本发明涉及一种马蹄皮硫酸多糖的制备方法，属于天然药物的提取方法技术领域。
背景技术：
目前，天然多糖化学修饰以提升水溶性和生物学活性，为多糖生物学领域的重要研究方向，其中多糖硫酸化尤为引人重视。大量的研究证实，硫酸化的天然多糖，不仅大大增强了其水溶性，各项生物学活性，如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗凝血等，也均得到了显著性提升。然而，多糖的硫酸化修饰过程中所用化学试剂，无可避免会造成环境污染及对药物的不良影响。本发明所提取的是天然硫酸多糖，过程中极少量使用了有机试剂，不采用其他酸碱或硫酸化化学修饰剂，不仅避免了环境污染，也保护了天然硫酸多糖的高效生物学活性。
马蹄，也称荸荠，原产于中国南方，属莎草科多年生浅水草本植物，地下球茎为食，我国有2000多年悠久的种植史。我国是种植和出口马蹄大国，广泛栽种，覆盖广西、江苏、安徽、广东、湖南、湖北、江西、河北等省，种植面积超60万亩，年产量60-80万吨。马蹄及其深加工产品远销海外，国际上约99％的马蹄贸易来自中国。
马蹄不仅营养丰富，每100g新鲜马蹄中约含1.5g蛋白、0.1g脂类、22g糖类、74mg微量元素以及4mg维生素，并且具有很好的药理学作用。《伤寒杂病论》记载，马蹄具有清热解毒、消肿化瘀、生津止渴、润肺化痰等功效。现代医学证实马蹄具有抗肿瘤、抗菌、治疗呼吸道疾病、利尿通便、治疗糖尿病、治疗高血压等药效。研究发现，马蹄的活性物质主要富集于果皮和果肉之间。在马蹄加工过程中，占总质量25％的马蹄皮被废弃，因此，本发明所需原材料十分丰富。我们研究发现，马蹄皮含有丰富的硫酸多糖，但目前未见从马蹄皮中制备该硫酸多糖的文献报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种马蹄皮硫酸多糖的制备方法，以期以马蹄皮为原料制备马蹄皮硫酸多糖。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种马蹄皮硫酸多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)新鲜马蹄皮风干，粉碎备用；
(2)取马蹄皮粉末1份(以质量计)，悬于磷酸盐缓冲液pbs中，质量(g)体积(ml)比为1：(20-30)；
(3)超声波处理3-10分钟，在30-60℃条件下搅拌浸泡1-10小时；
(4)过滤后滤液用2-5‰木瓜蛋白酶于40-60℃条件处理80-100分钟；
(5)沸水浴处理5-10分钟，加入去蛋白溶液sevage溶液，搅拌8-15分钟后静置20-30分钟；
(6)离心取上清液，加入乙醇至乙醇体积浓度为70-80％，静置过夜；
(7)沉淀用70-80％乙醇洗涤后离心；
(8)沉淀用6-8倍量的水溶后，冷冻干燥，获得马蹄皮硫酸多糖；所述步骤(1)中，将马蹄风干粉碎后，过200目筛，制备粉末；所述步骤(2)中，pbs浓度为0.01-0.05mol/l，ph为5.5-6.5；所述步骤(3)中，超声波处理参数为：时间5s，间隔10s，20次；所述步骤(4)中，木瓜蛋白酶终浓度为质量(mg)体积比(ml)，静置环境温度为30-60℃；所述步骤(5)中，sevage溶液为：氯仿/正丁醇＝4:1(v/v)；所述步骤(6)中，离心速度为5000rpm，向上清液中加入3-5倍体积的无水乙醇，静置环境温度为30-60℃；所述步骤(7)中，离心速度为5000rpm，用70-80％乙醇洗涤三次。
本发明的马蹄皮硫酸多糖的制备方法能够有效提取马蹄皮中的硫酸多糖，具有安全、科学、简洁的优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，这些实施例只用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
一种马蹄皮硫酸多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)新鲜马蹄皮风干，粉碎过200目筛备用；
(2)取马蹄皮粉末1份(以质量计)，悬于0.01mol/l、ph为5.5的pbs中，质量(g)体积(ml)比为1：20；
(3)超声波处理3分钟，在30℃条件下搅拌浸泡1小时；
(4)过滤后滤液用质量提交比为2‰的木瓜蛋白酶于40℃条件处理80分钟；
(5)沸水浴处理5分钟，加入sevage溶液，搅拌8分钟后静置20分钟，sevage溶液为：氯仿/正丁醇＝4:1(v/v)；
(6)离心取上清液，加入乙醇至乙醇体积浓度为70％，静置过夜，离心速度为5000rpm；
(7)沉淀用70％乙醇洗涤三次后离心，离心速度为5000rpm；
(8)沉淀用6倍量的水溶后，冷冻干燥，获得马蹄皮硫酸多糖。
实施例2
一种马蹄皮硫酸多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)新鲜马蹄皮风干，粉碎过200目筛备用；
(2)取马蹄皮粉末1份(以质量计)，悬于0.05mol/l，ph为6.5的pbs中，质量(g)体积(ml)比为1：30；
(3)超声波处理10分钟，在60℃条件下搅拌浸泡10小时；
(4)过滤后滤液用质量提交比为5‰的木瓜蛋白酶于60℃条件处理100分钟；
(5)沸水浴处理10分钟，加入sevage溶液，搅拌15分钟后静置30分钟，sevage溶液为：氯仿/正丁醇＝4:1(v/v)；
(6)离心取上清液，加入乙醇至乙醇体积浓度为80％，静置过夜，离心速度为5000rpm；
(7)沉淀用80％乙醇洗涤三次后离心，离心速度为5000rpm；
(8)沉淀用8倍量的水溶后，冷冻干燥，获得马蹄皮硫酸多糖。
实施例3
一种马蹄皮硫酸多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)新鲜马蹄皮风干，粉碎过200目筛备用；
(2)取马蹄皮粉末1份(以质量计)，悬于0.03mol/l，ph为6.0的pbs中，质量(g)体积(ml)比为1：25；
(3)超声波处理8分钟，在45℃条件下搅拌浸泡5小时；
(4)过滤后滤液用质量提交比为3‰的木瓜蛋白酶于50℃条件处理90分钟；
(5)沸水浴处理8分钟，加入sevage溶液，搅拌12分钟后静置25分钟，sevage溶液为：氯仿/正丁醇＝4:1(v/v)；
(6)离心取上清液，加入乙醇至乙醇体积浓度为70％，静置过夜，离心速度为5000rpm；
(7)沉淀用70％乙醇洗涤三次后离心，离心速度为5000rpm；
(8)沉淀用7倍量的水溶后，冷冻干燥，获得马蹄皮硫酸多糖。
实施例4
一种马蹄皮硫酸多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)新鲜马蹄皮风干，粉碎过200目筛备用；
(2)取马蹄皮粉末1份(以质量计)，悬于0.02mol/l，ph为5.0的pbs中，质量(g)体积(ml)比为1：23；
(3)超声波处理4分钟，在40℃条件下搅拌浸泡3小时；
(4)过滤后滤液用质量提交比为4‰的木瓜蛋白酶于45℃条件处理85分钟；
(5)沸水浴处理6分钟，加入sevage溶液，搅拌10分钟后静置23分钟，sevage溶液为：氯仿/正丁醇＝4:1(v/v)；
(6)离心取上清液，加入乙醇至乙醇体积浓度为75％，静置过夜，离心速度为5000rpm；
(7)沉淀用75％乙醇洗涤三次后离心，离心速度为5000rpm；
(8)沉淀用7倍量的水溶后，冷冻干燥，获得马蹄皮硫酸多糖。
实施例5马蹄皮硫酸多糖生产工艺参数正交优化
1、新鲜马蹄皮风干，粉碎备用；
2、根据正交单因素结果进行正交实验设计(表1)
3、取马蹄皮粉末10g，悬于pbs中；
4、超声波处理，搅拌浸泡；
5、过滤后滤液用2-5‰木瓜蛋白酶于40-60℃条件处理80-100分钟；
6、沸水浴处理5-10分钟，加入sevage溶液，搅拌8-15分钟后静置20-30分钟；
7、离心取上清液，加入乙醇至乙醇体积浓度为70-80％，静置过夜；
8、沉淀用70-80％乙醇洗涤后离心；
9、沉淀用6-8倍量的水溶后，冷冻干燥，获得马蹄皮硫酸多糖；
10、计算得率，并确定参数(见表1)。
表1l9(34)正交实验设计及结果
实施例6马蹄皮硫酸多糖高效提取的技术步骤
1、新鲜马蹄皮风干，粉碎备用；
2、取马蹄皮粉末10g，悬于pbs中(0.01mol/l，ph6.3,250ml)；
3、超声波处理(时间5s，间隔10s，20次)，搅拌浸泡(60℃，3小时)；
4、过滤后滤液用2-5‰木瓜蛋白酶于40-60℃条件处理80-100分钟；
5、沸水浴处理5-10分钟，加入sevage溶液，搅拌8-15分钟后静置20-30分钟；
7、离心取上清液，加入乙醇至乙醇体积浓度为70-80％，静置过夜；
8、沉淀用70-80％乙醇洗涤后离心；
9、沉淀用6-8倍量的水溶后，冷冻干燥，获得马蹄皮硫酸多糖。
硫酸基含量测定
1、标准曲线制作：取108.75mg于105℃干燥至衡重的k2so4，用1mol/lhcl配置100ml溶液，即为硫酸基标准贮液(0.6mg/ml)。分别取0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2mlk2so4盐酸溶液，用1mol/l盐酸定容至0.2ml，0.2ml盐酸溶液为空白对照，加入三氯醋酸3.8ml及氯化钡溶液(0.5％明胶配制的1％bacl2)1.0ml，混匀，室温静置15min。于360nm波长测定吸光值a1，以1.0ml的明胶溶液(0.5％)代替bacl2溶液依上述步骤操作，测定a2。以硫酸基(mg)为横坐标，a1-a2差值为纵坐标，制作标准曲线。
2、换算因子(f)测定：取标准贮液0.15ml，按标准曲线的操作方法，测定并计算(a1-a2)值，按标准曲线计算供试液中硫酸基含量，根据f＝w/cd计算换算因子。其中，w为所取得硫酸基质量，c为硫酸基测定质量，d为稀释因子。
3、样品硫酸基含量测定：取0.2ml样品溶液，按标准曲线的制作方法，测定a1、a2，计算a1-a2值，按上述标准曲线和换算因子计算硫酸基含量。测定三次，取平均值。
硫酸基含量(％)＝(f×c×d/w)×100％
其中，f为换算因子，c为样品测定值，w为样品质量。