一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子、应用、质粒和基因工程菌的制作方法

本发明属于微生物基因工程技术领域，尤其是一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子、应用、质粒和基因工程菌。

背景技术：

碱性蛋白酶(alkalineprotease)，是一类能够在碱性条件下水解蛋白质为氨基酸的蛋白酶，最早发现于猪的胰脏中。目前碱性蛋白酶的主要来源为微生物提取，研究和应用较多的主要是芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌为最。碱性蛋白酶的应用相当广泛，在洗涤剂工业、食品加工工业、医药行业、皮革制造工业、丝绸制造工业、环境保护工业中都有应用和研究。目前国外99％以上洗涤剂均添加了碱性蛋白酶，我国洗涤行业中加酶洗涤剂也占90％以上，而世界上约50％份额的酶制剂是利用芽孢杆菌自身或外源表达产生的。

芽孢杆菌表达系统具有很强的蛋白质分泌功能，分泌的外源蛋白不易形成包涵体，无显著的密码子偏爱性，外源蛋白可直接分泌，易于分离纯化等诸多优点。芽孢杆菌表达系统在分泌和表达活性蛋白上的优点逐渐引起人们的关注，有可能成为继大肠杆菌之后的重要的原核表达系统。

外源蛋白在芽孢杆菌中的高效表达是实现其在工业应用上的重要途径，而使用强并可控制的启动子是外源蛋白高效表达的关键因素之一，决定着工业生产酶的大规模生产。启动子是指可与rna聚合酶结合以起始转录的dna序列区域。它是与rna聚合酶结合的靶序列，对一个基因(或转录单元)的转录是否开始以及在什么条件下开始起到决定性的控制作用。使用强启动子介导碱性蛋白酶基因的表达是提高蛋白酶产量非常有效的方法。

双向启动子是指位于一对“头对头”的基因的两个tsss之间的启动子，gc含量丰富，可分别驱动正链与负链下游结构基因表达的基因组序列。双向启动子在真核生物基因组中广泛分布，而在原核生物中则鲜有报道。常用的原核生物双向启动子是didiermazel等在霍乱弧菌中发现的pc/pint。廖昱泓等发现真核生物酵母基因中的双向启动子即mal1基因启动子区在原核生物大肠杆菌中仍具有双向启动的功能。didiermazel等在霍乱弧菌中发现的pc/pint是较常用的来源于原核生物的双向启动子。

目前，国内外由基因组中筛选获取新型启动子的方法主要包括运用启动子探针载体筛选和基因组分析预测等。

碱性蛋白酶市场需求大而目前的工程菌株产酶效率不高，因此进一步发展和完善芽孢杆菌表达系统，不断完善和扩大芽孢杆菌载体系统和宿主系统，对碱性蛋白酶的工业化生产以及其他异源基因的表达都具有重要意义。

通过检索，尚未发现与本发明申请相关的发明公开文献。

技术实现要素：

本发明目的在于现有技术的不足之处，提供一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子、应用、质粒和基因工程菌，该启动子来源于一种地衣芽孢杆菌基因组，通过转录组分析预测方法获得；在新型启动子pla和其反向启动子plb调控转录下，克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性达到164u/ml和111u/ml，正义链启动子比已知强组成型启动子pshuttle-09的表达活性提高了44％；从而为枯草芽孢杆菌表达系统中异源基因的表达提供一个新的方向，并推动蛋白酶的高效表达及工业化。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子，所述双向启动子的核苷酸序列为seqidno：1。

而且，所述序列为用作表达克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因alk的启动子。

如上所述的能够表达碱性蛋白酶的双向启动子在作为启动子方面的应用。

一种含有如上所述的能够表达碱性蛋白酶的双向启动子的质粒。

而且，所述质粒的核苷酸序列为seqidno：4。

一种含有如上所述的质粒的基因工程菌。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明启动子为一种能够表达碱性蛋白酶基因的双向启动子，该启动子来源于一种地衣芽孢杆菌基因组，通过转录组分析预测方法获得；在新型启动子pla和其反向启动子plb调控转录下，克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性达到164u/ml和111u/ml，正义链启动子比已知强组成型启动子pshuttle-09的表达活性提高了44％；从而为枯草芽孢杆菌表达系统中异源基因的表达提供一个新的方向，并推动蛋白酶的高效表达及工业化。

2、本发明采用转录组测序结果分析鉴定的方法，由地衣芽孢杆菌基因组中筛选获得一种新型双向启动子。该双向启动子可以在枯草芽孢杆菌wb600中同时表达两段基因。双向启动子正义链的启动强度约为pshuttle-09的1.44倍。本发明启动子在用于提高外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达具有较好的效果。

3、本发明通过转录组测序数据分析鉴定的方法进行启动子筛选，获得的新型启动子pla对克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性达到164u/ml，比已知强组成型启动子pshuttle-09的表达活性提高了44％，反义链启动子plb表达活性为111u/ml。

4、本发明中的双向启动子即在地衣芽孢杆菌转录组测序结果的基础上，运用生物信息学等分析获得的lichenicidinprepeptidelana基因的启动子pla/plb。

附图说明

图1为本发明中重组表达载体的构建过程图；

图2为本发明中重组载体各片段回收验证图；其中，m：核酸分子量标准；1：pshuttle-09；2：pla；3：plb；4：alk；5：pla-alk；6：plb-alk；7：ps-alk；8：pwh1520；

图3为本发明中三种重组工程菌株对蛋白质的分解能力图(24h)；

图4为本发明中三种启动子对alk基因的表达活性图；

图5为本发明中启动子pla结构图；

图6为本发明中启动子plb结构图；

图7为本发明中启动子pshuttle-09结构图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

本发明所选用的宿主菌可以为胞外碱性蛋白酶无活性的枯草芽孢杆菌wb600。

本发明将地衣芽孢杆菌在三角瓶中发酵培养，每隔12h进行取样，对蛋白酶表达量较高的样品进行转录组测序分析；

对转录组测序结果进行分析，通过ncbi数据库比对获得该表达量最高的结构基因的上游500bp的基因序列，设计pcr引物；

提取地衣芽孢杆菌基因组，并以此为模板pcr扩增启动子；

使用大肠-枯草芽孢杆菌穿梭载体pwh1520，分别以三种启动子pshuttle-09和pla、plb为表达调控元件，克劳氏碱性蛋白酶基因为报告基因，构建蛋白酶基因表达载体；

将构建好的重组表达载体转化进入枯草芽孢杆菌wb600，获得重组基因工程菌，牛奶板筛选并发酵检测其酶活性；

通过在线软件bprom对该启动子进行结构分析，与启动子pshuttle-09进行结构对比，分析表达活性提高的原因。

相关过程可以如图1所示。

培养基和酶活测定方法：

种子培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l；

发酵培养基：玉米粉64g/l，豆饼粉40g/l，磷酸氢二钠4g/l，磷酸二氢钾0.3g/l，高温淀粉酶0.7g/l。

枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：

电转化感受态制备重悬液(溶液a)：d-山梨醇0.5mol/l，d-甘露醇0.5mol/l，甘油10％，加去离子水定容，121℃灭菌20min。

电转化复苏液(溶液b)：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，d-山梨醇0.5mol/l，d-甘露醇0.38mol/l，加去离子水定容，121℃灭菌20min。

本发明所用碱性蛋白酶酶活测定方法参照gb/t23527-2009附录b福林酚法进行，1个酶活力单位(u/ml)定义为1ml酶液在40℃、ph10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。

具体地，步骤如下：

地衣芽孢杆菌启动子筛选：

接种地衣芽孢杆菌(该地衣芽孢杆菌可以为地衣芽孢杆菌2709，其保藏于天津科技大学应用微生物与酶工程研究室菌种保藏库，或者，该地衣芽孢杆菌也可以为bacilluslicheniformisdsm13＝atcc14580)，于无抗lb平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落于种子培养基中，220rpm过夜培养，按2％接种量分别接种于100ml发酵培养基，37℃，220rpm振荡培养，每隔12h进行取样，离心收集上清液，进行酶活力测定，对蛋白酶表达量较高的样品进行转录组测序分析。发现其中有两段“头对头”的基因，且两段基因的表达强度较高，对两段基因中间的序列正义链与反义链分别设计pcr引物。

地衣芽孢杆菌基因组提取：

(1)收集过夜培养于lb培养基中的菌液，13000rpm离心3min，弃上清，重悬菌体于200μl无菌水中；

(2)加15μl(50mg/ml)溶菌酶，37℃水浴1h；

(3)加20μl蛋白酶k和60μl10％sds，65℃水浴2-3h至澄清；

(4)加等体积的酚仿，振荡混匀，12000rpm离心5min，取上清；

(5)加等体积的氯仿，振荡混匀，12000rpm离心5min，取上清；

(6)加体积浓度为60％-80％的异丙醇，上下颠倒混匀，-70℃放置5min，12000rpm离心5min，弃上清；

(7)加500μl体积浓度为70％的乙醇洗两次，12000rpm离心2min，弃上清，晾干5-10min；

(8)加50μl无菌水溶解，获得地衣芽孢杆菌的基因组。

启动子片段、蛋白酶基因的克隆：

由转录组分析结果可知，基因lana1和lana2之间有一段137bp的序列，能够分别驱动这两段基因的表达，并通过在线分析软件bprom预测这段启动子区域的-35区和-10区，发现正义链启动子pla与反义链启动子plb的-10区有重叠。分别通过引物pla-f/pla-alk-r和plb-f/plb-alk-r，以该地衣芽孢杆菌基因组为模板，pcr获得大小为137bp的pla和plb片段。pcr反应体系为：无菌双蒸水33.8μl，10×pyrobestbuffer5μl，dntpmixture(2.5mmol/l)5μl，上游引物和下游引物各2μl，基因组模板2μl，pyrobestdna聚合酶0.2μl。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸8s，共30个循环；72℃延伸10min。0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收pcr产物。

启动子pshuttle-09通过引物ps-f/ps-alk-r(表1)经pcr扩增获得，获得大小为215bp的pshuttle09。

报告基因为克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因alk(genbanksequenceid:fj940727.1)。根据编码基因序列，使用引物alk-pla-f、alk-plb-f、alk-ps-f和alk-r通过pcr扩增获得大小为1143bp的基因片段。重叠pcr获得大小为1280bp，1280bp和1358bp的三个片段pla-alk，plb-alk和ps-alk。结果如图2所示。

表1本发明中用到的引物

重组表达载体的构建：

pcr产物切胶回收后获得的启动子与报告基因片段使用spei和sphi酶切，与使用spei和sphi双酶切的pwh1520表达载体(如图2所示)连接后化转大肠杆菌ec135，提取验证成功的重组载体再通过如下方法转入枯草芽孢杆菌wb600细胞中：

(1)挑取新活化的枯草芽孢杆菌单克隆菌株于20mllb液体培养基中，37℃、220r/min摇床振荡培养12h；

(2)取600μl培养物分别接种至含有不同gly质量浓度(0、0.5％、0.75％、1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％)的30mllb液体培养基中，37℃、220r/min培养16h，测定od600，计算不同浓度gly对菌体生长的抑制率；

(3)取gly抑制率在60％-75％的菌悬液2.0ml转接至50ml含相同浓度gly的lb培养基，37℃、220r/min继续培养至od600＝0.5-0.6；

(4)将上述培养好的菌液冰浴10min，4℃、6000r/min离心10min，弃上清，倒置，使培养液流尽；

(5)用预冷的溶液a重悬菌体，轻轻混匀，4℃、6000r/min离心10min，重复3次；

(6)用预冷的溶液a重新悬浮细胞，无菌条件下分装于预冷的1.5mlep管中，每管80μl，-80℃保存备用；

(7)取制备好的感受态细胞，无菌条件下加入重组质粒，轻轻吹吸混匀；

(8)吸取感受态细胞与dna的混合物至2mm预冷的电转杯中，冰浴3min，电击(电压2500v)，迅速加入1ml溶液b，混匀，37℃、220r/min复苏3h；

(9)4000r/min离心5min，取适量涂布于20μg/mltet抗性筛选平板，37℃倒置培养，12h后挑取转化子单菌落于5mllb试管，培养后提取质粒dna并验证。

重组蛋白酶表达载体pshuttle09-alk-pwh1520，pla-alk-pwh1520，plb-alk-pwh1520，以及所对应的重组基因工程菌pshuttle09-alk-pwh1520-wb600，pla-alk-pwh1520-wb600，plb-alk-pwh1520-wb600构建成功。

重组蛋白酶基因工程菌的表达及分析：

将新鲜平板上的3株重组基因工程菌的单菌落点接牛奶板培养，选取透明圈较大的转化子点接牛奶板(结果如图3所示，pla-alk-pwh1520-wb600的透明圈大小明显大于另外两者)并分别接入50ml四环素抗性种子培养基中，37℃、220rpm震荡培养12h，以相同的接种量转接于含有四环素抗性的发酵培养基中，于37℃、220rpm发酵培养，每隔12h收集发酵液，4℃、12000rpm离心取上清。

测定不同时间发酵上清液中碱性蛋白酶的酶活，结果如图4所示，发酵培养60h后，蛋白酶产量趋于稳定，不再大幅增加。发酵培养84h，三种启动子pshuttle-09、pla、plb表达克劳氏碱性蛋白酶的活性分别达到114u/ml、164u/ml、111u/ml，说明pla的启动强度明显高于pshuttle-09和plb，pla启动子与plb启动子均可表达碱性蛋白酶。

三种启动子结果分析及对比：

通过在线分析软件bprom对启动子进行结构预测和分析。pla(图5)、plb(图6)、pshuttle-09(图7)三种启动子的保守序列均被σa因子识别，pla和pshuttle-09两保守区之间间隔为17bp和18bp，plb为14bp，这可能是造成plb的启动活性低于pla的主要原因。而pla、plb中sd与起始密码子均相距8bp，pshuttle-09中二者相距4bp，这可能是pla表达活性高于pshuttle-09的原因之一。

序列表

1、启动子pla核苷酸序列

2、启动子plb核苷酸序列

3、启动子pshuttle-09核苷酸序列

4、穿梭载体pwh1520核苷酸序列

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110>天津科技大学

<120>一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子、应用、质粒和基因工程菌

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>137

<212>dna/rna

<213>启动子pla核苷酸序列(unknown)

<400>1

atattccacctcctagaaaatttataattttttgtcgatttcttgatgtacttatagtat60

aatttgactggaacggcgagtcaattctaaattataggaaaatttcgatagtttgcccgt120

tctaggaggtgagaatc137

<210>2

<211>137

<212>dna/rna

<213>启动子plb核苷酸序列(unknown)

<400>2

gattctcacctcctagaacgggcaaactatcgaaattttcctataatttagaattgactc60

gccgttccagtcaaattatactataagtacatcaagaaatcgacaaaaaattataaattt120

tctaggaggtggaatat137

<210>3

<211>215

<212>dna/rna

<213>启动子pshuttle-09核苷酸序列(unknown)

<400>3

gtcacaatgcgccatcaaaccgttgacaagcgtccccgtcagatggccgggagccggatg60

aaccaccattccgcgcggcttgttgacgacaagaacgtcctgatcttattataatataag120

caaaaaactcataaaaaggaaaagcattgacctgaaaacttatcggtaaagtatgatata180

atacaaaaagaccgattagaggggagagaggaaac215

<210>4

<211>7929

<212>dna/rna

<213>穿梭载体pwh1520核苷酸序列(unknown)

<400>4

aatgacaaatggtccaaactagtactaataaaattaatcattttgaaagcgcaaacaaag60

ttttatacgaaggtaaagattctaaaaatcctttagcttttaaatactataaccctgaag120

aagtagtaggcggtaaaacgatgaaagatcagctgcgtttttctgttgcttactggcacc180

agtttacagcagatggtacggatcaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcg240

acctgcaggcatgcaagctttcgcgagctcgagatctagatatcgatgaattgatccgac300

gcgaggctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcc360

cgcgttgcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaagg420

atcgctcgcggctcttaccagcctaacttcgatcactggaccgctgatcgtcacggcgat480

ttatgccgcctcggcgagcacatggaacgggttggcatggattgtaggcgccgccctata540

ccttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaat600

ggaagccggcggcacctcgctaacggattcaccactccaagaattggagccaatcaattc660

ttgcggagaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatcgcgtccgcc720

atctccagcagccgcacgcggcgcatctcgggccgcgttgctggcgtttttccataggct780

ccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgac840

aggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttcc900

gaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttc960

tcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctg1020

tgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttga1080

gtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattag1140

cagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggcta1200

cactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaag1260

agttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttg1320

caagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctac1380

ggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatc1440

aaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaag1500

tatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctc1560

agcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac1620

gatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctc1680

accggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtgg1740

tcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaag1800

tagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtc1860

acgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttac1920

atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcag1980

aagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttac2040

tgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctg2100

agaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaacacgggataataccgc2160

gccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaact2220

ctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactg2280

atcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaa2340

tgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttt2400

tcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatg2460

tatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctga2520

cgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggcc2580

ctttcgtcttcaagaattcctgttataaaaaaaggatcaattttgaactctctcccaaag2640

ttgatcccttaacgatttagaaatccctttgagaatgtttatatacattcaaggtaacca2700

gccaactaatgacaatgattcctgaaaaaagtaataacaaattactatacagataagttg2760

actgatcaacttccataggtaacaacctttgatcaagtaagggtatggataataaaccac2820

ctacaattgcaatacctgttccctctgataaaaagctggtaaagttaagcaaactcattc2880

cagcaccagcttcctgctgtttcaagctacttgaaacaattgttgatataactgttttgg2940

tgaacgaaagcccacctaaaacaaatacgattataattgtcatgaaccatgatgttgttt3000

ctaaaagaaaggaagcagttaaaaagctaacagaaagaaatgtaactccgatgtttaaca3060

cgtataaaggacctcttctatcaacaagtatcccaccaatgtagccgaaaataatgacac3120

tcattgttccagggaaaataattacacttccgatttcggcagtacttagctggtgaacat3180

ctttcatcatataaggaaccatagagacaaaccctgctactgttccaaatataattcccc3240

cacaaagaactccaatcataaaaggtatatttttccctaatccgggatcaacaaaaggat3300

ctgttactttcctgatatgttttacaaatatcaggaatgacagcacgctaacgataagaa3360

aagaaatgctatatgatgttgtaaacaacataaaaaatacaatgcctacagacattagta3420

taattcctttgatatcaaaatgaccttttatccttacttctttctttaataatttcataa3480

gaaacggaacagtgataattgttatcataggaatgagtagaagataggaccaatgaatat3540

aatgggctatcattccaccaatcgctggaccgactccttctcccatggctactatcgatc3600

caataagaccaaatgctttacccctattttcctttggaatatagcgcgcaactacaacca3660

ttacgagtgctggaaatgcagctgcaccagccccttgaataaaacgagccataataagta3720

aggaaaagaaagaatggccaacaaacccaattaccgacccgaaacaatttattataattc3780

caaataggagtaaccttttgatgcctaattgatcagatagctttccatatacagctgttc3840

caatggaaaaggttaacataaaggctgtgttcacccagtttgtactcgcaggtggtttat3900

taaaatcatttgcaatatcaggtaatgagacgttcaaaaccatttcatttaatacgctaa3960

aaaaagataaaatgcaaagccaaattaaaatttggttgtgtcgtaaattcgattgtgaat4020

aggatgtattcacatttcaccctccaataatgagggcagacgtagtttatagggttaatg4080

atacgcttccctcttttaattgaaccctgttacattcattacacttcataattaattcct4140

cctaaacttgattaaaacattttaccacatataaactaagttttaaattcagtatttcat4200

cacttatacaacaatatggcccgtttgttgaactactctttaataaaataatttttccgt4260

tcccaattccacattgcaataatagaaaatccatcttcatcggctttttcgtcatcatct4320

gtatgaatcaaatcgccttcttctgtgtcatcaaggtttaattttttatgtatttctttt4380

aacaaaccaccataggagattaaccttttacggtgtaaaccttcctccaaatcagacaaa4440

cgtttcaaattcttttcttcatcatcggtcataaaatccgtatcctttacaggatatttt4500

gcagtttcgtcaattgccgattgtatatccgatttatatttatttttcggtcgaatcatt4560

tgaacttttacatttggatcatagtctaatttcattgcctttttccaaaattgaatccat4620

tgtttttgattcacgtagttttctgtattcttaaaataagttggttccacacataccaat4680

acatgcatgtgctgattataagaattatctttattatttattgtcacttccgttgcacgc4740

ataaaaccaacaagatttttattaatttttttatattgcatcattcggcgaaatccttga4800

gccatatctgacaaactcttatttaattcttcgccatcataaacatttttaactgttaat4860

gtgagaaacaaccaacgaactgttggcttttgtttaataacttcagcaacaaccttttgt4920

gactgaatgccatgtttcattgctctcctccagttgcacattggacaaagcctggattta4980

caaaaccacactcgatacaactttctttcgcctgtttcacgattttgtttatactctaat5040

atttcagcacaatcttttactctttcagcctttttaaattcaagaatatgcagaagttca5100

aagtaatcaacattagcgattttcttttctctccatggtctcacttttccactttttgtc5160

ttgtccactaaaacccttgatttttcatctgaataaatgctactattaggacacataata5220

ttaaaagaaacccccatctatttagttatttgtttggtcacttataactttaacagatgg5280

ggtttttctgtgcaaccaattttaagggttttcaatactttaaaacacatacataccaac5340

acttcaacgcacctttcagcaactaaaataaaaatgacgttatttctatatgtatcaaga5400

taagaaagaacaagttcaaaaccatcaaaaaaagacaccttttcaggtgctttttttatt5460

ttataaactcattccctgatctcgacttcgttctttttttacctctcggttatgagttag5520

ttcaaattcgttctttttaggttctaaatcgtgtttttcttggaattgtgctgttttatc5580

ctttaccttgtctacaaaccccttaaaaacgtttttaaaggcttttaagccgtctgtacg5640

ttccttaaggaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttaatgcggtagttt5700

atcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaacaatgcgctcat5760

cgtcatcctcggcaccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttggttatgccggtact5820

gccgggcctcttgcgggatatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgct5880

gctagcgctatatgcgttgatgcaatttctatgcgcacccgttctcggagcactgtccga5940

ccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgc6000

gatcatggcgaccacacccgtcctgtggatctgacgcgtgtaactgcgaaggtaaaacgg6060

gtgattgaaaataaactaacaaatgaagaggaacgaaagagaagtctagaatttgttacg6120

tttatatcggatgaattactgcaaaatgatacggagcctcgcacatttattattcagaac6180

tctcttttatcgctagagaaaatccatactctcgcacagaccaaagaggtagaggaatat6240

aaagaagtcataactactctgacaagacatgattcataatttgaaaagcaggtaaactaa6300

cccaaaaggcaagactctccgtagtttagaaaagagcaggttgctaataacatataaaca6360

gccagttgccgttatgataggtgactggctgcatgggatgaaaaggtgagggtggagaca6420

gacataacactcttaatagaagagggtaattctttctcttttatagaaaatcaattaatt6480

gaaagtagctccttcattcttaagatcaacgtgatataggtttgctaacctttgcgttca6540

cttaactaacttataggggtaacacttaaaaaagaatcaataacgatagaaaccgctcct6600

aaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaaatga6660

gaatggactctagaagaaacttcgtttttaatcgtatttaaaacaatgggatgagattca6720

attatatgatttctcaagataacagcttctatatcaaatgtattaaggatattggttaat6780

ccaattccgatataaaagccaaagttttgaagtgcatttaacatttctacatcattttta6840

tttgcgcgttccacaatctcttttcgagaaatattcttttcttctttagagagcgaagcc6900

agtaacgctttttcagaagcatataattcccaacagcctcgatttccacagctgcatttg6960

ggtccattaaaatctatcgtcatatgacccatttccccagaaaaaccctgaacaccttta7020

tacaattcgttgttaataacaagtccagttccaattccgatattaatactgatgtaaacg7080

atgttttcatagttttttgtcataccaaatactttttcaccgtatgctcctgcattagct7140

tcattttcaacaaaaaccggaacattaaactcactctcaattaaaaactgcaaatctttg7200

atattccaatttaagttaggcatgaaaataatttgctgatgacgatctacaaggcctgga7260

acacaaattcctattccgactagaccataaggggactcaggcatatgggttacaaaacca7320

tgaataagtgcaaataaaatctcttttacttcactagcggaagaactagacaagtcagaa7380

gtcttctcgagaataatatttccttctaagtcggttagaattccgttaagatagtcgact7440

cctatatcaataccaatcgagtagcctgcattcttattaaaaacaagcattacaggtctt7500

ctgccgcctctagattgccctgccccaatttcaaaaataaaatctttttcaagcagtgta7560

tttacttgagaggagacagtagacttgtttaatcctgtaatctcagagagagttgccctg7620

gagacaggggagttcttcaaaatttcatctaatattaatttttgattcattttttttact7680

aaagcttgatctgcaatttgaataataaccactcctttgtttatccaccgaactaagttg7740

gtgttttttgaagcttgaattagatatttaaaagtatcatatctaatattataactaaat7800

tttctaaaaaaaacattgaaataaacatttattttgtatatgatgagataaagttagttt7860

attggataaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatc7920

aaaggggga7929

<210>5

<211>26

<212>dna/rna

<213>引物pla-f(unknown)

<400>5

gactagtatattccacctcctcctag26

<210>6

<211>31

<212>dna/rna

<213>引物pla-alk-r(unknown)

<400>6

gtttcttcatgattctcacctcctagaacgg31

<210>7

<211>28

<212>dna/rna

<213>引物plb-f(unknown)

<400>7

gactagtgattctcacctcctagaacgg28

<210>8

<211>31

<212>dna/rna

<213>引物plb-alk-r(unknown)

<400>8

gagagaggaaaccatatattccacctcctag31

<210>9

<211>27

<212>dna/rna

<213>引物ps-f(unknown)

<400>9

gactagtgtcacaatgcgccatcaaac27

<210>10

<211>33

<212>dna/rna

<213>引物ps-alk-r(unknown)

<400>10

gtttcttcatgtttcctctctcccctctaatcg33

<210>11

<211>28

<212>dna/rna

<213>引物alk-pla-f(unknown)

<400>11

ggtgagaatcatgaagaaaccgttgggg28

<210>12

<211>28

<212>dna/rna

<213>引物alk-plb-f(unknown)

<400>12

ggtggaatatatgaagaaaccgttgggg28

<210>13

<211>30

<212>dna/rna

<213>引物alk-ps-f(unknown)

<400>13

gagagaggaaacatgaagaaaccgttgggg30

<210>14

<211>28

<212>dna/rna

<213>引物alk-r(unknown)

<400>14

acatgcatgcgattagcgtgttgccgct28