一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物的制作方法

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物、试剂盒以及在单核苷酸多态性检测中的应用。

背景技术：

作为近年来最有发展潜力的第三代分子标记，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)在遗传分析中得到了广泛应用。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的80％以上。snp是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。snp既可能在基因序列内，也可能在基因以外的非编码序列上。

目前已经有多种技术检测单核苷酸的多态性，包括一代测序、二代测序、基因芯片技术、等位基因特异性pcr技术(as-pcr)、变性高效液相色谱(dhplc)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线等。其中等位基因特异性pcr技术(as-pcr)的优势在特异性上尤为突出，但在近几年的实验中发现根据as-pcr设计出来的引物特异性虽好，但仍有非特异性扩增，即使在引物中引入错配，仍然达不到理想效果。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物，以克服现有as-pcr技术末端碱基易错配分辨率不高、易产生非特异扩增的缺点。

本发明提供了一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物，包括成发夹序列、通用荧光引物结合序列和特异序列，所述成发夹序列与引物3’端部分碱基序列互补配对但突变碱基处裸露不互补配对，所述通用荧光引物结合序列与通用荧光引物的上游引物序列相同，所述特异序列用于与模板结合。

进一步的，所述成发夹序列位于发夹修饰引物5’端，长度为9～15个碱基，该引物在自然状态下自身形成发夹结构。所述成发夹序列3’端裸露的单个碱基只与特异的碱基互补配对，引物错配机率大大降低，进一步更准确的区分不同的突变位点。

进一步的，针对同一snp不同的基因型，一种基因型的通用荧光引物结合序列比另一种基因型的通用荧光引物结合序列长2～4个碱基，且在此区域的3’端一侧长出。通用荧光引物能够与通用荧光引物结合序列的产物互补结合，进行扩增，使产物带有荧光信号，能够进行毛细管电泳。

进一步的，所述特异序列位于发夹修饰引物3’端，长度为10～18个碱基。

进一步的，针对同一snp不同的基因型，一种基因型的特异序列与另一种基因型的特异序列最后一个碱基不同，引入的错配碱基不同。

进一步的，所述发夹修饰引物对应的下游引物由通用荧光引物下游序列结合区和下游引物依次拼接而成。在pcr时，每一个snp对应两种发夹引物和一种下游引物，此时，发夹引物形成竞争关系，有利于形成更高的特异性。

进一步的，通用荧光引物的上游引物5’端的碱基带有荧光基团标记。所述荧光基团包括fam、vic、hex、rox、taxasred或cy5，优选fam、hex。

本发明中，可针对所有基因型均使用一套通用荧光引物，利用巢式pcr的原理，在前几个循环中，运用发夹引物进行扩增，使产物带有能与通用荧光引物结合的序列，结合后，进行扩增，为目标区域pcr产物加上荧光信号，使其可以在毛细管电泳平台上通过检测荧光信号判断不同基因型。

本发明在进行多重pcr时，不同位点产物片段不同时，多位点仅需共用一套荧光引物便可实现多个位点的检测，大大降低了成本、简化了实验操作，更易推广和使用。

本发明还提供了一种包含发夹修饰引物的试剂盒。试剂盒还包括dntps、taqdna聚合酶，mg²⁺、pcr反应缓冲液中的至少一种。

本发明还提供了一种发夹修饰引物在单核苷酸多态性检测中的应用。

具体的，将本发明的发夹修饰引物、通用荧光引物在试剂盒中配成体系，pcr扩增后进行毛细管电泳，两种基因型是根据两种发夹引物的通用荧光引物结合区t引物比c引物长3个碱基完成的，在毛细管电泳中可根据不同位置的有无峰来判断基因型。

图1为同一snp的不同基因型对应的引物，两者不同之处在于：1)3-1与3-2区域除了最后一个碱基不同外，还人为的引入错配；2)1-1与1-2区域在人为引入突变处不同；3)2-1与2-2中2-2比2-1多2～4碱基。

图2为发夹引物与模板结合时的示意图。其中a是上游发夹引物伸展开的状态，当3’端与模板匹配时，则可以延伸；不匹配时，会从模板上脱落下来，再次形成发夹结构。在首轮循环中，以发夹特异引物为主导的不同基因型特异引物3’端裸露碱基特异识别模板dna，发夹结构打开，从而形成较长片段的产物，该片段产物一旦形成，高浓度的通用荧光引物进而识别长片段上的通用序列，扩增出较短片段的产物，同时使得不同的基因型产物标记相应的荧光，进而可以在abi3730等平台上收集不同位置的荧光信号，区分不同样本的基因型态。

有益效果

本发明提供的发夹修饰引物价格低廉且特异性高，运用通用的荧光引物大大降低成本，所需要的其他实验耗材也廉价易得；本发明一次pcr后进行毛细管电泳，可以直观的看到基因型结果，缩短检测周期，提高检测效率；本发明运用通用型荧光探针，针对不同位点只需要设计发夹引物即可，大大降低研发成本，简化了实验操作，更易推广和使用。

附图说明

图1为同一snp的不同基因型对应的引物；其中，1-1和1-2是成发夹序列，2-1和2-2是通用荧光引物结合序列，3-1和3-2是特异序列，x和y为此引物最后一个碱基，能够与互补配对的样本结合并扩增。

图2为本发明发夹修饰引物与模板结合时的示意图；其中，a是上游发夹引物伸展开的状态(当3’端与模板匹配时，则可以延伸；不匹配时，会从模板上脱落下来，再次形成发夹结构)，4是通用荧光上游引物，与发夹引物的通用荧光引物结合序列的序列相同，5和6是发夹引物所对应的下游引物，5的序列与通用荧光下游引物7的序列相同，6的序列与模板能够互补。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆操作手册,或按照试剂制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂有限公司，dntps购自大连宝生物公司，taqdna聚合酶购自菲鹏生物股份有限公司，引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成，人血dna抽提采用爱思进生物技术(杭州)有限公司(axygen公司)血基因组小量制备试剂盒。

实施例1

利用发夹引物进行as-pcr检测单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)。

序列查找和引物设计：根据ncbi的snp数据库，在人类基因组中查找出与人类叶酸代谢能力相关的3个位点的目标区段序列，使用oligo6.0按照一般规则进行引物设计，并人工在设计的引物上下游5’端分别添加上游通用序列和下游通用序列，然后用化学方法合成上下游特异引物(表1)。

表1snp检测特异引物

注：hp代表发夹引物，其中第一部分的大写字母为成发夹序列，第二部分的小写字母为通用荧光引物结合序列，第三部分为特异序列，倒数几位的小写字母为人为引入的突变。

dna抽提：人血细胞采用血基因组小量制备试剂盒，按照说明书进行抽提得到dna，以0.8％琼脂糖凝胶电泳确定dna质量和浓度。

1.单位点碱基检测as-pcr

pcr选取表1中选取4号引物(用于检测rs1801131位点a等位基因特异上游引物)、5号引物(用于检测rs1801131位点c等位基因特异上游引物，比1号引物在通用序列上多3个碱基，便于区分)、6号引物(用于检测rs1801131位点c和g等位基因的特异下游引物)混合特异扩增引物mix，选取10、11号引物混合为荧光通用引物，对单个样本进行pcr反应。pcr扩增体系具体为：每个样本的15ngdna分别加入到各自的15μltaq酶体系中，其中taq酶体系包含0.002～0.2um每个引物，1.5uldntps(2.5mm)，1.5ulsolution(10x)，3ulhshitaqbuffer(mg²⁺plus)，1utaq酶，并使用矿物油覆盖；同时设阴性对照，反应程序为：95℃变性10min；98℃变性10s，57℃复性2min，68℃延伸2min，4个循环；98℃变性10s，57℃复性45s，68℃延伸2min，10个循环；98℃变性10s，65℃复性45s，68℃延伸2min，35个循环；68℃，30min。

扩增结束后，将所得pcr产物于abi3730测序仪上进行分析，通过相应两种等位基因荧光的峰高比例，进行分型，分型公式为fa＝h1/(h1+h2),fc＝h2/(h1+h2),其中，h1表示一种基因型(实例中表示a型)，h2表示另一种基因型(实例中表示c型)。fa值为1时，表示aa纯合型；fc值为1时，表示cc纯合，fafc均有数值且接近时，表示ac杂合型。

实验证实，发夹结构引物as-pcr分型结果与实际情况一致(表2)。

表2rs1801131位点发夹结构引物as-pcr结果数据

2.多位点碱基检测as-pcr

pcr选取表1中选取表中1～9的引物混合为引物mix，选取10、11号引物混合为荧光通用引物，对单个样本进行多重pcr反应。pcr扩增体系具体为：每个样本的15ngdna分别加入到各自的15μltaq酶体系中，其中taq酶体系包含0.002～0.2um每个引物，1.5uldntps(2.5mm)，1.5ulsolution(10x)，3ulhshitaqbuffer(mg²⁺plus)，1utaq酶，并使用矿物油覆盖；同时设阴性对照，反应程序为：95℃变性10min；98℃变性10s，57℃复性2mins，68℃延伸2min，4个循环；98℃变性10s，57℃复性45s，68℃延伸2min，10个循环；98℃变性10s，65℃复性45s，68℃延伸2min，35个循环；68℃，30min。

扩增结束后，将所得pcr产物于abi3730测序仪上进行分析，针对每个位点通过相应两种等位基因荧光的峰高比例，判断基因型，结果见表3。

表3多位点发夹结构引物as-pcr结果数据

sequencelisting

<110>无锡翼和应用生物技术有限公司

东华大学

<120>一种结合通用荧光引物的发夹修饰引物

<130>1

<160>11

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

caatttcatcatcgagtgcactgctgtcgtgtggaggcgtgatgatgaaattgg54

<210>2

<211>58

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctatttcatcatcagagtgcactgctgtcgtgtggagtaggcgtgatgatgaaataga58

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gtgtcctgacgagtgctcaccagagctttgaggctgacc39

<210>4

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgtcactggtcacgagtgcactgctgtcgtgtggagggagctgaccagtgacga54

<210>5

<211>59

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctttactggtcagggagtgcactgctgtcgtgtggagtagcggagctgaccagtaaagc59

<210>6

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gtgtcctgacgagtgctcaccaggtgaccattccggtt38

<210>7

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

ggtgagcaagcgagtgcactgctgtcgtgtggagataccacagcttgctcacct54

<210>8

<211>56

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cgtgagcaagcgagtgcactgctgtcgtgtggagtagatccacagcttgctcacgc56

<210>9

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

gtgtcctgacgagtgctcaccagtgctacacagcaggg38

<210>10

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

gagtgcactgctgtcgtgtggag23

<210>11

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

gtgtcctgacgagtgctcaccag23