本发明属于发酵工程技术领域，尤其涉及一种快速培养高活力米根霉种子的方法。
背景技术：
乳酸(lacticacid)是一种天然存在的有机酸，存在于人体、动物和微生物中，广泛应用于食品、医药、化工等领域，是世界上公认的三大有机酸(乳酸、柠檬酸和醋酸)之一，是非常重要的平台化合物，有望成为一种替代石油化工大量生产的化学品。
发酵法生产乳酸是工业化生产的重要方式，主要微生物为乳杆菌属和根霉菌属，由于生产乳酸的细菌营养要求复杂，菌体小且不易过滤，给提取造成困难。米根霉自身能够分泌多种酶系，营养要求比较简单且生产的乳酸纯度高，已成为工业化生产的重要菌种。乳酸发酵生产普遍采用二级发酵方式，首先制备高活力的米根霉种子，然后转接发酵培养基培养。米根霉种子传统培养过程，采用孢子直接接种种子培养基，培养28～32h获得成熟种子，培养周期长。在种子培养的前期，孢子萌发延滞期较长，需经吸水、溶胀、萌发等系列过程，培养10～15h，孢子才开始萌发，如此长的萌发时间，种子染菌风险比较高。同时传统培养中高浓度种子培养基(总糖浓度8～10％)一定程度上会抑制孢子萌发，进一步延长了种子培养周期，导致制备的种子活力不高，易造成后续发酵稳定性较差。因此，如何改进米根霉种子培养方法，缩短种子培养周期，提高种子活力是实现乳酸高效发酵生产亟待解决的一个重要问题。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本研究提出了一种快速培养高活力米根霉种子的方法。
本发明的技术方案如下：
(1)制备成熟的米根霉孢子，无菌水清洗，三层纱布过滤，获得米根霉孢子悬液；
(2)淀粉质原料与水按照1∶3比例混合均匀，添加耐高温淀粉酶30u/g，经二次喷射液化(一喷温度95℃；二次喷射温度127℃)，获得液化混液，经过板框压滤获得液化清液，稀释液化清液制备孢子发芽培养基，调整总糖浓度为0.5～3％。
(3)将米根霉孢子悬液接种至孢子发芽培养基中培养，接种后米根霉孢子浓度为60～100万/ml。
(4)孢子发芽阶段采取两阶段超声处理培养方式，在第一阶段(0～4h)超声波频率40khz，每隔0.5h超声处理80～120s；第二阶段(4～8h)超声波频率25khz，每隔1h超声处理40～80s，获得发芽孢子。
(5)发芽孢子接种至种子培养基培养，控制总糖浓度为4～8％，总氮浓度为0.2～0.4％，培养10～14h，获得成熟的种子液。
(6)将成熟的种子液接种至发酵培养基培养，调整初始糖浓度为12～14％，当发酵液中还原糖浓度低于0.5％时，结束发酵。
与现有技术相比，本发明具有如下有益技术效果：
本发明采用低浓度发芽孢子培养基进行培养，基于孢子发芽过程中孢子渗透吸水溶胀与萌发对外加作用力的敏感性不同，孢子萌发阶段采用两段式超声处理策略，促进孢子快速萌发。采用发芽孢子方式接种，获得了高活力的米根霉种子。本发明提供的米根霉种子培养方法，缩短种子培养周期，降低种子培养过程染菌风险，减少能量消耗；同时培养获得了高活力的种子，其发酵性能显著提升(发酵周期缩短，发酵产酸量、发酵转化率及发酵指数提高)，降低了生产成本。本发明操作简单，具有重要的工业应用前景。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例及对比例中所涉及的实验方法，检测方法等，米根霉为常规的乳酸工业化生产菌种，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法。
实施例1
取成熟的米根霉孢子，经无菌水清洗，三层纱布过滤，获得米根霉孢子悬液；淀粉质原料与水按照1∶3比例混合均匀，添加耐高温淀粉酶30u/g，经二次喷射液化，获得液化混液，经过板框压滤获得液化清液，稀释液化清液制备孢子发芽培养基，调整总糖浓度为0.5％。米根霉孢子悬液接种至孢子发芽培养基中培养，接种后米根霉孢子浓度为65万/ml。孢子发芽阶段采取两阶段超声处理培养方式，在第一阶段0～4h控制超声波频率40khz，每隔0.5h超声处理100s；第二阶段4～8h控制超声波频率25khz，每隔1h超声处理40s，获得发芽孢子。发芽孢子接种至种子培养基培养，控制总糖浓度为5％，总氮浓度为0.3％，培养12h，获得成熟的种子液。将成熟的种子液接种至发酵培养基培养，调整初始糖浓度为12％，当发酵液中还原糖浓度低于0.5％时，结束发酵。测得发酵周期63h，乳酸含量9.8％。
实施例2
取成熟的米根霉孢子，经无菌水清洗，三层纱布过滤，获得米根霉孢子悬液；淀粉质原料与水按照1∶3比例混合均匀，添加耐高温淀粉酶30u/g，经二次喷射液化(一喷温度95℃；二次喷射温度127℃)，获得液化混液，经过板框压滤获得液化清液，稀释液化清液制备孢子发芽培养基，调整总糖浓度为2.5％。米根霉孢子悬液接种至孢子发芽培养基中培养，接种后米根霉孢子浓度为60万/ml。采取两阶段超声处理培养方式，在第一阶段(0～4h)超声波频率40khz，每隔0.5h超声处理80s；第二阶段(4～8h)超声波频率25khz，每隔1h超声处理60s，获得发芽孢子。发芽孢子接种至种子培养基培养，控制总糖浓度为6％，总氮浓度为0.3％，培养11h，获得成熟的种子液。将成熟的种子液接种至发酵培养基培养，调整初始糖浓度为13.4％，当发酵液中还原糖浓度低于0.5％时，结束发酵。测得发酵周期64h，乳酸含量10.3％。
实施例3
取成熟的米根霉孢子，经无菌水清洗，三层纱布过滤，获得米根霉孢子悬液；淀粉质原料与水按照1∶3比例混合均匀，添加耐高温淀粉酶30u/g，经二次喷射液化，获得液化混液，经过板框压滤获得液化清液，稀释液化清液制备孢子发芽培养基，调整总糖浓度为3％。米根霉孢子悬液接种至孢子发芽培养基中培养，接种后米根霉孢子浓度为100万/ml。采取两阶段超声处理培养方式，在第一阶段(0～4h)超声波频率40khz，每隔0.5h超声处理120s；第二阶段(4～8h)超声波频率25khz，每隔1h超声处理80s，获得发芽孢子。发芽孢子接种至种子培养基培养，控制总糖浓度为8％，总氮浓度为0.2％，培养14h，获得成熟的种子液。将成熟的种子液接种至发酵培养基培养，调整初始糖浓度为14％，当发酵液中还原糖浓度低于0.5％时，结束发酵。测得发酵周期68h，乳酸含量11.2％。
实施例4
取成熟的米根霉孢子，经无菌水清洗，三层纱布过滤，获得米根霉孢子悬液；淀粉质原料与水按照1∶3比例混合均匀，添加耐高温淀粉酶30u/g，经二次喷射液化，获得液化混液，经过板框压滤获得液化清液，稀释液化清液制备孢子发芽培养基，调整总糖浓度为1.5％。米根霉孢子悬液接种至孢子发芽培养基中培养，接种后米根霉孢子浓度为80万/ml。采取两阶段超声处理培养方式，在第一阶段(0～4h)超声波频率40khz，每隔0.5h超声处理90s；第二阶段(4～8h)超声波频率25khz，每隔1h超声处理60s，获得发芽孢子。发芽孢子接种至种子培养基培养，控制总糖浓度为4％，总氮浓度为0.3％，培养10h，获得成熟的种子液。将成熟的种子液接种至发酵培养基培养，调整初始糖浓度为12.8％，当发酵液中还原糖浓度低于0.5％时，结束发酵。测得发酵周期63h，乳酸含量10.1％。
实施例5
取成熟的米根霉孢子，经无菌水清洗，三层纱布过滤，获得米根霉孢子悬液；淀粉质原料与水按照1∶3比例混合均匀，添加耐高温淀粉酶30u/g，经二次喷射液化，获得液化混液，经过板框压滤获得液化清液，稀释液化清液制备孢子发芽培养基，调整总糖浓度为2.5％。米根霉孢子悬液接种至孢子发芽培养基中培养，接种后米根霉孢子浓度为90万/ml。采取两阶段超声处理培养方式，在第一阶段(0～4h)超声波频率40khz，每隔0.5h超声处理90s；第二阶段(4～8h)超声波频率25khz，每隔1h超声处理60s，获得发芽孢子。发芽孢子接种至种子培养基培养，控制总糖浓度为6％，总氮浓度为0.4％，培养13h，获得成熟的种子液。将成熟的种子液接种至发酵培养基培养，调整初始糖浓度为13.2％，当发酵液中还原糖浓度低于0.5％时，结束发酵。测得发酵周期61h，乳酸含量10.2％。
对比例(现有技术)
取成熟的米根霉孢子，经无菌水清洗，三层纱布过滤，获得米根霉孢子悬液；淀粉质原料与水按照1∶3比例混合均匀，添加耐高温淀粉酶30u/g，经二次喷射液化，获得液化混液。液化混液配置种子培养基，接种米根霉孢子悬液，接种后米根霉孢子浓度为80万/ml，控制总糖浓度为10％，总氮浓度为0.4％，培养28h，获得成熟的种子液。将成熟的种子液接种至发酵培养基培养，调整初始糖浓度为12.9％，当发酵液中还原糖浓度低于0.5％时，结束发酵。测得发酵周期70h，乳酸含量9.8％。
将实施例1～5各项测试指标与对比例进行比较，结果参见下表。
表1实施例1～5与对比实例各项测试指标对比结果
从表1可以看出，实施例1～5中采用快速培养高活力种子的方法，与对照相比，种子培养周期明显缩短，缩短8h，发酵总周期缩短14h，降低了培养过程中能量消耗；同时米根霉活力也明显提升，发酵转化率与发酵指数明显提升，其中发酵指数提高16％，降低了生产成本，显著提升了发酵效率，具有重要的工业应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。