多因素一体化筛选平板及其制作工具和制作方法与流程

本发明属于微生物环境压力筛选的工具的领域，具体涉及多因素一体化筛选平板及其制作工具和制作方法。

背景技术：

目前，制作多种梯度的具备某种环境筛选压力的培养基是微生物诱变和筛选中通常使用的方法。在进行精确梯度设置的试验中，由于涉及多种梯度和多个平行样品，经常需要制作大量培养平板；在利用模糊梯度培养平板进行初步筛选时，往往由于其浓度梯度不能精确度量，而需要后续进行多次补充实验。以上两种情况都是在使用直径90mm的培养皿进行微生物筛选试验时所面临的较大工作量却较低工作效率的现象。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种多因素一体化筛选平板及其制作工具和制作方法，提供多因素一体化筛选平板的制作工具，以在同一块平板上提供多个精确环境梯度，或者多种环境条件，显著减少微生物诱变和筛选工作中平板制作和试验操作的工作量，解决了利用培养皿进行微生物筛选试验时所面临的较大工作量却较低工作效率的问题。

为了实现上述目的，本发明提供的一种多因素一体化筛选平板的制作工具，由一个或多个隔离圈组成，所述隔离圈的高度大于5mm，所述隔离圈在培养皿内使用，并且将培养皿内分割成多个区域。

优选地，所述隔离圈的厚度为1-5mm。

优选地，所述隔离圈将培养皿内分割成等距离或等面积的区域。

优选地，所述隔离圈的材质为不锈钢、铝合金、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯或玻璃。

优选地，所述隔离圈为模具加工或者3d打印制成。

本发明还提供一种多因素一体化筛选平板，由上述的制作工具制成，所述制作工具将所述多因素一体化筛选平板分割为不同筛选条件的区域。

本发明还提供一种由上述制作工具制成多因素一体化筛选平板的方法，包括以下步骤：

(1)在培养皿内加入基础培养基；

(2)待基础培养基凝固后，将一个隔离圈插入基础培养基，其中插入的深度小于基础培养基的厚度；

(3)向步骤(2)中的隔离圈内或隔离圈外加入带有筛选条件的培养基，待加入的培养基凝固，拔出隔离圈；

(4)重复步骤(2)和步骤(3)直至得到包括不同筛选条件的培养基的多因素一体化筛选平板；其中隔离圈按照由小至大或由大至小的顺序同心插入基础培养基，当隔离圈按照由小至大的顺序依次插入基础培养基时，向隔离圈内依次加入不同筛选条件的培养基；当隔离圈按照由大至小的顺序依次插入基础培养基时，向隔离圈外依次加入不同筛选条件的培养基。

优选地，隔离圈插入基础培养基时，隔离圈的圆心与培养皿的圆心相同。

优选地，加入的培养基的高度不大于隔离圈插入基础培养基后暴露在培养基外部的高度。

本发明提供的多因素一体化筛选平板及其制作工具和制作方法，具有如下有益效果：

1、多因素一体化筛选平板的制作工具实现了在同一块平板上提供多种、精确的筛选环境的目的，极大的降低了工作量，提高了工作效率和准确性；

2、多因素一体化筛选平板的制作工具可以将培养皿内分割成等面积或等距离的区域，制成的等面积型多因素一体化筛选平板可以用于进行未知环境适应性微生物的筛选；制成的等距离型多因素一体化筛选平板可以用于微生物变异与诱导试验；

3、多因素一体化筛选平板的制作工具可以用于同一种环境压力的多因素一体化筛选平板的制备，也可以用于不同环境压力的多因素一体化筛选平板的制备。

附图说明

图1为具体实施方式中的多因素一体化筛选平板的制作工具的结构示意图。

图2为实施例2中的多因素一体化筛选平板的结构示意图。

图中：

1.隔离圈2.培养皿3.提梁4.定位杆。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

多因素一体化筛选平板的制作工具，由一组不同尺寸的培养基灌制隔离圈1组成，培养基灌制隔离圈1的厚度为1-5mm，制作工具的材质为不锈钢、铝合金、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯或玻璃等，制作工具可以由工厂的模具生产或3d打印生产，制作工具可以在各种不同直径的培养皿2内使用，进而将培养皿2内分割成等距离或等面积的区域，制作工具可以根据需要将包装方式设计为无菌包装或非无菌包装，制作工具可以根据试验需要或材质特点设计为可重复使用或一次性使用。隔离圈1的上方设有一个提梁作为提手，便于隔离圈1的放置以及取出，在提梁的中心位置处设有一个竖直的细的定位杆，用于插入培养基的中心，便于隔离圈1的圆心与培养皿2的圆心的对准。

多因素一体化筛选平板，在培养皿2内使用一组不同尺寸的培养基灌制隔离圈1将培养皿2分割出等距离或等面积的区域，在不同的区域内加入不同的筛选培养基达到不同的筛选目的，培养基的成分和厚度可以根据需要进行调整。多因素一体化筛选平板分为等距离型多因素一体化筛选平板和等面积型多因素一体化筛选平板。多因素一体化筛选平板可以根据需要将包装方式设计为无菌包装或非无菌包装。选择的培养皿2根据需要选择不同的尺寸。

实施例1

利用多因素一体化筛选平板的制作工具，制作用于大肠杆菌抗生素抗性筛选的等面积型多抗生素梯度一体化筛选平板，选择使用直径为200mm无菌培养皿2，配制的抗生素浓度梯度为0mg/l、50mg/l、100mg/l、500mg/l和1000mg/l，选择使用四个培养基灌制隔离圈1，培养基灌制隔离圈1的厚度均为1mm，培养基灌制隔离圈1的内直径尺寸分别为90mm、128mm、156mm、180mm。工作中准备的多个培养皿2可以同时进行相同的操作，其制作方法如下：

1、制备5瓶无抗生素的营养琼脂培养基，及1瓶无菌水琼脂，融化备用；同时准备无菌抗生素溶液备用；准备5个200mm直径的无菌培养皿2，在超净工作台中去除外包装，并在培养皿2底部外侧中心做标记；将培养基灌制隔离圈1放入超净工作台，并浸泡于无菌水中备用。

2、在无菌培养皿2中倒入厚度约5mm的无菌水琼脂，待无菌水琼脂凝固。

3、待无菌水琼脂凝固后，取内直径为90mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度以1-2mm为宜。

4、向内直径为90mm的培养基灌制隔离圈1内缓慢倒入抗生素浓度为0mg/l的营养琼脂培养基，营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出内直径为90mm的培养基灌制隔离圈1。

5、取内直径为128mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度1-2mm。

6、向内直径为128mm的培养基灌制隔离圈1内缓慢倒入抗生素浓度为50mg/l的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出内直径为128mm的培养基灌制隔离圈1。

7、取内直径为156mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度1-2mm。

8、向内直径为156mm的培养基灌制隔离圈1内缓慢倒入抗生素浓度为100mg/l的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出内直径为156mm的培养基灌制隔离圈1。

9、取内直径为180mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度1-2mm。

10、向内直径为180mm的培养基灌制隔离圈1内缓慢倒入抗生素浓度为500mg/l的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出内直径为180mm的培养基灌制隔离圈1

11、向培养皿2内的剩余空间缓慢倒入抗生素浓度为1000mg/l的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待最后一圈营养琼脂培养基凝固后，即得到可使用的筛选因素为抗生素的多梯度一体化筛选平板。

实施例2

利用多因素一体化筛选平板的制作工具，制作用于大肠杆菌抗生素抗性诱导的等距离型多抗生素梯度一体化筛选平板，选择使用直径为200mm无菌培养皿2，配制的抗生素浓度梯度为0mg/l、50mg/l、100mg/l、500mg/l和1000mg/l，选择使用四个培养基灌制隔离圈1，培养基灌制隔离圈1的厚度均为2mm，培养基灌制隔离圈1的内直径尺寸分别为40mm、80mm、120mm、160mm。工作中准备的多个培养皿2可以同时进行相同的操作，其制作方法如下：

1、制备5瓶无抗生素的营养琼脂培养基，及1瓶无菌水琼脂，融化备用；同时准备无菌抗生素溶液备用；准备5个直径为200mm的无菌培养皿2，在超净工作台中去除外包装，并在培养皿2底部外侧中心做标记；将培养基灌制隔离圈1放入超净工作台，并浸泡于无菌水中备用。

2、在无菌培养皿2中倒入厚度约5mm的无菌水琼脂，待无菌水琼脂凝固。

3、待无菌水琼脂凝固后，取内直径为40mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度以1-2mm为宜。

4、向内直径为40mm的培养基灌制隔离圈1内缓慢倒入抗生素浓度为0mg/l的营养琼脂培养基，营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出内直径为40mm的培养基灌制隔离圈1。

5、取内直径为80mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度1-2mm。

6、向内直径为80mm的培养基灌制隔离圈1内缓慢倒入抗生素浓度为50mg/l的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出内直径为80mm的培养基灌制隔离圈1。

7、取内直径为120mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度1-2mm。

8、向内直径为120mm的培养基灌制隔离圈1内缓慢倒入抗生素浓度为100mg/l的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出内直径为120mm的培养基灌制隔离圈1。

9、取内直径为160mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度1-2mm。

10、向内直径为160mm的培养基灌制隔离圈1内缓慢倒入抗生素浓度为500mg/l的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出内直径为160mm的培养基灌制隔离圈1

11、向培养皿2内的剩余空间缓慢倒入抗生素浓度为1000mg/l的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待最后一圈营养琼脂培养基凝固后，即得到筛选因素为抗生素的多梯度一体化抗生素抗性诱导平板。

实施例3

利用多因素一体化筛选平板的制作工具，制作用于大肠杆菌多种环境条件筛选试验的多因素一体化筛选平板，选择使用直径为200mm无菌培养皿2，多种环境条件为正常营养培养环境、抗生素环境、高盐环境、碱性环境、酸性环境，选择使用四个培养基灌制隔离圈1，培养基灌制隔离圈1的厚度均为3mm，培养基灌制隔离圈1的外直径尺寸分别为90mm、128mm、156mm、180mm。工作中准备的多个培养皿2可以同时进行相同的操作，其制作方法如下：

1、制备5瓶无抗生素的营养琼脂培养基，及1瓶无菌水琼脂，融化备用；同时准备无菌抗生素溶液备用；准备5个直径为200mm的无菌培养皿2，在超净工作台中去除外包装，并在培养皿2底部外侧中心做标记；将培养基灌制隔离圈1放入超净工作台，并浸泡于无菌水中备用。

2、在无菌培养皿2中倒入厚度约5mm的无菌水琼脂，待无菌水琼脂凝固。

3、待无菌水琼脂凝固后，取外直径为180mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度以1-2mm为宜。

4、向外直径为180mm的培养基灌制隔离圈1外缓慢倒入用于提供正常环境的营养琼脂培养基，营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出外直径为180mm的培养基灌制隔离圈1。

5、取外直径为156mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度1-2mm。

6、向外直径为156mm的培养基灌制隔离圈1外缓慢倒入提供抗生素环境的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出外直径为156mm的培养基灌制隔离圈1。

7、取外直径为128mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度1-2mm。

8、向外直径为128mm的培养基灌制隔离圈1外缓慢倒入提供高盐环境的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出外直径为128mm的培养基灌制隔离圈1。

9、取外直径为90mm的培养基灌制隔离圈1，将其中心与培养皿2的中心对齐后轻轻插入水琼脂层，插入深度1-2mm。

10、向外直径为90mm的培养基灌制隔离圈1外缓慢倒入提供碱性环境的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待此营养琼脂培养基凝固后，轻轻拔出外直径为90mm的培养基灌制隔离圈1

11、向培养皿2内的剩余空间缓慢倒入提供酸性环境的营养琼脂培养基，使营养琼脂培养基厚度约5mm，待最后一圈营养琼脂培养基凝固后，即得到可使用的多因素一体化筛选平板。

多因素一体化筛选平板的制作工具，实现了在同一块平板上提供多种、精确的筛选环境的目的，极大的降低了工作量，提高了工作效率和准确性；多因素一体化筛选平板的制作工具可以将培养皿2内分割成等面积或等距离的区域，制成的等面积型多因素一体化筛选平板可以用于进行未知环境适应性微生物的筛选，制成的等距离型多因素一体化筛选平板可以用于微生物变异与诱导试验。多因素一体化筛选平板的制作工具可以用于同一种环境压力的多因素一体化筛选平板的制备，也可以用于不同环境压力的多因素一体化筛选平板的制备。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。