一种利用甜叶菊渣固体发酵木霉菌种及其制备方法与流程

本发明属于生物工程领域，涉及一种利用甜叶菊渣固体发酵木霉菌种的技术。

背景技术：

木霉属真菌(trichoderma，以下简称木霉)是一类重要的土壤习居菌，其孢子萌发及菌丝生长能够适应较广的土壤温湿度和ph范围，并凭借重寄生作用、抗生作用、竞争作用和诱导抗性等多种机制产生的良好生防效应已经成为生物性抗真菌制剂和生物肥料重要开发对象。

大量研究表明，相比液体发酵，固体发酵由于更接近木霉菌种的生长习性能显著提高木霉菌种孢子数量。木霉菌种固体发酵涉及木霉菌种的液体培养、固体原料的选择与处理、培养环境的控制。目前，已经有部分学者对木霉菌种固体发酵做了一些研究，如中国专利cn105237146a公开了利用剑麻渣固体发酵木霉；cn103468629a公开了利用橘皮固体发酵木霉；cn104059860a公开了利用麦麸和锯木屑固体发酵木霉；cn1055862779a公开利用作物秸秆固体发酵木霉。上述报道的木霉菌种发酵技术主要涉及到原料及原料处理、培养温度、培养时间等，但是均没有考虑木霉菌种的发酵环境，如果发酵环境不是洁净的，很难保证每批次的木霉菌种都能达到合格的质量。

甜叶菊(steviarebaudiana)含有丰富的甜叶菊糖甙，是继蔗糖和甜菜糖后的第三种天然糖源。甜叶菊渣是甜叶菊糖甙被提取之后的产物，含有丰富的粗纤维和粗蛋白。目前以甜叶菊渣生产木霉菌种的方法还未见报道，本专利以甜叶菊渣为主要原料固体发酵木霉菌剂，不仅可以获得优质的木霉菌种，并且能有效的解决甜叶菊渣的资源化利用问题。另外，本专利对固体原料的灭菌方式、木霉液体菌种的无菌接种方法、木霉菌种浅盘发酵的环境洁净度等都做了详细的说明，对木霉菌种大规模工业生产具有重要的指导意义。

技术实现要素：

本研究主要目的是针对现有技术的不足，提出了利用甜叶菊渣固体发酵木霉菌种的方法；本研究另一目的是获得优质的木霉菌种，该菌种可以进一步应用于生物有机肥的配制。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种利用甜叶菊渣固体发酵制备木霉菌种的方法，将10-15％木霉液体菌种加入灭菌后的浅盘发酵物料，混合均匀，浅盘发酵温度26-28℃，湿度70-90％，万级洁净室培养4天；所述的浅盘发酵物料是以甜叶菊渣和米糠的混合物为原料，通过加入酸解氨基酸调节物料ph至2.5-3.0，自来水调节含水量至60-65％所得。

所述的浅盘发酵物料优选以50％甜叶菊渣+50％米糠为原料，通过酸解氨基酸调节物料ph至2.5-3.0，自来水调节含水量至60％所得。

所述的方法优选：浅盘发酵物料采用固体灭菌罐115℃灭菌40分钟，冷却后采用移种管道将10％木霉液体菌种从菌种液体发酵罐接种至灭菌罐物料中，利用灭菌罐搅拌系统将菌种与物料混匀。固体灭菌罐配置搅拌设备，一方面可以通过搅拌将物料进行充分的灭菌；另一方面待物料冷却至30℃将液体菌种通过移种管道接入后可以将菌种和物料充分搅拌均匀。

浅盘发酵物料厚度优选2-4cm，进一步优选2-3cm，更进一步优选3cm。

所述的甜叶菊渣是经过烘干处理后含水量小于10％，粒径小于5mm。

所述的酸解氨基酸中游离氨基酸含量为15％，游离氢离子浓度为3m。

所述酸解氨基酸的制备方法参见申请人之前已授权的发明专利：一种利用病死猪蛋白生产的液体氨基酸复合物及其应用(zl201410042218.3)。

按照本发明所述的方法制备的木霉固体菌种，其中，木霉孢子数量达到干重1.75×10¹⁰cfu/g。

有益效果本发明提供了一种利用甜叶菊渣固体发酵木霉菌种及其制备方法。该方法相比已报道的技术更全面，特别是在灭菌、接种和培养等方法上做了详细的说明，因此更适合木霉菌种的大规模工业化生产。

产品与目前市场上的产品相比具有如下优点：

1)利用甜叶菊固体发酵木霉菌种不仅仅局限与在物料表面产孢子(利用秸秆等原料通常只有表面产孢子，孢子数量在鲜重2×10⁹cfu/g左右)，故该方法生产的木霉菌种孢子密度高。

2)本发明生产的木霉菌种是在洁净室内进行的，因而可以有效地避免杂菌的污染，故该方法生产的木霉菌种孢子质量好。

3)试验结果表明，在玉米盆栽试验中，本产品配合有机肥的施用能显著地促进玉米植株的生长。

附图说明

图1利用甜叶菊发酵木霉菌种切面图。

图2不同固体原料载体对木霉菌种固体发酵的影响。

图3甜叶菊添加不同米糠比例对木霉菌种固体发酵的影响。

图4不同浅盘发酵厚度对木霉菌种固体发酵的影响。

图5不同浅盘发酵含水量对木霉菌种固体发酵的影响。

图6不同浅盘发酵接种量对木霉菌种固体发酵的影响。

图7不同浅盘发酵时间对木霉菌种固体发酵的影响。

图8木霉菌种对玉米作物的盆栽促生效果图。

具体实施方式

1、菌种和原料的获得

菌种：贵州木霉njau4742(trichodermaguizhounjau4742，保藏编号cgmccno.12166)由南京农业大学资源与环境科学学院植物营养课题组实验室保存。

发酵原料：酸解氨基酸、甜叶菊渣、米糠、麸皮、砻糠、水稻秸秆粉。酸解氨基酸由江阴联业生物科技有限公司友情提供，游离氨基酸含量为15％，游离氢离子浓度为3m，按照zl201410042218.3中记载的方法制备；甜叶菊渣购自东台纳盛特生物科技有限公司，经烘干粉碎过10目筛网处理；米糠、麸皮、砻糠、水稻秸秆粉由市场采购获得。甜叶菊渣、米糠、麸皮、砻糠和水稻秸秆粉的基本理化性质如表1所示：

表1不同物料理化性质测定

2、木霉菌种固体发酵

2.1木霉菌种液体培养

将贵州木霉njau4742经过pda固体培养基活化后接种至pda液体培养基，经过170r/min，28℃条件下液体发酵培养4d后移种至液体发酵罐在发酵4天获得贵州木霉njau4742液体菌液。

2.2固体培养基筛选

固体培养基设置5个处理，分别为100％甜叶菊渣、70％甜叶菊渣+30％米糠、70％甜叶菊渣+30％麸皮、70％甜叶菊渣+30％砻糠和70％甜叶菊渣+30％稻秆粉。贵州木霉njau4742最适固体发酵初始ph为2.5-3.0，利用酸解氨基酸液调节上述5个处理ph为2.5-3.0(加入酸解氨基酸的比例为6.6％)，调节含水量为60％。115℃灭菌40分钟冷却后接种10％上述获得的贵州木霉njau4742液体菌液，温度28℃，湿度90％环境下浅盘(物料厚度3cm)固体发酵4天。木霉孢子数量统计：取10g木霉固体培养菌种，在90ml无菌水中稀释，利用涡旋混合器充分混匀，采用血球计数板法测定孢子浓度。如图2所示，不同物料组合对木霉发酵的孢子数量具有显著的影响。甜叶菊渣添加30％的米糠发酵效果显著优于其他处理，孢子数量达到3.5×10⁹cfu/gfw。纯甜叶菊渣处理孢子数量达到1.5×10⁹cfu/gfw，表明纯甜叶菊渣也适用于木霉菌种固体发酵。相比纯甜叶菊渣处理，甜叶菊渣添加30％砻糠和30％稻秆粉对木霉菌种孢子数没有显著的影响，而甜叶菊渣添加30％麸皮显著降低了木霉菌种孢子数量。上述结果表明米糠、砻糠和稻秆粉可以作为甜叶菊渣固体发酵木霉菌种的载体，添加米糠效果最优。

2.3固体培养基添加比例

固体培养基添加比例设置5个处理，分别为90％甜叶菊渣+10％米糠、70％甜叶菊渣+30％米糠、50％甜叶菊渣+50％米糠、30％甜叶菊渣+70％米糠和10％甜叶菊渣+90％米糠。初始ph、含水量、灭菌方式、接种量以及培养条件同2.2。如图3所示，甜叶菊渣添加不同比例的米糠对木霉发酵的孢子数量具有显著的影响。甜叶菊渣添加50％的米糠发酵效果显著优于其他处理，孢子数量达到鲜重7×10⁹cfu/g。结果表明甜叶菊渣添加50％的米糠为最优比例。

2.4浅盘发酵厚度

浅盘发酵物料厚度设置5个处理，分别为1、2、3、4和5cm。物料为50％甜叶菊渣+50％米糠。初始ph、含水量、灭菌方式、接种量、温度、湿度以及培养时间同2.2。如图4所示，浅盘发酵物料厚度对木霉发酵孢子数量具有显著的影响。在1-3cm以内，木霉发酵孢子数量随着物料厚度的增加也呈上升趋势。然而当物料厚度大于3cm之后，木霉发酵孢子数量随着物料厚度的增加呈下降趋势，上述结果表明3cm物料厚度最优。

2.5浅盘发酵含水量

浅盘发酵含水量设置5个处理，分别为50％、55％、60％、65％和70％。物料为50％甜叶菊渣+50％米糠。初始ph、灭菌方式、接种量、温度、湿度、物料厚度以及培养时间同2.2。如图5所示，浅盘发酵物料含水量对木霉发酵孢子数量具有显著的影响。当含水量低于60％，木霉发酵孢子数量随着含水量的增加呈上升趋势；当物料含水量高于60％之后，木霉发酵孢子数量随着含水量增加呈下降趋势，上述结果表明60％含水量最优。

2.6浅盘发酵接种量

浅盘发酵接种量设置5个处理，分别为5％、7.5％、10％、12.5％和15％。物料为50％甜叶菊渣+50％米糠。初始ph、含水量、灭菌方式、温度、湿度、物料厚度以及培养时间同2.2。如图6所示，浅盘发酵物料接种比例对木霉发酵孢子数量具有显著的影响。当接种比例低于10％，木霉发酵孢子数量随着接种比例的增加呈上升趋势；当接种比例高于10％之后，木霉发酵孢子数量随着接种比例增加没有显著性的差异。为了节约工业生产成本，我们优选10％为接种比例。

2.7浅盘发酵培养时间

浅盘发酵接种量设置5个处理，分别为2、3、4、5和6天。物料为50％甜叶菊渣+50％米糠。初始ph、含水量、灭菌方式、接种量、温度、湿度以及物料厚度同2.2。如图7所示，浅盘发酵时间对木霉发酵孢子数量具有显著的影响。在4天以内，木霉发酵孢子数量随着接种时间的增加呈上升趋势；在4天之后，木霉发酵孢子数量随着时间增加没有显著性的差异。为了节约时间生产成本，我们优选4天为发酵时间。

2.8木霉菌种盆栽促生效应

盆栽试验设置1个对照和5个处理，分别是不施肥对照处理(ck)；木霉菌种处理(t1)；化肥处理(t2)；化肥+木霉处理(t3)；有机肥处理(t4)；有机肥+木霉处理(t5)，其中t1、t3和t5加入的木霉数量是一致的，t2、t3、t4和t5施入的氮磷钾养分是一致的。由图8和表2可知，相比对照处理，只施入木霉菌种对玉米各项生物量指标菌没有显著的差异；相比化肥，化肥+木霉菌种对玉米各项生物量指标菌也没有显著的差异；相比有机肥，有机肥+木霉菌种对玉米的茎粗、地上鲜重和地上干重具有显著的促进作用。上述结果表明木霉菌种配合有机肥对作物具有良好的促生效应，该结果对本发明木霉菌种产品的使用具有重要的指导意义。

表2不同处理对玉米作物生物量的影响

注：不施肥对照处理(ck)；木霉菌种处理(t1)；化肥处理(t2)；化肥+木霉处理(t3)；有机肥处理(t4)；有机肥+木霉菌种处理(t5)