一步洗涤磁珠法唾液DNA提取试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体地，本申请提供了一种仅需要一步洗涤的磁珠法唾液dna提取试剂盒，其包括裂解液、结合液、蛋白酶k溶液、洗涤液以及洗脱缓冲液。

背景技术：

核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取dna是pcr扩增、文库构建、测序等工作的基础。除组织器官样本外，分子生物学检测中最常用的离体样本为血液样本，但采血一方面需要专业人员使用无菌采血设备，成本和复杂程度较高，另一方面采血会给患者带来直接的疼痛和恐惧，受到很多人的排斥；由于以上原因，以血液样本进行分子生物学检测在许多情形下，特别是大范围筛查或鉴定中有诸多不便。有必要开发使用容易获取的样本，如头发、唾液等提取dna用于分子生物学检测的方法。

唾液属于可以无损伤轻易提取的生物样品，其成分与血清、血浆中存在较大差异，难以使用相同或类似的试剂盒完成dna提取：唾液为无色、无味、无嗅的液体；ph约6~7；唾液中含有淀粉酶、溶菌酶、过氧化物酶、粘蛋白、粘多糖、磷脂等物质；其中的大量粘蛋白、粘多糖使得唾液粘稠度达到水的仅20倍，这些成分也是唾液dna提取中需要解决的主要问题/需要去除的主要物质。目前已知的酚氯仿法、盐析法、吸附柱法、免疫亲和法、磁珠法等现有dna提取方法中可用于唾液dna提取的主要有吸附柱法和磁珠法，其中吸附柱法提取效果和所提取dna浓度上都有明显不足，而磁珠法在操作简易性（如cn201611240409、cn201810169271、cn201610848178、cn201110105238等的磁珠法提取dna中均要经过2-4次不等的洗涤，不仅消耗时间，而且洗涤后吸取上清时需要较为精细的操作，容易产生污染/不适合实验室外现场操作）和提取效果上也有很多待改进之处，有必要开发一种操作更为简单的磁珠dna提取方法以提高提取效率/满足筛查、法医调查等用途中现场快速处理样本的需要。

技术实现要素：

在先前唾液dna提取试剂盒配方研究的基础上，申请人发现对洗涤次数难以减少的原因主要在于洗涤液较弱的碱性对粘蛋白的洗涤能力不足以及洗脱效率问题，本申请通过配制含较高浓度的碳酸氢钠（碱性略强于醋酸钠和氯化钠）的洗涤液同时兼顾离子平衡和提供碱性的作用，并配合使用两性离子型去垢剂十二烷基-n-甜菜碱，构建了仅需要一步洗涤的磁珠法唾液dna提取试剂盒。经过实际验证证明，效果不亚于进口或国产的类似的需多次洗涤的试剂盒。

一方面，本申请提供了一种唾液dna提取试剂盒，包括裂解液、结合液、蛋白酶k溶液、洗涤液以及洗脱缓冲液。

进一步地，其中裂解液包含tris、edta、nacl、nadc、十二烷基-n-甜菜碱、nls、guhcl、tritonx100、nh4cl、巯基乙醇；结合液包括异丙醇、peg8000、brij58；洗涤液包括guhcl、tris、乙醇、碳酸氢钠；洗脱缓冲液包括tris、edta。

进一步地，其中裂解液包含tris40-60mm、edta10-20mm、nacl0.1-0.9m、nadc0.25%-0.7%、十二烷基-n-甜菜碱0.1%-0.3%、nls0.6%-0.9%、guhcl60%-75%、tritonx1003%-5%、nh4cl0.15%-0.24%、巯基乙醇0.5%-2.5%，ph为7.0-8.5；结合液包括异丙醇65%-90%、peg80002%-10%、brij583%-5%，ph为7.0-8.5；蛋白酶k溶液包括蛋白酶k17-22mg/ml；洗涤液包括guhcl2-7m、tris10-17mm、乙醇40%-60%、碳酸氢钠20-50mm,ph为8.5-9.0；洗脱缓冲液包括tris10-20mm、dtpa0.1-0.2mm，ph为8.5-9.0。

进一步地，其中裂解液包含tris55mm、edta15mm、nacl0.3m、nadc0.5%、十二烷基-n-甜菜碱0.2%、nls0.5%、guhcl75%、tritonx1002%、nh4cl0.15%、巯基乙醇0.5%，ph为7.0；结合液包括异丙醇65%、peg800010%、brij583%，ph为7.0；蛋白酶k溶液包括蛋白酶k20mg/ml；洗涤液包括guhcl7m、tris10mm、乙醇40%、碳酸氢钠40mm，ph为9.0；洗脱缓冲液包括tris20mm、edta0.2mm，ph为8.5。

另一方面，本申请提供了使用上述唾液dna提取试剂盒提取唾液dna的方法。

进一步地，方法具体包括：

（1）取唾液于离心管中，加入裂解液与结合液的混合液,再加入蛋白酶k溶液，最后加入磁珠；

（2）将离心管加热震荡，置于磁力分离架上，移走全部上清液；

（3）将离心管从磁力分离架中取出，加入洗涤液，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，移走全部上清液；

（4）加入洗脱缓冲液，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，用将上清液移至另一离心管中；

（5）回收得到的dna。

进一步地，方法具体包括：

（1）取200ul的新鲜唾液于1.5ml离心管内，然后加入总计400ul的裂解液与结合液1:1的混合液,再加入20ul蛋白酶k溶液，最后加入10ul磁珠；

（2）将离心管在60℃条件下震荡10分钟，将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内的磁珠完全被吸附，用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部上清液；

（3）将离心管从磁力分离架中取出，加入1000ul洗涤液，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，使得管内磁珠完全被吸附，小心地使用移液枪在不触动沉淀的情况下移走全部上清液；

（4）加入100ul洗脱缓冲液，在60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；

（5）回收得到的dna，保存于-20℃。

另一方面，本申请提供了上述唾液dna提取试剂盒在制备pcr检测试剂盒中的用途。

进一步地，所述pcr检测试剂盒还包括pcr反应所用的试剂。

另一方面，本申请提供了上述唾液dna提取试剂盒在基因筛查和法医鉴定中的应用。

上述技术方案中所使用的试剂如tris、edta、nacl、nadc、nls、十二烷基-n-甜菜碱、guhcl、tritonx100、nh4cl、巯基乙醇、brij58、碳酸氢钠、edta、乙醇、异丙醇、peg8000，磁珠可以根据需要和产品性能选用进口或国产的各种型号。

本申请的试剂盒可以手动操作，也可以使用本领域公知的技术制备成多孔板自动操作的形式以进一步提高效率。

可以根据pcr检测对dna样本的要求，可以在本申请试剂盒基础上加入各种pcr反应试剂，包括但不限于引物、探针、聚合酶、mgcl2、dntps、pcr缓冲液等组成各种诊断或非诊断目的的pcr检测试剂盒，也可以将本申请的试剂盒可以与各种诊断或非诊断目的的pcr检测试剂盒配套使用。

附图说明

图1，本申请试剂盒与enriching唾液/拭子dna提取试剂盒提取效果比较（左条带为本申请试剂盒，右条带为enriching唾液/拭子dna提取试剂盒）。

具体实施方式

主要试剂和仪器

tris、edta、nacl、nadc、nls、guhcl、十二烷基-n-甜菜碱、tritonx100、nh4cl、巯基乙醇、brij58、碳酸氢钠、dpta由sigma生产；

乙醇、异丙醇、peg8000由国药集团生产；

本申请检测方法中所用磁珠由qiagen生产（取自magattractdnakit，enriching试剂盒中的磁珠为试剂盒自带）；

qubit®检测仪以及配套的试剂盒由thermofisher生产；

唾液/拭子dna提取试剂盒由enriching生产。

检测样本来源

由于需要样本量较少，为简便起见，验证本申请试剂盒dna提取效果时使用的唾液样本直接采集自申请人公司工作人员志愿者；

实际pcr检测时的样本来源来自合作医疗检测机构正常采集的样本。

实施例1试剂配制和基本提取过程

按照以下配方配制提取试剂1：

裂解液：tris55mm、edta15mm、nacl0.3m、nadc0.4%、十二烷基-n-甜菜碱0.2%、nls0.5%、guhcl75%、tritonx1002%、nh4cl0.15%、巯基乙醇0.5%，ph为7.0；

结合液：异丙醇65%、peg800010%、brij583%，ph为7.0；

蛋白酶k溶液：蛋白酶k20mg/ml；

洗涤液：guhcl7m、tris10mm、乙醇40%、碳酸氢钠40mm，ph为9.0；

洗脱缓冲液：tris20mm、edta0.2mm，ph为8.5。

对照试剂2按照试剂1的配方配制（以醋酸钠10mm替换碳酸氢钠）

对照试剂3按照试剂1的配方配制（不含十二烷基-n-甜菜碱，含nadc0.6%）

按照以下步骤进行dna提取：

（1）取200ul的新鲜唾液于1.5ml离心管内，然后加入总计400ul的裂解液与结合液1:1的混合液,再加入20ul蛋白酶k溶液，最后加入10ul磁珠；

（2）将离心管在60℃条件下震荡10分钟，将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内的磁珠完全被吸附，用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部上清液；

（3）将离心管从磁力分离架中取出，加入1000ul洗涤液，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，使得管内磁珠完全被吸附，小心地使用移液枪在不触动沉淀的情况下移走全部上清液；

（4）加入100ul洗脱缓冲液，在60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；

（5）回收得到的dna，保存于-20℃。

实施例2本申请试剂盒配方的效果验证

1碳酸氢钠和dpta的作用

使用实施例1中的试剂1-3和dna提取方法提取同一份唾液样本，使用qubit®（基于荧光染料法）检测仪以及配套的试剂盒检测所提取的dna浓度并检测oda260/280，结果如下：

多个样本中的重复结果类似。我们推测，洗涤液中的酸碱/带电情况对粘蛋白水解物的洗涤效果影响很大，实验的多种配方中只有碱性稍强的碳酸氢钠能达到有效去除蛋白而基本不影响dna稳定的效果；两性离子表面活性剂的加入的使用有利于充分裂解细胞溶解蛋白，并使得蛋白在洗涤时更容易去除。

本申请一步洗涤试剂盒与现有试剂盒的比较

以实施例1中的试剂1和提取方法以及enriching唾液/拭子dna提取试剂盒(磁珠法，3次洗涤，按照说明书在96孔板上自动操作)提取同一份唾液样本后电泳检测验证，结果如图1所示，可见两者效果基本相当。

为进一步验证，使用qubit®（基于荧光染料法）检测仪以及配套的试剂盒检测所提取的dna浓度并检测oda260/280，并在来自多人的多份唾液样本中验证。

可见本申请试剂盒和enriching试剂盒提取的dna质量均较为理想可以满足检测基本需要，本申请试剂盒所提取的dna浓度普遍略高于enriching试剂盒，结合操作简易程度（同为手动/自动操作时由于洗涤程序少，操作时间大约是enriching的一半稍多）本申请的试剂盒是替代现有市售唾液dna提取试剂盒的良好选择。

实施例3使用本申请试剂盒进行实际检测

使用本申请的试剂盒提取4对8位待测者唾液（与血液样本同步采集）dna用于亲子鉴定中的str基因座分型（promegapowerplex16，16个位点,abi9700pcr仪器），与血液中提取的dna所作的分型相比较，8位待测者全部128的位点的分型情况完全相同。初步证明了本申请的试剂盒提取的样本可用于后续的分子生物学检测。