肉瘤融合基因检测试剂盒及系统的制作方法

本发明涉及医学检测
技术领域：
，特别是涉及一种肉瘤融合基因检测试剂盒及系统。
背景技术：
：软组织肉瘤是源于基质细胞(mesemchymalcell)的罕见恶性肿瘤，可能发生于身体任何部位，年龄分布也很广。软组织肉瘤约占成人恶性肿瘤1％，但是占儿童恶性肿瘤15％，是儿童中常见的实体肿瘤之一。软组织肉瘤诊断的金标准是组织病理学诊断，然而，多种良性与恶性肿瘤之间以及不同的肉瘤亚型之间存在相似的形态学，这给诊断带来了困难。有研究报道，近25％的案例转诊至肉瘤诊治中心后出现明显的诊断不一致性，且这些案例有一半以上影响治疗方案的制定及预后判断。因此，对良恶性肿瘤正确的诊断是至关重要的，是预测恶性肿瘤生物学行为及确定适当治疗方案的前提。技术实现要素：基于此，有必要针对上述问题，提供一种肉瘤融合基因检测试剂盒及系统，采用该试剂盒及系统能够辅助进行软组织肉瘤的诊断。一种肉瘤融合基因检测试剂盒，包括用于检测以下融合基因对的引物组：序号基因对序号基因对1col1a1-pdgfb12ewsr1-nfatc22ewsr1-nr4a313ewsr1-pou5f13ewsr1-creb114fus-creb3l24ewsr1-fli115fus-erg5ewsr1-wt116fus-ddit36ewsr1-ddit317pax3-foxo17ewsr1-fev18pax7-foxo18ewsr1-atf119ss18-ssx49ewsr1-erg20ss18-ssx110ewsr1-etv421ss18-ssx211ewsr1-etv122etv6-ntrk3。对多种软组织肉瘤进行了研究，发现染色体易位对这些肿瘤有特征性的诊断价值，因此检测软组织肉瘤中特征性的染色体易位及相应融合基因对于辅助软组织肉瘤的病理诊断有重要意义。例如腺泡状横纹肌肉瘤的t(2:13)(q37:q14)易位，透明细胞肉瘤的t(12:22)(q13:q12)易位，ewing瘤的t(11:22)(q24:q12)和t(21:22)(q21:q12)易位，粘液型脂肪肉瘤的t(12:16)(q13:p11)易位，滑膜肉瘤的t(x:18)(p11:p11)易位。在上述研究的基础上，本发明以上述与肉瘤相关的22对融合基因(137个融合转录产物)进行了检测，可用于辅助软组织肉瘤的病理诊断，还可用于对靶向用药进行提示。上述肉瘤融合基因检测试剂盒中各融合基因的临床意义如下表所示。表1.22对融合基因与肉瘤的对应提示关系上述22对融合基因，皆为恶性肿瘤所特有，不存在于正常人群，具有良好的临床特异性。根据cosmicfusion数据库，该22对融合基因在各软组织肉瘤中发生率较高，具有较好的临床灵敏度，具体如下：表2.22对融合基因临床灵敏度在其中一个实施例中，所述引物组包括核苷酸序列如seqidno.1～seqidno.274所示的引物序列。针对上述22对融合基因的137个融合转录产物，本发明人通过设计千重扩增引物，扩增产物两端加上通用的测序接头，构建测序文库，利用乳液pcr技术对测序文库进行扩增，形成测序模板，利用半导体测序系统进行测序。然而在实践中发现，由于扩增引物众多，在试验中会产生引物同聚物，导致检测失控，例如：ddit3基因经过2轮的引物筛选，才能确保特异性引物实现有效扩增。而本发明人通过多番摸索和筛选最终选定采用上述引物组，能够具有较好的扩增和检测效果，避免检测失控或无效。在其中一个实施例中，该试剂盒还包括内参基因，所述内参基因选自：myc，tbp，jun，cfhr5，afm，lmna，mrpl13，mttp，itgb7，hmbs，apob，lrp1。由于上述实施例中，检测初始模板为rna，采用多重pcr扩增技术富集目的基因cdna。由于rna的表达差异与pcr扩增的特点，所以覆盖均一性参数并不适用。但为了增加文库的多样性，本发明人通过多番筛选后确定上述广泛表达的内参基因，其检出率可提示文库的多样性，同时反映样本rna的质量。在其中一个实施例中，所述内参基因的扩增引物包括核苷酸序列如seqidno.275～seqidno.298所示的引物序列。在其中一个实施例中，还包括文库扩增引物，所述文库扩增引物包括核苷酸序列如seqidno.299～seqidno.300所示的引物序列。本发明还公开了一种肉瘤融合基因检测系统，包括：检测模块，采用上述的试剂盒进行高通量测序；分析模块，获取上述测序结果，通过生物信息学分析，得到融合基因检测结果；质控模块，通过预定的质控程序校验，校验通过则输出检测结果，校验不通过则提示样本失效。上述肉瘤融合基因检测系统，采用了采用上述的试剂盒进行高通量测序，能够对肉瘤相关的22对融合基因(137个融合转录产物)进行检测，用于辅助软组织肉瘤的病理诊断，还可用于对靶向用药进行提示。并且，上述系统中还设置了质控模块，对样本检测的准确有效性提供了坚实的保障。在其中一个实施例中，所述检测模块中，通过下述步骤进行高通量测序：rna提取：提取生物样本中rna；反转录：将上述rna进行反转录；目的基因扩增：使用上述的试剂盒中的引物组扩增目的基因片段；连接接头：对扩增后各样本的pcr产物连接特异性核苷酸标签接头；文库扩增：将上述连接产物纯化后，以文库扩增引物进行文库扩增，纯化扩增后文库；乳液pcr：将上述文库扩增后的产物经过油包水pcr扩增，得到测序模板；富集：富集上述测序模板；芯片测序：将上述富集的测序模板导入半导体测序系统进行高通量测序。所述生物样本包括：新鲜冰冻组织、石蜡组织或石蜡组织切片。上述检测模块的流程为：基于半导体测序基本原理，将上述22个基因对融合类型设计千重扩增引物，扩增产物两端加上通用的测序接头，构建测序文库，利用乳液pcr技术对测序文库进行扩增，形成测序模板。利用半导体测序系统通过在芯片的微孔中固定dna链，dna聚合酶以单链dna为模板，按照碱基互补配对原理，合成互补的dna链。dna链每延伸一个碱基时，就会释放一个质子，导致局部ph变化，离子传感器检测ph变化，并将化学信号转换成数字信号，从而可以实时判读碱基，最终获得每个dna片段的碱基序列。然后利用生物信息学方法将扩增产物序列与预先配置在ionreportertm服务器的融合类型reference进行比对分析，进而检测标本是否存在基因融合。在其中一个实施例中，所述分析模块中，当样本融合基因reads≥32，则判定为阳性。上述reads指高通量测序平台产生的小片段的序列数据，即可视为测序深度的体现，经过试验验证，当reads大于等于32，则可认为测序结果是可信的，再结合其他质控程序校验，予以报告为阳性。在其中一个实施例中，所述质控模块中，所述质控程序校验包括：内参基因质控校验和/或比对率校验。通过质控程序进行校验，能够提高检测准确性和可靠性，避免出现假阴性和假阳性等问题。在其中一个实施例中，所述检测模块中，采用上述的试剂盒进行高通量测序；所述质控模块中，所述内参基因质控校验为：如所述内参基因中至少5个内参基因的总reads均≥200，则通过内参基因质控校验；所述比对率校验为：如样本比对率≥80％，且匹配的reads总数大于等于46000，则通过比对率校验。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的一种肉瘤融合基因检测试剂盒，对和肉瘤相关的22对融合基因(137个融合转录产物)进行了检测，可用于辅助软组织肉瘤的病理诊断，还可用于对靶向用药进行提示。并且，本发明还通过选用特定的千重扩增引物，扩增产物两端加上通用的测序接头，构建测序文库，利用乳液pcr技术对测序文库进行扩增，形成测序模板，利用半导体测序系统进行测序，能够具有较好的扩增和检测效果，避免检测失控或无效。本发明的一种肉瘤融合基因检测系统，采用了采用上述的试剂盒进行高通量测序，能够对肉瘤相关的22对融合基因(137个融合转录产物)进行检测，用于辅助软组织肉瘤的病理诊断，还可用于对靶向用药进行提示。并且，上述系统中还设置了质控模块，对样本检测的准确有效性提供了坚实的保障。附图说明图1为实施例3中fish阴性结果；图2为实施例3中fish阴性样本的测序图谱。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。实施例1一种肉瘤融合基因检测试剂盒，包括以下引物组：表3.融合基因对及引物组上述引物对为每一融合位点对应一当量引物对计，如col1a1-pdgfb.c15p2.cosf1293和col1a1-pdgfb.c16p2.cosf595以及col1a1-pdgfb.c16p2.cosf596采用相同的引物对，则需按照seqidno.1-2引物对的3倍量加入seqidno.9-10的引物对。本实施例的试剂盒中还包括如下内参基因引物组：表4.内参基因引物组实施例2一种肉瘤融合基因检测系统，包括以下模块：检测模块，采用实施例1的试剂盒进行高通量测序；分析模块，获取上述测序结果，通过生物信息学分析，得到融合基因检测结果；质控模块，通过预定的质控程序校验，校验通过则输出检测结果，校验不通过则提示样本失效。上述检测系统的工作流程如下：一、检测。1、rna提取取ffpe(福尔马林固定石蜡包埋)组织，提取rna。1.1实验前准备a.除非特别指明，所有离心均在室温中进行，离心速度为13200rpm；b.ffpe组织用量：4张10μm厚度，表面积<150mm2(12mm×12mm)玻片，或，2张20μm厚度，表面积<150mm2(12mm×12mm)玻片。用量过多，降低核酸纯化效率；c.washsolution2concentrate使用前需加入168ml无水乙醇充分混匀；d.rnawashbufferconcentrate使用前需加入46ml异丙醇，充分混匀；干式加热器需调节的温度：45℃，55℃，90℃。1.2脱蜡a.加入1ml的二甲苯，剧烈震荡10s。室温，最高速(13.200rpm)离心2min，用枪头吸弃上清。如仍观察到有石蜡存在，重复此步骤。b.加1ml的乙醇(96-100％)于沉淀中，震荡混匀，室温，最高速(13.200rpm)离心2min，弃上清。c.45℃孵育5～10min，直到残留的无水乙醇完全挥发。1.3裂解。向每个样品中加入100～200μlproteasedigestionbuffer重悬；加入10μlprotease充分混匀后55℃孵育1h，接着90℃孵育1h。1.4rna的提取a.在dna提取结束后留下的板1中，每个样品孔中分别加入20μlnucleicacidbindingbeads，加入100μlbindingsolution，加入300μl异丙醇。b.取一个新的96孔板,编号为板2，在每个相对应的样品孔中加入500μlrnawashbufferconcentrate。c.取一个新的96孔板，编号为板3，在每个相对应的样品孔中加入1mlwashsolution2concentrate。d.取一个新的96孔板，编号为板4，在每个相对应的样品孔中分别加入70μlnuclease-freewater，加入20μldnase，加入10μldnasebuffer。e.取一个新的96孔板,编号为板5，在每个相对应的样品孔中加入500μlrnawashbufferconcentrate。f.取一个新的96孔板，编号为板6，在每个相对应的样品孔中加入1mlwashsolution2concentrate。g.取一个新的96孔板，编号为板7，在每个相对应的样品孔中加入50μlelutionsolution。h.取一个新的96孔板和一个新的磁套，把两者套在一起，编号为板8。i.在dna提取结束后，按照仪器提示操作提取rnaj.并将rna转移至新的ep管-20℃保存。1.5测定rna浓度使用rnaassaykit及3.0fluorometer测定rna浓度。由于rna质量直接影响文库的多样性，与实验的成功率有重要的关联。当rna浓度低于2ng/μl时的8例样本都检测失败，因此设定低于3.5ng/μl则重提。2、反转录将上述rna进行反转录。2.1取0.2mlpcr管，向管中加入100ngrna，补水至总体积14μl，运行变性程序：80℃,10min；程序完成后马上放于冰盒上；2.2变性后的产物依次加入5×vilotmrtreactionmix4μl、10×iiienzymemix2μl，充分混匀，微离心，运行程序：25℃10min；42℃,30min；85℃,5min；10℃，保温。3、扩增使用实施例1试剂盒中的引物组扩增目的基因片段，其中引物对的使用按照表3，每一融合位点对应一当量的引物对计，如col1a1-pdgfb.c15p2.cosf1293和col1a1-pdgfb.c16p2.cosf595以及col1a1-pdgfb.c16p2.cosf596采用相同的引物对，则需按照seqidno.1-2引物对的3倍量加入seqidno.9-10的引物对。3.1扩增。a.冰上解冻扩增酶溶液及肉瘤相关融合基因扩增引物，混匀后微离心，按下表配制pcr反应体系：试剂体积(μl)cdna125×ionampliseqtmhifimix45×ionampliseqtmsarcpanel(wg_iad148185)4total20b.上下吹打5次，微离心；c.按下表扩增程序扩增模板：表5.扩增程序3.2消化引物。a.向pcr管中加入2μlfupareagent，总体积为22μl，上下吹打5次，微离心；b.按下表程序进行消化反应：表6.消化程序温度时间50℃10min55℃10min60℃20min10℃≦1h4、连接接头对扩增后的pcr产物连接特异性核苷酸标签接头，用以在后续分析过程中识别样本。a.冰上解冻连接缓冲液和特异性接头；b.按下表比例配制特异性接头稀释液：表7.用于4个反应的特异性接头稀释液组分p1接头特异性接头nuclease-freewater体积(μl)224c.向完成消化的pcr产物中加入以下试剂：d.上下吹打5次，微离心；e.按下表程序进行连接反应：表8.连接程序温度时间22℃30min72℃10min10℃≦1h5、文库扩增将上述连接产物纯化后，以下述文库扩增引物进行文库扩增，纯化扩增后文库；上游：5'ccactacgcctccgctttcctctctatg(seqidno.229)下游：5'ccatctcatccctgcgtgtc(seqidno.230)5.1纯化未扩增文库a.取出xpreagent，使平衡至室温，使用前充分震荡；b.将完成连接反应的扩增产物转移至1.5mlep管中，并加入45μlxpreagent(1.5×样本体积)，上下吹打使充分混匀，室温下放置5min；c.置于磁力架上2min，或至溶液澄清，吸去上清；d.加入200μl新鲜配制的80％乙醇，转动ep管几次，溶液澄清后吸去上清；e.重复步骤d；f.室温放置5min，挥发酒精。5.2扩增文库a.pcrsupermixhighfidelity和libraryamplificationprimermix，分别取50μl和2μl加入纯化后的样本文库中，上下吹打使充分混匀；b.置于磁力架上2min或以上，小心转移50μl上清液至0.5mlpcr管中；c.按下表程序进行文库扩增反应：表9.文库扩增程序5.3纯化扩增后文库注：纯化扩增后文库两步法纯化：第一步加入0.5×样本体积的xpreagent：高分子质量的dna分子结合在珠子上，扩增产物及引物留在溶液中，保留上清；第二步加入1×样本体积的xpreagent：扩增产物结合在珠子上，引物留在溶液中，保留珠子。a.xpreagent，使平衡至室温，使用前充分震荡；b.将完成连接反应的扩增产物转移至1.5mlep管中，并加入25μlxpreagent(0.5×样本体积)，上下吹打使充分混匀，室温下放置5min；c.置于磁力架上5min，或至溶液澄清，转移上清至新的1.5mlep管中；d.加入50μlxpreagent(1×样本体积)，上下吹打使充分混匀，室温下放置5min；e.置于磁力架上3min，或至溶液澄清，吸去上清；f.加入150μl新鲜配制的80％乙醇，转动ep管几次，溶液澄清后吸去上清；g.重复步骤f；h.室温放置5min，挥发酒精；i.加入50μldna洗脱液重悬珠子，上下吹打使充分混匀，置于磁力架上2min或以上，小心转移50μl上清液至新管中；5.4测定文库浓度。参照测定gdna浓度步骤，吸取5μllibrary使用dsdnahsassaykit及2.0fluorometer测定文库浓度，并记录浓度数据。实践中8例检测失败的样本的rna文库浓度均低于1000ng/ml。由此保守推荐：如果出库浓度低于1000ng/ml,则考虑重新构库。6、乳液pcr将上述文库扩增后的产物经过油包水pcr扩增(iononetouchtm2)，得到测序模板。a.将构建的library稀释至3ng/ml；pooling按每个样本25mbp，每次上满32个样本(按318chip计算：800m/25m＝32个)；b.往两个收集管中各添加150μlbreakingsolution，放置于仪器相应的位置；c.充分震荡ionpgmtmhi-qtmreagentmix、ionpgmtmhi-qtmisps(1min以上)，微离心，迅速吹打几下，加入到反应体系中。ionpgmtmhi-qtmenzymemix微离心。d.按以下比例配制油包水pcr的水相：充分震荡以上反应体系，微离心，全部吸入到反应槽中。e.再向反应槽中加入1.7mlreactionoil，进行油包水pcr反应。f.油包水pcr反应结束后，从onetouch上把两个收集管取出，吸去两收集管中的上清，大概留50μl的液体，上下吹打混匀2个收集管中的溶液，并吸到新的1.5mlep管中。g.加1mliononetouchtmwashsolution到2个收集管中，吹打混匀，把所有的液体转移到ep管中，15,500g离心3min。h.吸去上清，留大概100μl的液体。7、富集以iononetouchtmes富集上述测序模板：a.按以下的比例制备melt-off溶液：b.把myonetmstreptavidinc1beads充分震荡，微离心。c.取一个新的1.5ml的ep管，吸取130μlmyonetmbeadswashsolution到ep管中，加入20μlmyonetmstreptavidinc1beads，上下吹打几次，震荡微离心，磁力架上放置2min，吸去上清，再往ep管中加入130μlmyonetmbeadswashsolution，震荡微离心。d.加样到es的8联管中：进行es反应:将8联管放置es仪器的槽的右端；取1个200ul的pcr管，加入10ulneutralizationsolution，放置于富集仪模板收集管处；插入专用的tip；按start开始富集反应。f.反应结束后，取出收集管，15,500g，离心2min。g.吸去上清，吸剩10μl液体左右，加入200μliononetouchtmwashsolution，上下吹打10次，15,500g，离心2min。h.吸去上清，留下大概10μl液体，加入90μliononetouchtmwashsolution。i.再往管中加入5μlcontrolionspheretmpartides，加入100μlannealingbuffer，上下吹打混匀，15,500g，离心2min。j.吸去上清，吸剩3μl(314芯片)/15μl(316/318芯片)。k.往管中加入3μl/12μlsequencingprimer，上下混匀，微离心，总体积为6μl/27μl。l.在abi9700pcr仪中，按以下程序进行处理：95℃,2min→37℃,2min→25℃保温m.向pcr管中加入1μl/3μlionpgmtmhi-qtmsequencingpolymerase，室温放置5min；准备loading芯片或长时间可放置于4℃。8、芯片测序将上述富集的测序模板导入半导体测序系统iontorrentpgmtm进行高通量测序。二、分析。获取上述测序结果，通过生物信息学分析，得到融合基因检测结果，当样本融合基因reads≥32，则判定为阳性。三、质控。通过预定的内参基因质控校验和比对率校验，校验通过则输出检测结果，校验不通过则提示样本失效。1、内参基因质控校验：如所述内参基因中至少5个内参基因的总reads均≥200，则通过内参基因质控校验。2、所述比对率校验：如样本比对率≥80％，则通过比对率校验。实施例3肉瘤融合基因检测方法学验证。一、样本来源。1、18例capsarcomatranslocationpt项目样本，为官方(cap)确认样本的融合基因的状态。2、临床收集sarcomaffpe样本：共21例，玻片1～3片，所有样本经fish进行过相关检测，检测结果显示如下：表10.21例临床sarcffpe样本相关信息以上fish检测结果判断标准如下：1)分析200个细胞，阳性信号的细胞数大于25％，判为重排阳性；2)阳性信号的细胞数小于10％，判为重排阴性；3)阳性信号在10％～25％之间的样本，进行重新检测；第二次检测的阳性信号大于15％的样本判为重排阳性；小于15％的样本判为阴性。3、正常人群样本：选择10例来源于移植供者外周血，提取总rna作为阴性样本。二、生物信息学分析手段ionpgm产生的数据传送到torrentserver进行处理：1)本检测采用测序仪数据分析配套的torrentserver(version5.4.0)进行处理，最终生成bam文件；2)bam文件传送至ionreporter采用wg_iad148185(该文件包括引物设计的相关bed文件与panel的参考序列)插件对bam文件进行注释；3)ionreporter分析得到融合基因结果，最终使用igv软件(版本号2.3.72)人工确认融合位点。4)初始数据qc参数：totalmappedfusionpanelreads>40000，fusionread_count>20，且fusionreadcountsper100ktotalmappedreads(cp100k)>25。本检测数据经ionreporter(version5.6)分析得出的序列数据记录的格式为每个靶点有多少读数。这些检测具有很高的灵敏度，和其他大部分分析平台一样，在解读结果时应考虑到背景信号水平，本发明利用cp100k数值评估特异性融合基因的检测结果。cp100k数值即readcountsper100kreads，其综合考虑了测序深度与检出target的read数据，计算公式为：三、引物特异性。1、引物合成本发明的pcr扩增引物由thermofisherscientific公司合成，将read数据与参考序列比对，序列比对结果显示与预期一致。2、mappingrate比对率(mappingrate)是反映引物扩增特异性的重要参数。上述sarcomaffpe样本的测序数据统计如下：表11.测序数据统计参数meanstdevlow99％cimappingrate94.6％4.2％82.1％验证中发现，扩增引物会产生一定的引物同聚物，据此，测序数据的mappingrate>80％,否则提示ffperna降解严重或者建库效率不理想。并且，测序后的样本序列与参考序列比对，得到totalmappedreads，即该样本的有效数据量。分析中发现，可分析的实验例数为71例，最小值，1/4分位，中位数，3/4分位和最大值分别为：2，62233.5，136579，231116，569032。本验证过程中，fusionsampleqc设置为totalmappedfusionpanelreads>20000。根据上文，我们的ppa为100％。假设所有样本的totalmappedreads为20000，计算fusionreadcounts，去判断阳性样本是否仍然检测为阳性。数据显示，所有阳性样本的fusionreadcounts值中，最低是81.8，所以即使totalmappedreads降低到为20000，阳性样本仍然被准确判断为阳性。提示当数据量达到20000mappedreads已具有较好的阳性检出能力。结合复查率，minimumnumberofmappedreads设定越高，复查的可能性越大。因此，设定复查率为80％，那么minimumnumberofmappedreads为46228。即：设定最低匹配序列总数>46000,且mappingrate>80％。3、内参基因质量控制标准本实施例中，初始模板为rna，采用多重pcr扩增技术富集目的基因cdna。由于rna的表达差异与pcr扩增的特点，所以覆盖均一性参数并不适用。但为了增加文库的多样性，本panel纳入12个广泛表达的内参基因(myc，tbp，jun，cfhr5，afm，lmna，mrpl13，mttp，itgb7，hmbs，apob，lrp1)。以下列举6例软组织肉瘤样本的内参基因表达值(cp100k)。内参基因的检出率提示文库的多样性，同时反映样本rna的质量。为确认阴阳性判断标准，对以下样本进行统计和计算，得到内参的控制标准为：12个看家基因当中，至少有5个基因的(totalreads)≧200允许进行下步分析。表12.内参基因的表达数据(部分数据)注：mttp基因在白细胞与软组织中的表达均较低，数据不显示。四、最低检出限。1、空白检出限1.1验证样本：纯水(ntc)。1.2验证方法：将纯水样本同其他样本一起进行正常构库，测序分析后所得数据如下。表13.空白样本数据参数均值标准差x±3sdlibraryconcentration(ng/ml)198.2217.0[-452.9，849.3]mappedreads7.68.0[-16.5，31.7]meanlength(bp)39.06.1[20.6，57.4]通过上述结果可以看出：1)如若样本文库的浓度<1000ng/ml，提示ffperna降解严重或者建库效率不理想；2)如若ntc的mappedreads>32，判断为本批检测样本污染，需排查原因，并行失控处理；在数据分析时，当融合基因read≤32时，应报告为未检测到融合基因：2、融合基因检出限。根据10正常人提取的rna的数据，我们评估建库流程可能存在的交叉污染(即出现与同一批次的其他阳性样本相同类型的融合基因，并在重复实验时消失)：实验中发现1例样本(sarc-hxq)检出融合基因ewsr1-atf1，readcount为44，计算其cp100k值为22。当cp100k<25，即判为阴性。即：1)当融合基因reads>32,但cp100k<25时，判为阴性；2)且当融合基因的cp100k<25时，可能会导致假阴性结果。3、最低rna输入量为验证最低rna输入量，我们将11例capsarcomatranslocationpt项目样本以等量混合，然后从中分别取10ng,20ng,30ng,50ngrna(每个梯度设3个重复)进行建库实验。该11例样本均经过单独检测，并成功检测融合基因。该混合样本含4个融合基因，其cp100k值如下：表14.4个融合基因cp100kfusiongenescp100kpax3/foxo1,t(2；13)2326ewsr1/atf1,t(12；22)190ewsr1/fli1,t(11；22)15330ewsr1/wt1,t(11；22)8417本发明针对临床ffpe组织提取的rna，质量差，我们特意选取降解严重的样品rna。在此我们分别探讨rna输入量对建库成功率与融合基因检出率的影响。1)按照mappingrate≥80％,mappedreads>40000,readcount>200的内参基因≧5的qc条件，12个文库中有5个通过。4个组的检测成功率没有差别。因此我们保守建议将rna输入量定为100ng。2)5个通过qc的数据中，只有一个样本(sarc-i-10ng-02)检测出全部4个融合基因(判读标准：融合基因reads≧32,cp100k>25)，同时该样本的mappingrate最高，达到97％。其余4个样本均只检测出3个丰度较高的融合基因(除了ewsr1/atf1，其cp100k值最低)。因此，定义本检测的最低突变频率检出限为：融合reads≥32，qc参数：mappingrate≥80％,mappedreads>40000,readcount>200的内参基因数≥5时，突变检出下限(cp100k值)为50。后面所有参数分析时，均依据本判断标准进行突变分析。五、准确性。本验证中纳入10例正常人的白细胞样本与18例capsarcomatranslocationpt项目样本以及21例临床sarcffpe样本。49例样本中10例没有通过qc，不纳入统计。余39例样本中，由对比方法(pcr扩增或fish)检测确认：21阳性样本，18例阴性样本。由于参比方法的检测范围不同，统计时只以融合基因计算。表15.准确性统计数据根据上表，计算检测准确率：accuracy＝(tp+tn)/(tp+fp+tn+fn)，即accuracy＝(21+470)/(491)，亦即100％。检测敏感性即阳性比例一致性，即ppa＝tp/(tp+fn)，为100％；阳性预测值，即ppv＝tp/(tp+fp)，为100％。六、检测特异性。本检测的检测特异性定义为阴性符合率。根据是上表15，计算检测特异性：npa＝tn/(tn+fp),为100％。npv，即阴性预测值＝tn/(tn+fn)，为100％。然后，在检测过程中，我们发现一例ngs法与fish检测的结果不一致的样本。随后采用sanger测序方法进行确认，sanger测序的结果与ngs法一致。详细如下：ngs数据显示，ft18ewsr1-0006样本检测到ewsr1-wt1阳性，totalmappedreads为87307，cp100k为29637，其基因重排的断裂点具有惟一性(其他样本未见)。重复实验确认，ft18ewsr1-0006仍为ewsr1-wt1阳性。该样本的fish结果如图1所示，即为阴性结果。而fish检测的下限为10％，低于10％可能导致假阴性。我们采用梯度稀释的方法确认ngs法能够检测低于10％的ewsr1-wt1融合变异：取样本sarc-1506，将其融合基因比例定义为100％，与一融合基因阴性样本sarc-hxq，按比例混合获得融合基因比例分别为20％，10％，5％与1％的rna样本，进行平行ngs实验。数据显示如下，4个梯度均能被检测到阳性的融合基因。所以本ngs方法具有较好的灵敏度，其检测下限可到达1％。数据如下：表16.ngs检测结果数据ratio20％10％5％1％variantsewsr1-wt1ewsr1-wt1ewsr1-wt1ewsr1-wt1readcounts110843130952360totalmappedreads542462227321325772212402readcountsper100k20431377292169totalmappedreads>20000passpasspasspass再者，我们采用sanger测序确认该样本的变异。我们根据检出的融合基因的参考序列设计pcr引物，对ft18ewsr1-0006样本的cdna进行扩增并采用abi3730xldnaanalyzer(thermofisher)测序。引物序列如下：ews-wt-m13f:5’-tgtaaaacgacggccagttatagccaacagagcagcag-3’；ews-wt-m13r:5’-caggaaacagctatgacctggtgtcttttgagctggtc-3’采用sequencer软件进行分析，测序图谱如图2所示。提取序列为：tgtaaaacgacggccagttatagccaacagagcagcagctacggggcagcagagtgagaaaccataccagtgtgacttcaaggactgtgaacgaaggttttctcgttcagaccagctcaaaagacaccaggtcatagctgtttcctgaa。blast结果显示为ewsr1-wt1基因融合的序列。综上，我们确认ft18ewsr1-0006检测到ewsr1-wt1阳性。sanger测序结果与ngs法的结果一致。七、精密度。本检测的精密度为对标本进行重复检测得到同一结果的能力，包括批内和批间精密度，数据如下：1、批内精密度对2例样本设置3复孔，作平行检测，结果显示均检出同一融合基因。精密度满足临床需要，结果如下。表17.批内精密度结果样本重复01重复02重复03sarc-1501pax3-foxo1pax3-foxo1pax3-foxo1sarc-1506ewsr1-wt1ewsr1-wt1ewsr1-wt12、批间精密度对5例样本进行3个批次检测，评估不同天，不同技术员间的差异，检测结果统计如下所示，精密度满足临床需要。表18.批间精密度结果以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>广州金域医学检验中心有限公司<120>肉瘤融合基因检测试剂盒及系统<160>230<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgatacaacccgacgacag19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggtcgcttcccctgtgatg19<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cgatacaacccgacgacag19<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggtcgcttcccctgtgatg19<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ccctcgggaccaaggatca19<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gatttcgactcggcgtact19<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cgacgcaagggagatcgt18<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gcggttgcgtatcatcaactga22<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tgatcgacgtactcgacgtg20<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gcggttgcgtatcatcaactga22<210>15<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cgcccgagcgtctgaag17<210>16<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16gcggttgcgtatcatcaactga22<210>17<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17cgtgcgcctcgtggaaa17<210>18<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gcggttgcgtatcatcaactga22<210>19<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19cgcctcctcgacccaag17<210>20<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20gcggttgcgtatcatcaactga22<210>23<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23cccaaaggatctcctcgagaag22<210>24<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24gcggttgcgtatcatcaactga22<210>25<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25cacgacagcgtcgacagat19<210>26<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26gcggttgcgtatcatcaactga22<210>29<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29tccgacctcgtgcgaaag18<210>30<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30gcggttgcgtatcatcaactga22<210>31<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31ctccacgagaacgagcgaa19<210>32<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32gcggttgcgtatcatcaactga22<210>35<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gacgcacgacacgaagg17<210>36<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36gcggttgcgtatcatcaactga22<210>37<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37cttcagggaatcgctcgagaa21<210>38<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38gcggttgcgtatcatcaactga22<210>39<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39cgcacccacgactgact17<210>40<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40gcggttgcgtatcatcaactga22<210>41<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41cctcgagacaagcgagaaaca21<210>42<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42gcggttgcgtatcatcaactga22<210>43<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43gcggaacctcgagatcgt18<210>44<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44gcggttgcgtatcatcaactga22<210>45<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45cctgcgcccattcgaaatcat21<210>46<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46gcggttgcgtatcatcaactga22<210>47<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>47tcgaccccctcgacgta17<210>48<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>48gcggttgcgtatcatcaactga22<210>49<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>49accacctcgagaacatcgac20<210>50<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>50gcggttgcgtatcatcaactga22<210>51<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>51ttcgtggacacgcacga17<210>52<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>52gcggttgcgtatcatcaactga22<210>53<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>53cccctggattgcgtggac18<210>54<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>54gcggttgcgtatcatcaactga22<210>57<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>57ctcgtgcgaagacacgagat20<210>58<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>58gcggttgcgtatcatcaactga22<210>61<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>61cgagacaagcgagagacagg20<210>62<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>62gcggttgcgtatcatcaactga22<210>63<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>63tcctgcgtctcctcgagaa19<210>64<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>64gcggttgcgtatcatcaactga22<210>65<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>65caaagatggactcaaccgactc22<210>66<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>66gcggttgcgtatcatcaactga22<210>67<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>67cacctcgccagacctcaa18<210>68<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence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