检测或辅助检测西瓜枯萎病抗性的基因型；(2)培育具有西瓜枯萎病抗性的新材料；其中，所述西瓜枯萎病抗性基因为fo-1基因。

一种检测或辅助检测西瓜枯萎病抗性的基因型的方法，所述西瓜枯萎病抗性的基因为fo-1基因，所述方法包括如下步骤：

以待测西瓜的基因组dna为模板，采用上述用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，或者权上述用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒进行pcr扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下方式确定所述待测西瓜的fo-1基因的基因型：

若所述待测西瓜的扩增产物的荧光信号数据经kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测西瓜的fo-1基因的基因型为fofo；

若所述待测西瓜的扩增产物的荧光信号数据经kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测西瓜的fo-1基因的基因型为fofo；

若所述待测西瓜的扩增产物的荧光信号数据经kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测西瓜的fo-1基因的基因型为fofo。

作为优选的实施方式，所述pcr扩增反应的反应程序为：

阶段1：94℃预变性15min；阶段2：94℃20s；61-55℃1min，共循环10次，每个循环降0.6℃；阶段3：94℃20s，55℃1min，共循环26次。

一种培育具有西瓜枯萎病抗性的新材料的方法，包括：

以感枯萎病、品质优良材料为受体亲本p1，与具有抗枯萎病基因、品质一般的供体亲本p2配制f1代杂交组合；再以受体亲本p1作为轮回亲本进行回交，获得bc1f1代回交分离群体；

对所述bc1f1代回交分离群体，采用权利要求2所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，或者权利要求3或4所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取基因型为fofo的单株继续回交，获得bc2f1代回交分离群体；

对所述bc2f1代回交分离群体，采用权利要求2所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，或者权利要求3或4所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取基因型为fofo的单株，继续回交n代，获得bcnf1代回交分离群体；

对bcnf1代回交分离群体，继续采用权利要求2所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，或者权利要求3或4所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取基因型为fofo的单株自交，获得纯合抗枯萎病株系。

作为优选的实施方式，所述n为3-8的整数，优选为4。

本发明的有益效果如下：

1、应用本发明提供的用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，进行西瓜枯萎病抗性基因型的检测，操作流程全自动，降低了人为误差，分析通量高，非常适合大量样品同时检测。

2、本发明提供的用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合应用于西瓜枯萎病抗性基因的转育，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，加速西瓜抗病性状向优异骨干自交系的转育。

本发明的其他特征和优点将在如下的具体实施方式部分详细描述。

附图说明

图1为实施例3中利用kasp标记引物组合检测西瓜fo-1基因的基因型的96孔样品板snp分型结果示意图。

图中，黑色表示空白对照，红色为t:t，绿色为ta，蓝色为a:a。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的实施方式作进一步地详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明涉及的西瓜枯萎病抗性基因为fo-1基因。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中的各个供试材料均为北京市农林科学院蔬菜研究中心种质资源库保存的种质资源材料，公众均可以从该处获取相关材料。

实施例1

本实施例用来说明用于检测西瓜枯萎病抗性的高通量kasp标记的设计及其专用引物序列(kasp标记引物组合)的开发。

一、候选snp的获取

本实验室之前的研究结果，将西瓜枯萎病菌生理小种1抗病基因fo-1定位于1号染色体上10cm区间内，获得与抗病基因fo-1的遗传距离仅为0.2cm的高度连锁标记502124_fon，502124_fon为dcaps标记(焦荻等，2013)，但在应用中需要对pcr产物进行酶切，再利用琼脂糖凝胶对目标片段进行分离检测等步骤，过程较为繁琐，使得该标记在西瓜枯萎病抗性分子标记辅助育种方面的应用具有一定的局限性。

在此基础上，本发明进一步比对11份抗病和感病栽培西瓜重测序信息，又获取了1个与其表型性状(西瓜枯萎病抗性)完全符合的候选snp位点467967_fon。

上述11份西瓜全基因组重测序材料是对枯萎病生理小种1的抗、感表型确定的西瓜材料，包括7份感病材料97103、rz-900、rz-901、xhbfgm、jxf、jlm和blackdiamond，4份抗病材料sy-904304、sugarlee、jx-2和calhoungray(参见表1)。

表111份西瓜材料及表型性状

上述11份西瓜重测序信息结果来源于西瓜基因组信息网站，网站为http://www.iwgi.org。

供试西瓜材料基因组dna的提取参照murray等(1980)的方法并稍加改进，具体步骤如下：

1、取0.3-0.5g幼嫩叶片于1.5ml离心管中，每管加300μlctab，放入2粒钢珠，用retch仪进行打碎。

2、每管再加入300μlctab，混匀后65℃水浴60min，每隔10min颠倒混匀一次。

3、水浴后置于室温冷却10min，加入300μl的氯仿、异戊醇混合液(氯仿和异戊醇的体积比为24:1)，充分混匀，4500rpm离心15min。

4、取400μl上清液，加入预先加好的400μl预冷的异丙醇中(于96孔深孔板)，轻轻混匀；-20℃放置30min。

5、于4500rpm离心30min，弃上清，用70％的乙醇洗沉淀2-3次，室温下风干至无乙醇味。

6、加入50-100μl(含0.5-1μlrnase10mg/ml)ddh2o，37℃水浴30min。

取5μl样品在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳检测，并以标准λdna为对照，将样品浓度调为一致。

二、kasp标记专用引物的开发

基于kasp技术设计高通量kasp标记。kasp为竞争性等位基因特异性pcr技术体系，具备流程简单、高效、灵活、易操作等特点，其引物设计原则是针对等位基因snp位点设计两个上游引物和一个下游引物；两个上游引物3'末端碱基分别为不同的等位基因，5'端含有特异性接头gaaggtgaccaagttcatgct和gaaggtcggagtcaacggatt，可与荧光标记结合。第一轮pcr，能够和模板互补的上游引物得到延伸，无法和模板互补的上游引物无法延伸；第二轮pcr，上游引物互补的特异性序列得以延伸，将通用标签序列引入与snp对应的pcr产物。随着pcr循环数增加，扩增数量呈指数增长，荧光探针更多地退火到新合成的互补链上，发出荧光。不同颜色荧光即反映不同snp类型，对实验结果进行检测即达到检测目的。

根据上述snp位点467967_fon和表1中的11份西瓜重测序材料重测序数据，获得与西瓜抗枯萎病基因fo-1紧密连锁的kasp标记核心引物序列。

kasp标记核心引物序列如下：

f/f-r：5’-gttgcgcttttttgagcgacgaaataaattcttgc-3’(序列3)。

上述核心引物序列中，上游引物f-f和f-f的3′端为等位变异碱基(粗体下划线部分的t或a)，在上游引物f-f的5’端加上相应的通用接头序列(fam荧光标签序列，即荧光探针a)，在上游引物f-f的5’端加上相应的通用接头序列(hex荧光标签序列，即荧光探针b)，获得用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合：

上游引物1(f_allele-f)：

5’-gaaggtgaccaagttcatgctgccgatagagaggaggactttgatgcctt-3’(序列1)；

上游引物2(f_allele-f)：

5’-gaaggtcggagtcaacggattgccgatagagaggaggactttgatgccta-3’(序列2)；

下游引物(ff-r)：

5’-gttgcgcttttttgagcgacgaaataaattcttgc-3’(序列3)。

其中，上游引物1中下划线部分为fam荧光标签序列(5′-gaaggtgaccaagttcatgct-3′)；上游引物2中下划线部分为hex荧光标签序列(5′-gaaggtcggagtcaacggatt-3′)。

上述引物均由上海生工公司北京合成部合成。

实施例2

本实施例用来说明利用用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合检测西瓜枯萎病抗性的方法。

一、提取基因组dna

供试西瓜材料基因组dna的提取方法参见实施例1。

二、pcr扩增

以步骤一提取的基因组dna为模板，采用实施例1开发的用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

pcr扩增反应体系如下：

96孔板中的每个孔中加入如下用量的试剂：10ng基因组dna，5μlkaspv4.02×mastermix，0.14μlkasp72×assaymix，加ddh2o至10μl。

384孔板中的每个孔中加入如下用量的试剂：5ng基因组dna，2.5μlkaspv4.02×mastermix，0.07μlkasp72×assaymix，加ddh2o至5μl。

1536孔板中的每个孔中加入如下用量的试剂：5ng基因组dna，2.5μlkaspv4.02×mastermix，0.07μlkasp72×assaymix，加ddh2o至5μl。

其中，kaspv4.02×mastermix为lgc公司产品，其中用于96/384孔板的kaspv4.02×mastermix的产品目录号为kbs-1016-002；用于1536孔板的kaspv4.02×mastermix的产品目录号为kbs-1016-011。

kaspv4.02×mastermix由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真的taq酶，dntp等组成。荧光探针a即为fam荧光标签序列(5′-gaaggtgaccaagttcatgct-3′)，5′末端连接1个荧光基团fam；荧光探针b即为hex荧光标签序列(5′-gaaggtcggagtcaacggatt-3′)，5′末端连接1个荧光基团hex；淬灭探针a的序列为5′-agcatgaacttggtcaccttc-3′，3′末端连接淬灭基团bhq；淬灭探针b的序列为5′-aatccgttgactccgaccttc-3′，3′末端连接淬灭基团bhq。

kasp72×assaymix的获得方法如下：

将实施例1中的上游引物1(序列1)、上游引物2(序列2)和下游引物(序列3)分别用ddh2o稀释至浓度为100μm后，再将上游引物1稀释液、上游引物2稀释液和下游引物稀释液与ddh2o按12:12:30:46的体积比混合。

pcr扩增反应程序为：

阶段1：94℃预变性15min；

阶段2：94℃20s，61-55℃1min，每个循环降0.6℃，共循环10次；

阶段3：94℃20s，55℃1min，共循环26次。

其中pcr水浴热循环使用hydrocycler16-32高通量热循环系统，适用于96、384和1536孔板。

同时设置反应体系中不添加模板dna的空白对照，每个pcr板(即，96孔板、384孔板或1536孔板)上均设置2个孔为空白对照。

三、pcr扩增产物的荧光扫描

采用双向单激发读板仪pherastar对pcr板上的pcr扩增产物进行扫描，fam激发波长为485nm，发射波长为520nm，hex激发波长为528nm，发射波长为560nm，系统参比荧光rox激发波长为575nm，发射波长为610nm。

每个pcr扩增产物样本设置至少3个重复。

四、等位基因分型

采用kraken^tm软件对双向单激发读板仪pherastar扫描数据分析(具体操作方法参考kraken^tm软件说明书，公众可以直接从lgc公司购买，见网址http://www.lgcgroup.com/products/genotyping-software/kraken/#.vhcat9kl8_m)，根据分析结果按照如下方法确定待测西瓜枯萎病抗性的具体基因型(参考图1)：

聚合在接近x轴、显示蓝色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的等位基因型；

聚合在接近y轴、显示红色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型；

中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型；

显示粉色的样本可能由于dna质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型；左下角显示黑色的样本为空白对照。

具体而言，如下：

若所述待测西瓜的扩增产物的荧光信号数据经kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测西瓜的fo-1基因的基因型为fofo(snp分型为t:t基因型)；

若所述待测西瓜的扩增产物的荧光信号数据经kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测西瓜的fo-1基因的基因型为fofo(snp分型为a:a基因型)；

若所述待测西瓜的扩增产物的荧光信号数据经kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测西瓜的fo-1基因的基因型为fofo(snp分型为t:a基因型)。

若所述待测西瓜的扩增产物的荧光信号数据经kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现粉色(本实施例和图1均未显示)，则由于dna质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型。

实施例3

本实施例用来说明用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合在检测西瓜枯萎病抗性中的应用。

1、供试材料选取

供试材料包括：抗病母本jx2，感病父本乙选，二者杂交获取的f1代，f1代自交获得的f2代(即f2分离群体)。

以上f2代分离群体于2013年秋在海南培育、采种，于2014年8月在大棚中催芽直播，并定植于北京市农林科学院蔬菜研究中心四季青试验基地，定植数量为151株；母本、父本、f1均定植于北京市农林科学院蔬菜研究中心四季青试验基地，分别定植20株。

2、供试材料苗期接种鉴定

枯萎病接种鉴定采用耿丽华等(2010)报道的浸根法接种，接种孢子浓度为5×10⁶个·ml^-1，两叶一心时浸根接种，浸根时间为15min，接种后温度保持在23～28℃，接种后10～20d，调查f2分离群体的病情等级。

病情分级标准参照martyn等(1987)的分级标准，具体如下：

0级：无症状；1级：晴天中午子叶萎蔫或部分子叶、真叶轻微萎蔫，夜间能恢复；2级：1片真叶萎蔫或子叶较重萎蔫；3级：子叶及60％以上真叶萎蔫，阻碍发育；4级：整株萎蔫，心叶成活；5级：整株严重萎蔫并枯死。其中，2级以下为抗病类型，3级以上为感病类型。

3、枯萎病抗性基因fo-1的基因型检测与表型比较分析

采用本发明实施例1开发的用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，检测f2代分离群体枯萎病抗性基因fo-1的基因型，获得f2代分离群体枯萎病抗性基因fo-1的基因型(具体操作方法参见实施例2)。另一方面，与供试材料苗期接种鉴定结果进行比较，统计高通量kasp标记检测的基因型结果与苗期接种鉴定表型结果的吻合度。

利用fo-1基因高通量kasp标记检测体系，分析亲本和f2群体单株的fo-1基因的基因型，根据fo-1基因的t-a关键变异位点设计的标记引物，将f2群体单株进行snp分型得到t:t、a:a、t:a三种基因型，分别对应为：fofo、fofo和fofo基因型，部分样品的检测结果如图1所示。

图1中，左下角显示黑色的样本为每个pcr板的空白对照，聚合在接近y轴、显示红色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型(fofo，snp分型为t:t基因型)；聚合在接近x轴、显示蓝色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的等位基因型(fofo，snp分型为a:a基因型)；中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型(fofo，snp分型为t:a基因型)。如果存在显示粉色的样本，可能是由于dna质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型。

利用本发明fo-1基因高通量kasp标记检测供试f2群体的151个单株，snp分型结果与田间接种鉴定结果一致，吻合率达到100％。

151个f2群体单株的具体分析结果见表2。

表2f2群体fo-1基因型分析结果与表型比较分析

由此可见，采用本发明提供的用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合可以精确地检测西瓜枯萎病抗性。

实施例4

本实施例用来说明用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合在西瓜枯萎病抗性转育方面的应用。

以感枯萎病生理小种1材料乙选(感枯萎病，但西瓜品质优良)为受体亲本(p1)，与jx2(具有抗枯萎病基因，但西瓜品质一般)为抗病基因供体亲本(p2)，配制f1代杂交组合。再以乙选(p1)作为轮回亲本进行回交，获得bc1f1代群体。

对bc1f1代群体，利用实施例1获得的用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，采用实施例2中的方法进行基因型检测，选取基因型为fofo(snp分型为t:a基因型)的单株继续回交，获得回交分离群体bc2f1。

对bc2f1代群体，继续利用实施例1获得的用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，采用实施例2中的方法进行基因型检测，选取基因型为fofo(snp分型为t:a基因型)的单株继续回交，获得回交分离群体bc3f1。

对bc3f1代群体，继续利用实施例1获得的用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，采用实施例2中的方法进行基因型检测，选取基因型为fofo(snp分型为t:a基因型)的单株继续回交，获得回交分离群体bc4f1。

对bc4f1代群体，继续利用实施例1获得用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合，采用实施例2中的方法进行基因型检测，选取基因型为fofo(snp分型为t:t基因型)的单株自交，获得纯合抗病株系。

在转育过程中，随着回交代数的增加，果实品质和外观性状逐渐趋近于转育的轮回亲本。转育至bc4代的果实品质和外观性状非常接近转育的轮回亲本，进一步将bc4进行了自交，通过用于高通量检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合对fo-1基因的筛选，培育出符合目标性状、又抗病的稳定自交系，显著提高了育种效率。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

序列表

<110>北京市农林科学院

京研益农（北京）种业科技有限公司

<120>用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合及其应用

<130>c1cncn181006

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaaggtgaccaagttcatgctgccgatagagaggaggactttgatgcctt50

<210>2

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaaggtcggagtcaacggattgccgatagagaggaggactttgatgccta50

<210>3

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gttgcgcttttttgagcgacgaaataaattcttgc35