一株能够防治芝麻枯萎病且具有促生和诱导抗性作用的拜赖青霉及其筛选方法和应用与流程

本发明涉及一株能够防治芝麻枯萎病且具有促生和诱导抗性作用的拜赖青霉及其筛选方法和应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

镰刀菌引起的枯萎病是一类世界性分布的重要土传病害，危害多种粮食作物和经济作物，被称为植物的癌症。尖孢镰刀菌在植株的全生育期均可侵染，通常是侵染寄主植物输导组织维管束系统，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响作物的产量和品质，是生产上最难防治的重要病害之一。

目前防治枯萎病的主要方法是培育抗病品种、使用化学药剂和利用农业措施等，但由于枯萎病属于土传病害，在防治中往往效果都不太理想，缺乏有效的防治手段。因此使用对人体和生态环境无害的微生物制剂及其代谢产物替代化学农药，已成为世界范围内的发展方向。我国已报道的对枯萎病病原菌有抑制作用的生防菌主要有木霉、丛枝菌根菌、淡紫拟青霉菌、荧光假单胞杆菌、放线菌等。青霉在芝麻枯萎病上的防治应用未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株能够防治芝麻枯萎病且具有促生和诱导抗性作用的拜赖青霉及其筛选方法和应用，该拜赖青霉对芝麻尖孢镰刀菌具有强抑菌活性，且能促进芝麻生长，诱导芝麻对枯萎病的抗性，对芝麻上其他主要病害的病原菌也具有良好的抑制效果。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一株能够防治芝麻枯萎病且具有促生和诱导抗性作用的拜赖青霉，所述的拜赖青霉为拜赖青霉(penicilliumbilaiae)47m-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学保藏中心，保藏编号：cctccm：2018899，保藏日期：2018年12月17日。

拜赖青霉的筛选方法：采用平板稀释分离法，将三门峡市渑池县西村乡石沟村的土壤样品，加无菌水制成不同梯度的稀释液，取100μl不同梯度的稀释液，涂布孟加拉红培养基，挑取单菌落分离纯化后，以尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)为靶标菌，利用平板抑菌试验筛选出对芝麻尖孢镰刀菌具有强抑菌活性的菌株，并鉴定为拜赖青霉。

一种拜赖青霉在防治芝麻病害方面的应用。

一种拜赖青霉在促进芝麻生长方面的应用。

一种拜赖青霉在诱导芝麻对枯萎病的抗性方面的应用。

一种拜赖青霉在制备防治芝麻枯萎病且促进芝麻生长和诱导芝麻对枯萎病抗性的菌剂中的应用。

一种利用拜赖青霉制备的具有防治芝麻枯萎病、促进芝麻生长和诱导芝麻对枯萎病产生抗性作用的菌剂。

一种上述菌剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将拜赖青霉接种于pda培养基上，在28℃、16h光照/8h黑暗的恒温培养箱中培养5d，用0.05％(v/v)的吐温80无菌水洗脱孢子，形成孢子悬浮液；

(2)按黄豆120g/袋，麦芽糖0.12g/袋，水60ml/袋配制固体发酵培养基；将配制好的固体发酵培养基，平铺放置10～12h后，121℃灭菌30min；

(3)在固体发酵培养基上接种5ml孢子悬浮液充分混匀后，继续平放过夜，然后置于28℃黑暗恒温培养箱中培养7～10d，待固体发酵培养基充分产孢时，将固体发酵物平铺到铺有一层无菌报纸的白瓷盘中，盖上1层无菌报纸，放置在阳光可照射的玻璃窗前晾5～7d，晾干后，收集孢子粉，形成高孢粉，即菌剂，高孢粉中拜赖青霉的孢子含量为2.3×10¹¹cfu/g。

pda培养基为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，添加蒸馏水定容至1000ml，分装于三角瓶中，121℃灭菌30min。

一种菌剂的使用方法：菌剂用0.05％(v/v)的吐温80无菌水重悬，并调整孢子浓度为1×10⁸cfu/ml，灌根于芝麻根部周围。

本发明有益效果：

本发明的目的是生物防治芝麻枯萎病，通过平板对峙和含药平板法、盆栽防病试验，首次从三门峡市渑池县西村乡石沟村的土壤样品中筛选出能够防治芝麻枯萎病的生防菌47m-1，经鉴定该菌株为拜赖青霉，该菌株不仅对芝麻尖孢镰刀菌有强烈的抑制作用，且对芝麻上其它主要病害的病原菌具有广谱的抑菌活性。试验表明，菌株的高孢粉对芝麻枯萎病的防效能达到50％，能够有效降低芝麻枯萎病的发病率，其治疗效果优于现有的常用化学农药多菌灵。本发明筛选的拜赖青霉使用后可促进作物生长，诱导作物产生抗性，且对作物没有致病性，也不会产生抗药性、农药残留、环境污染等化学农药常见问题，对人畜健康、环境友好，符合人们对生态农业的需求。

附图说明

图1为菌株47m-1及其发酵滤液对芝麻尖孢镰刀菌的平板抑菌试验结果。图中，a为平板对峙；b为平板对峙的对照；c为含药平板；d为含药平板的对照。

图2为菌株47m-1的calmodulin(钙调蛋白)序列的系统发育进化树。

图3为菌株47m-1对盆栽芝麻的促生试验结果。

图4为菌株47m-1对芝麻根部抗病相关基因npr1、coi1、pr1、pr2和pr3的相对表达量的影响。图中不同小写字母(a、b、c、d)表示同一时间点的不同处理之间在0.05水平存在显著差异。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实验材料：

孟加拉红培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，1/3000(w/v)孟加拉红溶液100ml，氯霉素0.1g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml，ph7.2±0.2。

查氏琼脂(cz)：查氏浓缩液10ml，k2hpo41.0g，蔗糖30g，琼脂17.5g，蒸馏水1000ml。

查氏酵母膏琼脂(cya)：k2hpo41g，查氏浓缩液10ml，酵母抽提物5g，蔗糖30g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。

麦芽汁琼脂(mea)：麦芽提取物(maltextract)20g，蛋白胨1g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。

25％甘油硝酸盐琼脂(g25n)：k2hpo40.75g，查氏浓缩液7.5ml，酵母抽提物3.7g，甘油(分析纯)250g，琼脂12g，蒸馏水750ml。

查氏浓缩液：nano330g，kcl5g，mgso4·7h2o5g，feso4·7h2o0.1g，znso4·7h2o0.1g，cuso4·5h2o0.05g，蒸馏水100ml。

pda培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，加蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌30min。pd培养液为不加琼脂的pda。

ms培养液：i取50ml，ii、iii和iv各取5ml，补水至1000ml。

i：nh4no333g，kno338g，cacl2·2h2o8.8g，mgso4·7h2o7.4g，kh2po43.4g，蒸馏水1000ml；

ii：ki0.166g，h3bo31.24g，mnso4·4h2o4.46g，znso4·7h2o1.72g，na2moo4·2h2o0.05g，cuso4·5h2o0.005g，cocl2·6h2o0.005g，蒸馏水1000ml；

iii：feso4·7h2o5.56g，na2·edta·2h2o7.46g，蒸馏水1000ml；

iv：肌醇20g，烟酸0.1g，vb60.1g，vb10.02g，甘氨酸0.4g，蒸馏水1000ml。

实施例1、土壤微生物的分离及筛选

在三门峡市渑池县西村乡石沟村的土壤样品中，称取1g室温晾干的土壤，研磨过筛，加入10ml无菌水中充分振荡获得土壤悬浮液，然后将土壤悬浮液摇匀后做梯度稀释，取100μl不同梯度的稀释液涂布于孟家拉红培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养48h，至菌落长出，挑取大小、颜色或形态不同的菌落在pda培养基上分离纯化。

利用平板对峙方法筛选生防菌：将芝麻尖孢镰刀菌接种在pda培养基上，在28℃下培养5～10d，用无菌打孔器打取直径5mm的圆形菌丝块，接种到新的pda培养基中央，分离菌接种到距尖孢镰刀菌30mm对称的位置，同时设置单独接种病原菌菌块作为对照。每处理3次重复，5d后观察对峙培养结果(表1)。

利用含药平板法测定分离菌抑菌率：取培养5～7d的分离菌，收集孢子，并调整孢子浓度为1×10⁸cfu/ml，取3ml接入100mlpd培养液中，于28℃、180r/min摇瓶发酵5d，用4层无菌纱布过滤去除菌丝球，再用直径0.22μm的微孔滤膜过滤2次，然后将滤液与pda培养基以1：9(v/v)混匀制备含药平板，同时设置pda中加入无菌水作为对照，在每板中央接入直径5mm的尖孢镰刀菌菌块1个。于28℃恒温培养，5d后观察结果(表1)。

通过平板对峙筛选到对芝麻尖孢镰刀菌抑菌活性较强的菌株8株，再通过含药平板进行复筛，发现47m-1发酵滤液的抑菌活性最强，完全抑制了尖孢镰刀菌的生长，结果表明菌株47m-1在平板对峙及含药平板中的抑菌活性均为最强(图1)。

表1芝麻尖孢镰刀菌拮抗微生物的筛选结果

实施例2、菌株47m-1对芝麻上其它主要病害病原菌的抑制效果

据实施例1所述的方法，测定菌株47m-1对芝麻上其他主要病害的病原菌的抑制作用，结果如表2，在平板对峙试验中，菌株47m-1对芝麻菜豆壳球孢(macrophominaphaseolina)、茄病镰刀菌(fusariumsolani)、索氏平脐蠕孢(bipolarissorokiniana)、多主棒孢(corynesporacassiicola)和立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)的抑菌圈直径均在20mm以上；在含药平板试验中，除多主棒孢外，其他病原菌均受到强烈抑制。说明该分离菌47m-1对芝麻上病害的病原菌具有广谱抑菌活性。

表2菌株47m-1及其发酵滤液对芝麻上其他主要病原菌的抑制效果

实施例3、菌株47m-1的鉴定

将活化的菌株47m-1转接到形态鉴定培养基上，置于28℃培养箱中，黑暗培养7d，观察记录菌株47m-1在四种形态培养基上的培养特征。提取47m-1的基因组dna，用通用引物扩增其its和calmodulin(钙调蛋白)基因的序列，将测序结果在ncbi上进行比对，选择相似性高的模式菌株的序列建立系统发育进化树。

47m-1的形态特征：菌株47m-1在g25n上的菌落形态：菌落有辐射沟，轻度产孢，菌落灰绿色，绒状，边缘3～4mm白色，无分泌物液滴，无可溶性色素，背面肉粉色，边缘浅粉色。菌株47m-1在cya上菌落形态：菌落有辐射沟，中度产孢，菌落孔雀绿色，絮状，边缘3～4mm白色，产分泌物液滴，产褐色可溶性色素，背面亮黄色。在cya培养基上的分生孢子单轮生，光滑，梗长条形，分生孢子球形。菌株47m-1在cz上菌落形态：无辐射沟，中度产孢，菌落孔雀绿色，絮状，边缘3～4mm白色，产分泌物液滴，产褐色可溶性色素，背面亮黄色。菌株47m-1在mea上菌落形态：菌落无辐射沟，轻度产孢，菌落墨绿色，绒状，中心附近絮状，边缘4～5mm黄白色，无分泌物液滴，产浅黄色可溶性色素，背面黄色。

47m-1的测序结果：对菌株47m-1的its及calmodulin(钙调蛋白)进行测序，测序结果与ncbi数据库中拜赖青霉的相似性均为99％，在两序列的系统发育分析(图2)中，47m-1均与拜赖青霉聚在同一分支，据形态和its及calmodulin序列的进化分析，鉴定47m-1为拜赖青霉(penicilliumbilaiae)。

its基因测序结果为：

ccggcgtccgactgaggactctgggtccacctcccacccgtgtctcttgtaccatgttgcttcggcgagcccgcctcacggccgccggggggcatctgcccccgggcccgcgcccgccgaagccccctctgaacgctgtctgaagattgcagtctgagcgataagcaaaaattatttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcctccgtcctccccccggggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgtgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctctgtaggcccggccggcgctggccgaccctccaaccccattttttcaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa(seqidno.1)

calmodulin基因测序结果为：

gccaatggagcgatttcgttgattggaaaaagcgtcgcctggaatcaacactaatggatgctttttcccgggaaataggacaaggatggcgatggtgagtgcgatcgtactcgggctcgataatttcaagatccgattatgtcctcttgaccgagtgaacaaatcactgagatgaataaattcgataggacaaatcaccaccaaggagctgggcactgtcatgcgctccctcggccagaacccttccgagtctgagctgcaggatatgatcaacgaggtcgacgccgataataacggtaccatcgatttccctggtacgctctccctcccctccgaatgatgatctcaagccccgagaagactgatattgacattgcgacacagagttccttaccatgatggcacgtaagatgaaggacaccgactccgaggaggagatccgtgaggctttcaaggtgttcgaccgcgacaacaacggcttcatctccgccgccgagctgcgccacgtcatgcctccatcgga(seqidno.2)

实施例4、拜赖青霉47m-1的菌剂制备

(1)将拜赖青霉接种于pda培养基上，在28℃、16h光照/8h黑暗的恒温培养箱中培养5d，用0.05％(v/v)的吐温80无菌水洗脱孢子，形成孢子悬浮液；

(2)按黄豆120g/袋，麦芽糖0.12g/袋，水60ml/袋配制固体发酵培养基；将配制好的固体发酵培养基，平铺放置10～12h后，121℃灭菌30min；

(3)在固体发酵培养基上接种5ml孢子悬浮液充分混匀后，继续平放过夜，然后置于28℃黑暗恒温培养箱中培养7～10d，待固体发酵培养基充分产孢时，将固体发酵物平铺到铺有一层无菌报纸的白瓷盘中，盖上1层无菌报纸，放置在阳光可照射的玻璃窗前晾5～7d，晾干后，收集孢子粉，形成高孢粉，即菌剂，高孢粉中拜赖青霉的孢子含量为2.3×10¹¹cfu/g。

实施例5、拜赖青霉47m-1对芝麻枯萎病的防治效果

芝麻种子(武昌桠麻)经2％(w/v)naclo消毒15～20min，用无菌蒸馏水冲洗3遍后，平铺到无菌滤纸上晾干。将消毒过的芝麻种子点播到装有无菌纯蛭石的育苗盘中，每穴2粒，育苗盘置于30℃16h光照/28℃8h黑暗的恒温培养箱中培养，定期浇灌ms培养液。

治疗作用：选取长势一致的4叶1心期芝麻幼苗，先蘸根接种尖孢镰刀菌(1×10⁶cfu/ml)，3d后，用不同处理液对芝麻进行灌根处理，每个处理35株，每株灌根3ml，10d后，统计发病率和病情指数，计算防治效果。

预防作用：选取长势一致的4叶1心期芝麻幼苗，先用不同处理液对芝麻进行灌根处理，每个处理15株，每株灌根3ml，3d后再蘸根接种尖孢镰刀菌(1×10⁶cfu/ml)，10d后，调查发病情况并计算发病率、病情指数和防治效果。

所用处理液分别为：

a：拜赖青霉47m-1的高孢粉稀释液，孢子浓度为1×10⁸cfu/ml；

b：枯草芽孢杆菌制剂稀释液，菌悬液浓度为1×10⁸cfu/ml(制剂为宁国市百立德生物科技有限公司生产，制剂商品名为10亿cfu/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂)；

c：多菌灵50％可湿性粉剂500×稀释液(制剂为江苏蓝丰生物化工股份有限公司生产)；

d：无菌水(对照组ck)。

芝麻枯萎病分级标准：

0级：长势良好未表现症状；

1级：叶片自下而上轻度萎蔫，似缺水状，早晚尚能恢复；

2级：病株叶片萎蔫，不能再恢复正常；

3级：整株萎蔫，不能恢复正常，茎基部维管束变为黄褐色，全株死亡。

病情指数＝σ(各级病株数×对应各级级值)/(调查总株数×最高级级值)×100

发病率(％)＝发病植株数/处理总株数×100

相对防效(％)＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100

结果见表3、4。结果表明，拜赖青霉47m-1对芝麻枯萎病的治疗效果和预防效果均达到50％，且明显降低了病株率，在先接种病原菌再用拜赖青霉47m-1处理的情况下，防治效果明显优于对照药剂枯草芽孢杆菌和多菌灵。

表347m-1对枯萎病的治疗效果

表447m-1对枯萎病预防效果

实施例6、拜赖青霉47m-1对芝麻的促生作用

拜赖青霉47m-1的菌悬液：将高孢粉稀释至1×10⁸cfu/ml，备用。

发酵滤液：将1×10⁸cfu/ml的菌悬液按3％接种到100mlpd培养液中，摇床28℃，180r/min震荡培养5d，用0.22μm的滤膜过滤两遍去除菌丝，为无菌滤液。

芝麻种子(郑芝13)用2％(w/v)naclo消毒15～20min，无菌蒸馏水冲洗3遍，平铺到无菌滤纸上晾干。将灭菌土：蛭石以3:1(w/w)装入营养钵，将消毒过的芝麻种子点播到营养钵中，每穴6-7粒，将营养钵置于30℃16h光照/28℃8h黑暗的恒温培养箱中培养。

取长势一致的4叶1心期芝麻幼苗，用拜赖青霉47m-1的菌悬液和发酵滤液灌根处理芝麻，每盆20ml，每处理3盆，以无菌水处理为对照。7d后做第二次灌根处理，距第一次处理2周后测量芝麻苗的根长、株高、根部与地上部的干重和湿重。干重处理用105℃杀青30min后，然后80℃烘干至恒重，称量。

结果表明(图3、表5)，拜赖青霉47m-1能够增加芝麻的株高、根长、湿重和干重。拜赖青霉47m-1的菌悬液对芝麻根系的促生作用明显，地上部分干重增加了5.92％，根部干重增加了29.44％，而其发酵滤液对植株地上部分的促生作用明显，地上部分干重增加了8.25％，而根部干重增加了3.7％，说明拜赖青霉47m-1具有良好的促生作用。

表5拜赖青霉47m-1对芝麻的促生作用

实施例7、拜赖青霉47m-1诱导芝麻对枯萎病的抗性

提取不同处理芝麻根部的总rna，并检测其纯度、浓度及完整性。然后合成并检测第一链cdna，合成抗病相关基因的引物，采用实时荧光定量pcr检测各基因相对表达量的变化。试验所设置的4个处理为：t1：拜赖青霉47m-1灌根诱导2d后，蘸根接种尖孢镰刀菌；t2：无菌水灌根2d后，蘸根接种尖孢镰刀菌；t3：拜赖青霉47m-1灌根诱导2d后，无菌水蘸根处理；t4：无菌水灌根2d后，无菌水蘸根处理。处理完成后立即取样，为0h，之后取样均以0h为对照。

试验结果表明：拜赖青霉47m-1灌根诱导处理芝麻根部2d后，再接种尖孢镰刀菌，芝麻根部npr1、coi1、pr1、pr2和pr3基因在8h时即开始明显上调表达，同单接病原菌的植株相比，在所有取样时间点均显著上调表达。而只接拜赖青霉47m-1组，同比于清水对照组，以上所有基因也不同程度的上调表达(图4)。说明拜赖青霉47m-1能够诱导芝麻根部的抗病性，通过诱导抗性提高对芝麻枯萎病的防治效果。

序列表

<110>河南省农业科学院植物保护研究所

<120>一株能够防治芝麻枯萎病且具有促生和诱导抗性作用的拜赖青霉及其筛选方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>561

<212>dna

<213>拜赖青霉(penicilliumbilaiae)

<400>1

ccggcgtccgactgaggactctgggtccacctcccacccgtgtctcttgtaccatgttgc60

ttcggcgagcccgcctcacggccgccggggggcatctgcccccgggcccgcgcccgccga120

agccccctctgaacgctgtctgaagattgcagtctgagcgataagcaaaaattatttaaa180

actttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataa240

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<211>523

<212>dna

<213>拜赖青霉(penicilliumbilaiae)

<400>2

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tcatctccgccgccgagctgcgccacgtcatgcctccatcgga523