用于体外规模化生产红细胞的中空纤维管和方法与流程

本发明涉及有核细胞的无核化，具体涉及用于体外规模化生产红细胞的中空纤维管和方法。

背景技术：

来自世界卫生组织(who)全球血液安全数据库的数据显示，全球每年收集9200万单位的全血捐献，每天有3.3％的医院因为血液短缺推迟手术，10.3％的医院每年至少有1天紧急手术无血可用。另外，由于艾滋病病毒感染等原因5-10％的血液输入不安全。因此，血液供给的需求在全球范围是非常紧迫的。

随着造血干细胞分化发育的研究深入，体外人工诱导造血干祖细胞扩增生产成熟红细胞逐渐成为解决输血面临困境的潜在可行的方向。目前对于体外大规模产生红细胞的研究一般在无血清培养体系中进行，这可以避免血清中一些尚未确定的物质的影响，而且完全可以避免血清中可能存在的污染源。

实现规模化生产实际所需量的红细胞的关键技术之一在于如何高效地产生完全脱核的红细胞。目前有研究在无血清培养体系中能使造血干细胞在体外持续扩增45天，细胞数目达10⁷倍，但是红细胞脱核效率低，不能满足实现所需。虽另有以基质细胞的造血支持实现了红系祖细胞的完全脱核，但这些基质细胞对于后期输血带来不利影响。

技术实现要素：

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种基于中空纤维管来提高红细胞脱核效率的方案。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于体外规模化生产红细胞的中空纤维管，所述中空纤维管的直径为200-1000μm，且设置为其内腔能够流通基础培养基和/或气体，其末端能够与基础培养基容器和/或氧气储存器连通；所述中空纤维管的管壁厚度为20-80μm，且设置为允许所述基础培养基的成分和/或气体从所述中空纤维管的内腔一侧穿过所述管壁到达另一侧，且在所述中空纤维管的至少管壁的外表面具有适于细胞脱核的基团。

在某些实施方案中，所述管壁由孔径小于0.3μm的多孔可渗透材料制成，且管壁外表面具有季铵基团。

在某些实施方案中，所述多孔可渗透材料选自聚砜、聚氯乙烯、醋酸纤维素和丙烯酸共聚物组成的组。

在某些实施方案中，所述管壁外表面的电位为1.20×10^-3至4.0×10^-3v。

在某些实施方案中，所述基础培养基选自sfem培养基和imdm培养基，且不含血清白蛋白。

本发明的第二方面，提供一种用于体外规模化生产红细胞的方法，其包括以下步骤：

(1)使至少部分基础培养基和/或氧气连续地从中空纤维管的内腔通过管壁进入并填充至脱核分化室；

(2)使红系祖细胞在所述脱核分化室内与所述中空纤维管的管壁外表面接触，其中在所述脱核分化室内添加有分化因子；

(3)使所述脱核分化室内产生的废物随至少部分培养基一起通过管壁进入至所述中空纤维管的内腔，并流出至所述脱核分化室外。

在某些实施方案中，所述步骤(1)-(3)同时进行。

在某些实施方案中，所述分化因子包括epo、铁饱和的转铁蛋白和igf-l。

在某些实施方案中，所述基础培养基为含有l-谷氨酰胺、2-巯基乙醇和铁离子的imdm培养基，且在所述脱核分化室内进一步补充选自bsa、人胰岛素、epo、转铁蛋白和igf-l组成的组中的至少之一。

在某些实施方案中，所述基础培养基为sfem培养基，且在所述脱核分化室内进一步补充选自bsa、epo、铁饱和的转铁蛋白和igf-l组成的组中的至少之一。

本发明的中空纤维系统可以在很小的体积内提供非常大的表面积，其表面积可以达到200cm²/ml，从而可以在一个非常小的体积范围内规模化培养大量细胞。细胞通过管壁可以十分有效地交换营养和代谢物，并且可通过已知手段控制中空纤维管的过滤性能，使之保留纤维特异蛋白质和细胞因子或者允许它们通过纤维进入循环基质当中。本发明的生产方法可以得到10⁸个细胞/ml以上的细胞量，与传统细胞培养方法最多只能得到10⁶个细胞/ml的细胞量相比，本发明的生产方法可实现规模化生产。另外，本发明的中空纤维管更有利于红系祖细胞的脱核分化，更有利于体外规模化红细胞的生产。

附图说明

图1利用不同中空纤维管在相同分化体系培养5天后的细胞脱核情况。左图为本发明的中空纤维管的结果，右图为对照中空纤维管的结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

[用于体外规模化生产红细胞的中空纤维管]

本发明的第一方面，提供一种用于体外规模化生产红细胞的中空纤维管(本发明有时简称为“本发明的中空纤维管”)，本发明的中空纤维管的直径为200-1000μm，优选300-900μm，更优选400-800μm，例如550-800μm等。此处的“直径”是指中空纤维管的外径。上述范围的直径非常有利于红细胞的培养与脱核分化，并且有利于提供细胞培养所需的适当的表面积。如果直径过小，则不利于规定量的基础培养基成分或气体渗透穿过管壁，或者需要在中空纤维管的内腔中提供更大的压力来促使基础培养基成分渗透穿过管壁，而过高的压力不利于细胞贴附于中空纤维管的管壁生长，或者虽然对细胞贴附可能没实质性影响，但是对于红系祖细胞的脱核极为不利，影响脱核效率。

本发明的中空纤维管的长度不特别限定，但是考虑到基础培养基和/或气体(例如，氧气)渗入时压力在管径向上分布的均匀性，优选中空纤维管的长度为10-50cm，更优选20-45cm。

本发明的中空纤维管的管壁的厚度不特别限定，一般为20-80μm，优选25-70μm，更优选35-50μm。上述管壁厚度设置允许一定压力下基础培养基的成分和/或气体能够从中空纤维管的内腔一侧(内侧)穿过管壁到达另一侧(外侧)，优选地，进一步允许细胞培养或分化过程中产生的废物从中空纤维管的外侧进入内侧，并随内腔的基础培养基的流动而排出。如果管壁的厚度过小，则中空纤维管不能承受基础培养基进入时所需的压力，容易破裂。如果管壁的厚度过大，则不利于物质的渗透，也会影响到细胞的生长或分化。优选地，中空纤维管的末端能够与基础培养基容器和/或氧气储存器连通。这样的设计有利于向细胞提供营养和/或氧气，从而模拟细胞体内的生长环境，更有利于细胞的生长。

在某些实施方案中，本发明的中空纤维管的管壁由多孔可渗透材料制成，且管壁中孔的孔径小于0.3μm，优选小于0.2μm。另一方面，需要管壁中孔的孔径足以使基础培养基的成分顺利通过，为此孔径优选大于0.005μm，更优选大于0.01μm，进一步优选大于0.05μm。本发明的多孔可渗透材料可选自聚砜、聚氯乙烯、醋酸纤维素和丙烯酸共聚物组成的组。本发明可使用上述材料中的一种或多种的组合。本发明的中空纤维管的透水量一般为50-500ml/m²/hr/mmhg，优选150-400ml/m²/hr/mmhg。在该透水量范围内有利地使基础培养基成分透过并使有害废物渗出，同时对于细胞生长、分化有益大分子有机物(例如白蛋白等)形成有效阻挡，从而减少这些成分的使用量，缩减成本。

在某些实施方案中，本发明的中空纤维管在沿管壁的厚度方向上具有不对称的两层结构：暴露在外侧的具有纳米级微孔分布的第一层，和具有较大孔径相对疏松的面向中空纤维内腔的第二层。这样的结构更有利于基础培养基成分渗透进入分化室，而阻止与细胞接触的分化因子等渗出至分化室外。

本发明的中空纤维管的至少管壁外表面上具有适于细胞脱核的基团。通过在管壁外表面上设置适于细胞脱核的基团可以使红系祖细胞等需脱核的细胞在不依赖基质细胞的情况下实现高效脱核。优选地，管壁的外表面具有季铵基团作为适于细胞脱核的基团。管壁外表面具有季铵基团，从而使管壁外表面具有正电荷，由此可使管壁外表面的电位ζ为1.20×10^-3至4.0×10^-3v，优选1.20×10^-3至3.5×10^-3v。本发明中，电位ζ可基于电泳原理来测定。具体地，当纤维管的管壁表面与溶液接触时，由于离解或吸附作用使溶液中存在的与表面电荷相反的离子在外加电场中作定向运动。当纤维管表面具有正电荷时，纤维管附近溶剂化的负离子在电场作用下向正极运动。相反，如果纤维管表面具有负电荷，则溶剂化的正离子会向负极运动，这种运动与电荷量存在关联。据此可以测定纤维管表面的ζ电位。

本发明发现，当管壁外表面具有上述季铵基团时，对于红系祖细胞分化脱核形成红细胞以及细胞产生的废物的排出非常有利。其原因不清楚，发明人推测可能在于细胞在脱核过程中，细胞核成分显示负电性，而当管壁外表面具有正电核时，由于正负电荷相互作用促进细胞核脱离。另外，细胞在分化或培养时代谢产生的废物主要包括乳酸、丙酮酸等小分子酸性物质。由于纤维管外表面具有正电荷，使此类酸性物质溶剂化的负离子容易向带正电核的中空纤维的管壁移动或被其吸附，并通过内腔中培养液的流动以及自由扩散进入中空纤维管的内腔被排出。

可通过已知的方法来制备本发明的中空纤维管。在示例性方法中，本发明的中空纤维管的制备方法包括以下步骤：

(1’)制备活化中空纤维的步骤

可以本领域已知的方法制备活化中空纤维。在某些实施方案中，以氯甲醚改性的聚砜为原料通过例如熔融挤出方法制备活化中空纤维。

在示例性方法中，用生产塑料制品的熔融挤出方法将氯甲醚改性的聚砜的熔体挤出，在大气环境中逐渐冷却，随着熔体温度的降低,熔体流动性逐渐减小而固化成型。

在另外的示例性方法中，通过例如多采用异型喷丝板成型法制备具有不对称性结构的活化中空纤维。具体地包括将氯甲醚改性的聚砜溶解于有机溶剂(例如，dmf或dmac)中，其中含有致孔作用的添加剂(例如peg)混溶脱泡，由计量泵通过中心通液式插入管式喷头挤出。挤出纤维在经空气暴露后，进行凝固浴，未成型的改性聚砜溶液中的溶剂与凝固浴中的固化剂进行双扩散，改性聚砜固化成型。由于改性聚砜溶液中的部分溶剂在空气间的蒸发，溶剂与固化剂在纤维径向的交换的扩散作用以及聚砜溶液中添加剂对相分离速度的调整和水溶性添加剂洗脱后留下的空位的影响，沿径向形成所需的孔道。

在某些实施方案中，对聚砜中空纤维进行活化处理制备活化中空纤维。首先，将聚砜中空纤维浸泡于含氯甲醚的有机溶剂(例如二氧乙烷)中，然后加入无机促进剂进行活化。其中氯甲醚与有机溶剂的摩尔比一般为1:5至1:15，优选1:10。无机促进剂的实例包括氯化铝、氯化锡、氯化锌等。活化条件包括在40-60℃，优选45-50℃下反应5-24小时，优选8-12小时。在活化时优选搅拌含氯甲醚的有机溶剂。活化反应结束后，进一步包括用去离子水清洗活化后的中空纤维管，并将其在60-85℃烘干，从而得到活化中空纤维。

(2’)活化中空纤维的表面处理步骤

本发明的表面处理包括将活化中空纤维于室温下，在20-40％三甲胺(tma)的溶液中浸泡30-50h得到。

本发明的中空纤维管为细长管状结构，可用于形成体外细胞培养的装置。此类装置的结构可使用本领域内已知的结构。

[用于体外规模化生产红细胞的方法]

本发明的第二方面，提供用于体外规模化生产红细胞的方法(有时简称为“本发明的方法”)。本发明的方法包括以第一方面所述的中空纤维管作为红系祖细胞分化基质的过程，具体地，可包括以下步骤：

(1)使基础培养基和/或氧气连续地从中空纤维管的内腔通过管壁进入并填充至脱核分化室；

(2)使红系祖细胞在脱核分化室内与中空纤维管的管壁表面接触，其中在脱核分化室内添加有分化因子；

(3)使脱核分化室内产生的废物随至少部分培养基成分一起通过管壁进入至中空纤维管的内腔，并流出至脱核分化室外。

本发明中细胞分化和/或生长所需的物质包括基础培养基和分化因子。基基础培养基主要用于为细胞生长和/或分化提供能量，包括大量无机物质和小分子有机物。基础培养基可使用本领域已知的培养基。例如，sfem培养基和imdm培养基。其中sfem培养基是由stemcell公司生产的产品，例如产品号为cat#09600的产品。imdm培养基为本领域内已知的产品，其又可称为伊思柯夫改良培养液。它含有更高浓度的营养成分，适合于高密度细胞培养。

本发明的基础培养基中的成分或气体成分可自由地通过中空纤维管的管壁。另外，细胞生长或分化过程中产生的对细胞分化不利的废物(例如乳酸、丙酮酸等小分子酸性物质)也可通过中空纤维管排出至脱核分化室外。

在某些实施方案中，本发明的基础培养基还可包含其他小分子成分。此类其他小分子成分的实例包括l-谷氨酰胺、2-巯基乙醇和铁离子。基础培养基中l-谷氨酰胺的浓度基于基础培养基的体积一般为1mmol/l至5mmol/l，优选2mmol/l至3mmol/l。2-巯基乙醇的浓度基于基础培养基的体积一般为1×10^-4mol/l至9×10^-4mol/l，优选1×10^-4mol/l至5×10^-4mol/l。基础培养基中铁离子的浓度不限定。基于基础培养基的体积，一般为200μg/ml至400μg/ml，优选250μg/ml至300μg/ml。上述铁离子浓度可通过添加适量例如lronsupplement(sigma公司产品，cat#i3153)来实现。

除了上述基础培养基外，在体外规模化生产红细胞时需进一步添加一种或多种分化因子。这些分化因子确保红系祖细胞的成熟分化。此类分化因子的实例包括但不限于促红细胞生成素(epo)、干细胞生长因子(scf)、铁饱和的转铁蛋白和胰岛素样生长因子-1(igf-l)。基于基础培养基的体积，epo的添加量一般为8-10u/ml，优选8.5-9.5u/ml。铁饱和的转铁蛋白的添加量一般为400-600μg/ml，优选450-550μg/ml。igf-l的添加量一般为40-60ng/ml，优选45-55ng/ml。scf的添加量一般为50-100ng/ml，优选60-80ng/ml。优选地，进一步包括地塞米松，其含量一般为0.5-2μm，优选1-1.5μm。

优选地，在体外规模化生产红细胞时需要向分化室内进一步添加血清白蛋白，需要说明的是血清白蛋白不能从中空纤维的内腔通过渗透进入分化室。血清白蛋白的添加量基于基础培养基的重量为1-3％，优选1-2％。

在某些实施方案中，本发明的基础培养基为含有上述范围量的l-谷氨酰胺、2-巯基乙醇和铁离子的imdm培养基，并且在脱核分化室内培养时需进一步补充上述范围量的bsa、epo、转铁蛋白和igf-l。优选进一步补充5-15μg/ml，优选6-10μg/ml的人胰岛素。

在某些实施方案中，本发明的基础培养基为sfem培养基，且在脱核分化室内进一步补充上述规定范围量的bsa、epo、铁饱和的转铁蛋白和igf-l。

本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，上述步骤(1)-(3)的顺序并不特别限定，例如，可以依次为(1)、(2)、(3)；还可以是(2)、(1)、(3)等。此外，两个以上的上述步骤可合并同时进行，优选地，步骤(1)-(3)同时进行。另外，本领域技术人员还应理解的是，在上述步骤(1)-(3)前后，或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明步骤。

实施例1

本实施例为中空纤维管1的制备。

将0.2kg聚砜中空纤维c2011(fibercellsystems,frederick,md)浸泡于1000ml由体积比为1:10的氯甲醚和二氧乙烷组成的有机溶剂中，在该有机溶剂中加入8g氯化锌。在40℃下使聚砜中空纤维反应12小时。在反应期间间断性搅拌有机溶剂，使中空纤维管与有机溶剂之间的反应保持均一性。之后用去离子水清洗多次活化后的中空纤维管。然后将其在60℃烘干，从而得到活化的中空纤维。将活化的中空纤维于室温下在25％tma的溶液中浸泡45小时得到本发明的中空纤维管1。

实施例2

本实施例为中空纤维管2的制备。

将氯甲醚改性的聚砜溶解于dmf有机溶剂中，以peg6000为添加剂，经混溶脱泡，使用包括计量泵(规格为1.2ml/r)、插入管式喷丝头、氮气钢瓶等的中空纤维膜纺丝机制备中空纤维，经空气暴露后，进行凝固浴(凝胶浴温度25℃，凝胶浴中溶剂浓度55％，芯液中溶剂浓度78％)。由此制备具有不对称性结构的活化中空纤维管。将活化的中空纤维于室温下在25％tma的溶液中浸泡45小时得到本发明的中空纤维管2。

实施例3

本实施例为中空纤维管性能的测试例。

1.中空纤维管的孔径观察

截取一小段膜，在光学显微镜下观察内、外表面和断面的孔结构。

2.管壁表面电位测量

将多根中空纤维管平行排列于平面基质上形成膜状。参考复旦大学《物理化学实验》上海:复旦大学出版社,1982中所述的方法进行膜电位测量。

结果如表1所示。

实施例4

本实施例为体外生产红细胞的方法例。

本实施例的反应器为fibercellsystems公司catalognos.c2011andc2008的改造型号，其为15ml的中号反应器，能提供2200cm²的表面积。将该反应器中的中空纤维管分别替换为实施例1和2中的中空纤维管1和2作为本发明的生产方法的实施例。同时，以fibercellsystems公司的该反应器进行同样的细胞培养和分化，并将其作为比较例。

采用体外诱导脐带血来源的hsc生成的红系祖细胞(来自中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所)进行下述实验。红系祖细胞的基础培养基采用无血清培养基stemspansfem。

在改造的反应器中再次加入所需体积的stemspansfem，向其中加入epo5u/ml、scf100ng/ml、igf-l50ng/ml、dexl/-lm等细胞因子组成培养体系，以5×10⁵/ml的浓度加入所需的红系祖细胞，开启反应器，使新鲜的stemspansfem不断地经中空纤维管管壁向反应器加入反应器，并通过管壁不断排出细胞培养所产生的废物，由此构成循环体系，同时不断向反应器中供给所需的氧等。在该条件下培养红系祖细胞8天，当观察到细胞体积变大，细胞形态趋于均一时，之后收集细胞。

在改造的反应器中更换新的stemspansfem，并向其中加入epo10u/ml，铁饱和的转铁蛋白500μg/ml，igf-l50ng/ml，铁离子等细胞因子，构成脱核分化体系。向该脱核分化体系加入收集的细胞，在不断向反应器中供给所需的氧等条件下进行分化培养，10天后收集得到培养的红细胞。通过wright-gimesa染色，并通过显微镜观察细胞形态。具体观察结果参见表1。

为了进一步验证本发明的中空纤维管有利于红系祖细胞脱核，发明人还向反应器中加入用10μg/ml丝裂霉素处理的胎儿肝脏来源的基质细胞与红系祖细胞共培养、分化。除了中空纤维管不同之外，具体条件与上述相同。10天后收集得到培养的红细胞。通过wright-gimesa染色，并通过显微镜观察细胞形态。具体观察结果参见表1。

另外，通过血细胞分析仪分析常规指标，结果显示红细胞平均容积为10⁴±7fl，红细胞平均血红蛋白浓度为25±3％，红细胞平均血红蛋白含量为30±2pg，检测结果与正常外周血红细胞接近，显示得到成熟红细胞。

表1

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。