一种基因重组发光菌冻干粉的制备方法与流程

本发明涉及水质监测领域，尤其涉及一种基因重组发光菌冻干粉的制备方法。

背景技术：

随着现阶段我国环境污染情况，水质问题得到广泛的关注。其中，现有采用发光菌毒性检测法对水质进行检测。发光菌毒性检测法具有检测操作简单、检测准确的特点。由于发光菌的相对发光度与水质综合的毒性相关，因此，通过检测敏感发光菌的变化即可实现对水质的监测。现有技术中一般采用发光菌的冻干粉用于水质监测。由于现有基因重组发光菌冻干粉工艺的限制，现有基因重组发光菌冻干粉稳定性较差，严重影响了发光菌水质监测检测的准确性及其推广应用。因此，亟待提供一种新的基因重组发光菌制备工艺。

技术实现要素：

为克服现有发光杆菌冻干粉稳定性较差的问题，本发明提供一种基因重组发光菌冻干粉的制备方法。

本发明为解决上述技术问题提供一种技术方案：一种基因重组发光菌冻干粉的制备方法，其包括以下步骤：

(1)西林瓶准备：先用2％盐酸将西林瓶浸泡过夜，洗净后，用蒸馏水浸泡至ph中性，干燥后、贴上标签，标注菌号及时间，121℃下高压灭菌20min，备用；

(2)冻干机预冷：使用前1小时，先打开冻干机进行预冷；

(3)冻干样品的准备：将活化好的基因重组发光菌菌种接种于lb培养液中，培养至菌体的对数生长期早期，将菌液离心弃上清，在菌体中加入冻干保护剂，所加入的冻干保护剂与菌液的体积比为1:5，并用振荡器充分混匀，得到菌体与保护剂的混合液；

(4)预冻：将步骤(3)的混合液分装与西林瓶中，放入冻干机冷阱进行预冻；

(5)冷冻干燥：预冻结束后，关闭放水进气阀；

(6)压盖保存：lgj-10e型冻干机带有压盖功能，将西林瓶的胶塞轻轻放置于瓶口，冻干结束后，转动手动把手进行压盖，压盖完毕后取出，迅速手动压上铝塑盖或铝盖。

优选地，所述步骤(3)中的保护剂选自：蔗糖、海藻糖、吐温、牛血清白蛋白的任意组合。

更优选地，所述步骤(3)中的保护剂包含以下重量份的组份：蔗糖6份、海藻糖6份、吐温800.2份、牛血清白蛋白1份。

更优选地，所述步骤(3)中的保护剂包含以下重量份的组份：蔗糖6份、海藻糖6份、吐温800.2份。

优选地，所述步骤(3)中的接种量为2％；lb液体培养基中含有30μg/l卡那霉素。

优选地，所述步骤(3)中菌体的对数生长期早期为od600为1.8，发光值>100000，细胞浓度为10⁷～10⁸cfu/ml。

优选地，所述步骤(4)中所述预冻时间为4-6h。

优选地，所述步骤(4)待冷阱温度下降到-50℃，再将预先准备的物料放入冷阱，开始预冻。

优选地，所述步骤(4)中西林瓶中的菌液体积为0.25-1ml。

优选地，所述步骤(5)中冷冻干燥的时间为10-12h。

优选地，所述步骤(5)的具体操作为将冻干架从冷阱腔中提出，置于备用的活动硬质塑料原盘上(放置在冷阱腔上方)，罩好有机玻璃罩，打开真空泵和真空计，待真空度达到50pa后，启动冻干程序，干燥开始按预先设定的工艺程序运行。

优选地，所述步骤(6)的西林瓶的胶塞为二叉丁基胶塞。

优选地，所述步骤(4)中预冻时间为6h；所述步骤(4)中西林瓶中的菌液体积为0.5ml；所述步骤(5)中冷冻干燥的时间为12h。

本发明的有益效果：本发明的基因重组发光菌冻干粉制备方法可进一步降低最终获得的冻干制品中水分含量，从而抑制微生物的生长繁殖和某些化学反应的发生，进一步改善所述基因重组发光菌冻干粉的储存稳定性，延长所述发光杆菌冻干粉的保存期。本发明所提供的基因重组发光菌冻干粉具有疏松多孔状，无明显塌陷、膨胀、离壁的问题。所述发光杆菌冻干粉相对于现有的发光杆菌冻干粉具有更优的稳定性，可保存时长更长。

附图说明

图1为本发明对不同预冻时间、冷冻干燥时间、分装菌液体积的冻干效果。

图2为本发明单一保护剂对重组发光菌冻干保护的影响结果。

图3为本发明复合保护剂对重组发光菌冻干保护的影响结果。

图4为本发明不同单一保护剂的基因重组发光菌冻干菌粉复苏后相对发光率的变化结果。

图5为本发明添加6种不同复合保护剂的基因重组发光菌冻干菌粉复苏后相对发光率的变化结果。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

本实施例重组发光菌冻干粉的制备方法，其包括以下步骤：

(1)西林瓶准备：先用2％盐酸将西林瓶浸泡过夜，洗净后，用蒸馏水浸泡至ph中性，干燥后、贴上标签，标注菌号及时间，121℃下高压灭菌20min，备用。

(2)冻干机预冷：使用前1小时，先打开冻干机进行预冷。

(3)冻干样品的准备：将活化好的纯菌种以2％接种量接种于lb培养液中(含30μg/l卡那霉素)，37℃，150r/min振荡器中扩大培养直到od600为1.8，发光值>100000，细胞浓度为10⁷～10⁸cfu/ml，待菌体处于对数生长期早期后，每离心管中分装20ml菌液，在4℃、8500r/min条件下离心20min，弃上清液，在菌体中加入冻干保护剂，所加入的冻干保护剂与菌液的体积比为1:5，并用振荡器充分混匀，得到菌体与保护剂的混合液。

(4)预冻：将步骤(3)的混合液分装与西林瓶中，放入冻干机冷阱进行预冻，所述预冻时间为4h，西林瓶中的菌液体积为0.25ml。

(5)冷冻干燥：将冻干架从冷阱腔中提出，置于备用的活动硬质塑料原盘上(放置在冷阱腔上方)，罩好有机玻璃罩，打开真空泵和真空计，待真空度达到50pa后，启动冻干程序，干燥开始按预先设定的工艺程序运行，冷冻干燥时间为10h。

(6)压盖保存：lgj-10e型冻干机带有压盖功能，将西林瓶的二叉丁基胶塞胶塞轻轻放置于瓶口，冻干结束后，转动手动把手进行压盖，压盖完毕后取出，迅速手动压上铝塑盖或铝盖。

本实施例的保护剂包含以下重量份的组份：蔗糖6份、海藻糖6份、吐温800.2份、牛血清白蛋白1份。

实施例2

本实施例与实施例1的唯一区别为保护剂包含以下重量份的组份：蔗糖6份、海藻糖6份、吐温800.2份。

实施例3

本实施例与实施例1的唯一区别为所述步骤(4)预冻时间为5h。

实施例4

本实施例与实施例1的唯一区别为所述步骤(4)预冻时间为6h。

实施例5

本实施例与实施例1的唯一区别为所述步骤(4)中西林瓶中的菌液体积为0.5ml。

实施例6

本实施例与实施例1的唯一区别为所述步骤(4)中西林瓶中的菌液体积为1ml。

实施例7

本实施例与实施例1的唯一区别为所述步骤(5)中冷冻干燥的时间为11h。

实施例8

本实施例与实施例1的唯一区别为所述步骤(5)中冷冻干燥的时间为12h。

效果评价：将实施例1-8所制得的冻干粉进行比较，结果见图1-3。

可见以预冷冻时间6h(实施例4，图1c)，冷冻干燥时间12h(实施例8，图2c)，菌液分装体积0.5ml的效果最佳(实施例5，图3b)，由上述条件下制备的冻干粉，无明显塌陷、膨胀、离壁的问题。

本发明研究了单一保护剂和复合保护剂对冻干菌体的保护。

1、单一冻干保护剂对菌体的板保护

分别以12％蔗糖溶液、6％蔗糖溶液、6％海藻糖溶液、12％聚蔗糖溶液、5％甘油溶液、1％牛血清白蛋白溶液、0.2％吐温80溶液，为冻干保护介质，将基因重组发光菌e.colihb101pucd607接种于液体培养基中，37℃培养12h(具体培养方式见2.2.2)，离心收获菌体，以菌液与保护剂体积比为5:1的比例加入保护剂，并用振荡器充分混匀。以0.5ml体积分装于西林瓶，以快速冷冻方式，深度冷冻(-60℃以下)6h，再进行真空干燥12h，真空度维持在50pa以下。

通过-80℃条件下保藏1个月，最终的出7种不同单一保护剂的基因重组发光菌e.colihb101pucd607冻干菌粉复苏后相对发光率的变化，如图4所示。

结果表明单一保护剂中，两种小分子糖类：蔗糖和海藻糖的对基因重组发光菌e.colihb101pucd607的保护效果较好，可以尝试组成基本配方。而甘油、聚蔗糖、牛血清白蛋白和吐温80对基因重组发光菌e.colihb101pucd607的保护效果较差，所以不适合单独使用，可以尝试作为辅料，提高复合冻干保护剂的保护效果。

2、复合冻干保护剂对菌体的板保护

根据单一冻干保护剂的实验结果，12％蔗糖溶液、6％蔗糖溶液、6％海藻糖溶液的保护效果良好；12％聚蔗糖溶液、5％甘油溶液、1％牛血清白蛋白溶液、0.2％吐温80溶液保护效果较差。故选择以小分子糖类：蔗糖和海藻糖组成不同的基本配方，见表1，加入不同辅料，对基因重组发光菌e.colihb101pucd607进行冷冻干燥实验，挑选出保护效果较好的保护剂配方，结果如图5所示。

表1：以蔗糖或海藻糖为保护介质的复合保护剂配方优化筛选

冻干后菌粉加入0.1mol/lkcl溶液恢复原体积，复苏30min，并采用fluostaromega酶标仪直接测定菌悬液的相对发光率。

-80℃条件下保藏1个月，添加6种不同复合保护剂的基因重组发光菌e.colihb101pucd607冻干菌粉复苏后相对发光率的变化如图5所示。由5可知，3号和5号冻干保护剂的保护效果较为理想，复苏时间20min就可以达到冻干前原菌液的60％以上。因此，本发明的实施例1采用了3号保护剂，实施例2采用的是5号保护剂，二者均具备较好的保护效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。