一种红松松针精油及其提取方法和在抑菌培养基中的应用与流程

本发明属于植物精油提取技术领域，具体涉及一种红松松针精油及其提取方法和在抑菌培养基中的应用。

背景技术：

植物的组织培养被应用在很多学科，如，植物学，细胞生物学，植物生理学，植物遗传育种等。植物组织培养以外植体诱导产生愈伤组织，通过悬浮培养愈伤组织细胞，使其大量增殖后，直接用于提取化合物。愈伤组织的诱导过程中，外植体的染菌率是实验中较难控制的问题。除能够熟练掌握无菌操作环节和器具器材与培养基充分灭菌外，在培养基中添加杀菌剂，会成为阻断外植体染菌率的一个重要手段。培养基本身要经过超高温灭菌，这本身会破坏大部分杀菌剂的功效，导致不断寻求新的能用在培养基中的杀菌剂。植物精油是萃取植物特有的芳香物质，取自于草本植物的花、叶、根、树皮、果实、种子、树脂等以蒸馏、压榨方式提炼出来的。植物精油是经高温蒸汽提取，因此高温不会破坏其原有性能。

红松(pinuskoraiensis)为松科(pinaceae)松属的常绿乔木，是国家ⅱ级重点保护野生植物，分布广，是东北地区主要的森林树种之一。红松松针中含有挥发油类、粗蛋白及氨基酸、色素及其维生素类、粗脂肪和微量元素、脂肪酸、色原酮、幽醇、普类、黄酮、菇类等化学成分。有很多不饱和脂肪酸可以降低胆固醇、软化血管、预防动脉硬化，调节内分泌。

植物挥发油(精油)是从植物的花、茎、叶等部位提取的，可随水蒸气蒸馏，且具有一定气味的挥发性油状液体物质的总称。实验表明松针精油具有镇痛抗炎、止咳、祛痰及平喘作用，并有抗氧化、杀虫作用，还具有抗癌、抑制血栓、治疗痛经等其他生物活性。松针提取的挥发油可以制作精油香皂、香水、美发香波、护肤品、糖果、糕点、饮品、松针牙膏、香薰等各种食品和家居用品中。国外学者对欧洲赤松、欧洲黑松、意大利五叶松、地中海白松等松针的挥发油化学成分及生物活性进行研究。国内研究比较多是马尾松、杜松、拉雅松、黑皮油松、雪松等松针挥发油的化学成分，而关于红松松针提取的挥发油进行氨基酸组分和化学成分的研究报道比较少。经过查阅文献，段辉等研究了甘肃油松针叶氨基酸成分含量因地区而不同，胡居吾等研究了雪松松针中游离氨基酸代谢对环境氮的响应。红松松针方面的研究主要有：樊梓鸾以红松松针精油为研究对象，研究了红松松针精油的抗氧化和抑菌活性；佟立君研究了红松松针挥发油的提取与组分，分析出21种成分；宗芳芳对红松壳挥发油成分进行研究，鉴定出17种成分。然而目前还有没有关于红松松针精油较为全面的提取分析方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种红松松针精油及其提取方法和在抑菌培养基中的应用，采用本发明提供的提取方法能够提取多种成分，并且提取得到的红松松针精油具有较高的抑菌性能。

本发明提供的一种红松松针精油的提取方法，包括以下步骤：

1)将红松松针粉用水浸泡，得到松针料液；

2)将步骤1)中所述松针料液在110～130℃条件下蒸馏3～5h，得到油水混合液；

3)将步骤2)中所述油水混合液和nacl溶液混合，将油水分离，收集油相得到红松松针精油。

优选的，步骤2)中蒸馏的速度为2～3滴/s。

优选的，步骤2)中蒸馏的时间为4h。

优选的，步骤3)中油水混合液和nacl溶液的体积比为4：0.8～1.2；所述nacl溶液的质量浓度为2％～3％。

优选的，步骤3)中油水分离依次包括用分液漏斗分液和无水硫酸钠除水；

所述无水硫酸钠除水的方法包括将经过分液漏斗分液后收集的油相和无水硫酸钠混合，结晶，离心，收集油相；

所述离心的转速为13000rpm，所述离心的时间为3min。

优选的，步骤1)中红松松针粉的质量和水的体积比为240～260g：1500ml。

本发明提供了所述的提取方法提取得到的红松松针精油，包括游离氨基酸和化合物；

所述游离氨基酸含量为244.44mg/kg；

以红松松针精油的质量为100％计，化合物占97.92％，其中烯烃类占87.97％，醇类占3.7％，酯类占5.77％，氧化物类占0.24％，酮类占0.14％和二萜类化合物占0.1％。

优选的，所述游离氨基酸包括以下浓度的氨基酸：6.89mg/kg天冬氨酸，1.76mg/kg谷氨酸，33.11mg/kg胱氨酸，5.05mg/kg丝氨酸，1.25mg/kg甘氨酸，34.28mg/kg组氨酸，16.99mg/kg精氨酸，8.44mg/kg苏氨酸，1.65mg/kg丙氨酸，1.4mg/kg脯氨酸，29.14mg/kg酪氨酸，1.23mg/kg缬氨酸，18.5mg/kg蛋氨酸，5.2mg/kg异亮氨酸，10.81mg/kg亮氨酸，4.71mg/kg苯丙氨酸和64.03mg/kg赖氨酸。

优选的，以红松松针精油的质量为100％计，所述烯烃类包括以下质量百分含量的组分：0.62％1,7,7-三甲基三环[2.2.1.02,6]庚烷，13.96％1,3,3-三甲基三环[2.2.1.02,6]庚烷，4.78％樟脑萜，0.31％桧烯，2.41％β-蒎烯，3.4％β-月桂烯，7.36％3-蒈烯，0.64％α-萜品烯，8.46％d-柠檬烯，1.05％3-亚甲基-6-(1-甲基乙基)环己烯，0.05％罗勒烯，0.27％γ-萜品烯，8.53％4-蒈烯，0.29％α-蒎烯，0.1％长叶烯，7.55％1-石竹烯，0.24％毕澄茄烯，0.12％香橙烯，0.11％α-荜澄茄油烯，0.11％反式-β-金合欢烯，1.39％α-石竹烯，0.17％毕澄茄烯，0.2％δ-杜松烯，14.38％大根香叶烯d，2.59％大根香叶烯b，0.28％α-蒎烯，4.15％δ-杜松烯，0.1％β--杜松烯，0.15％1,2,3,4,7-六氢化-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)萘，0.22％α-衣兰油烯，0.15％α-柏木烯和3.83％γ-杜松烯；

所述醇类包括以下质量百分含量的组分：0.07％(s)-芳樟醇，0.35％2-莰醇，0.19％4-萜烯醇，0.19％α-松油醇，0.45％1-羟基-1,7二甲基-4-异丙基-2,7-环癸二烯，0.07％(-)-蓝桉醇，0.07％库贝醇和2.31％α-毕橙茄醇；

所述酯类包括以下质量百分含量的含量组分：5.33％乙酸冰片酯和0.44％乙酸松油酯；

所述氧化物类包括以下质量百分含量的组分：0.11％石竹素和0.13％环氧化蛇麻烯ii；

所述酮类为0.14％2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯；

所述二萜类化合物为0.1％西柏烯。

本发明提供了所述的红松松针精油在抑菌培养基中的应用。

本发明提供了所述的提取方法提取得到的红松松针精油，包括游离氨基酸和化合物；所述游离氨基酸含量为244.44mg/kg；以红松松针精油的质量为100％计，化合物占97.92％，其中烯烃类占87.97％，醇类占3.7％，酯类占5.77％，氧化物类占0.24％，酮类占0.14％，酯类占5.77％和二萜类化合物占0.1％。本发明提供的红松松针精油，经检测得到游离氨基酸17种，其中包括8种人体必需的氨基酸中的7种；同时化合物占挥发油总量的97.92％，说明本发明提供的红松松针精油纯度较高，并且化合物种类包括46种，与以往研究报道相比，大大提高了红松松针精油中化合物的种类数量。同时本发明提供的红松松针精油作为杀菌剂添加到培养基中，大大降低培养基的染菌率。实验证明：加入红松精油的培养基，其染菌率仅为1％，而不加精油的培养基，其染菌率达到45％。

附图说明

图1为本发明中氨基酸分析的标准色谱图；

图2为本发明提取的红松松针挥发油总离子色谱图；

图3为本发明采用红松针叶精油作用的肺炎克雷伯氏菌菌体形态和结构扫描电镜照片。

具体实施方式

本发明提供的一种红松松针精油的提取方法，包括以下步骤：

1)将红松松针粉用水浸泡，得到松针料液；

2)将步骤1)中所述松针料液在110～130℃条件下蒸馏3～5h，得到油水混合液；

3)将步骤2)中所述油水混合液和nacl溶液混合，将油水分离，收集油相得到红松松针精油。

本发明将红松松针粉用水浸泡，得到松针料液。所述红松松针粉是将红松松针阴干后研磨得到。所述红松松针粉的粒径优选为100～150目，更优选为120目。所述红松松针粉的质量和水的体积比优选为240～260g：1500ml，更优选为250g：1500ml。所述浸泡的时间优选为3～5h，更优选为4h。

得到松针料液后，本发明将所述松针料液在110～130℃条件下蒸馏3～5h，得到油水混合液。

在本发明中，所述蒸馏的速度优选为2～3滴/s。蒸馏的时间优选为4h。所述蒸馏的温度优选为120℃。所述蒸馏优选包括以下步骤：采用电热套初始温度设定150℃，待松针料液沸腾后降到120℃，同时打开进水；当蒸馏至蒸馏液澄清透明时，即可停止蒸馏；先关闭电源，然后停止进水，最后拆卸蒸馏装置。蒸馏结束后，油水混合液经冷却流入烧瓶中。

得到油水混合物后，本发明将所述油水混合液和nacl溶液混合，将油水分离，收集油相得到红松松针精油。

在本发明中，所述油水混合液和nacl溶液的体积比优选为4：0.8～1.2，更优选为4:1。所述nacl溶液的质量浓度优选为2％～3％，更优选为2.5％。所述nacl溶液发挥盐析，使精油和水分开，利于精油的纯化和后续回收。

在本发明中，所述油水分离的方法依次优选包括用分液漏斗分液和无水硫酸钠除水。用分液漏斗分液的方法是将油水分层液倒入分液漏斗中静置，待分层后，油相位于上层，水相位于下层，打开分液漏斗开关排出水相，得到分液漏斗分液后收集的油相。所述无水硫酸钠除水的方法包括将上述经过分液漏斗分液后收集的油相和无水硫酸钠混合，结晶，离心，收集油相。所述分液漏斗分液后收集的油相的体积和无水硫酸钠的质量优选为2～5ml：2～5g，更优选为3ml：3g。所述离心的转速为13000rpm，所述离心的时间为3min。所述结晶的时间优选为30min。所述无水硫酸钠除水的次数优选为3～4次。

得到红松松针精油后，本发明为了进一步分析红松松针精油中的具体成分和含量，采用高效液相色谱仪分析游离氨基酸组分，采用气相色谱—质谱分析挥发油成分。分析游离氨基酸组分的色谱条件如下：色谱条件：流动相a：以乙腈和0.1mol/l乙酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解)按3:97的体积比混合得到的混合液，用乙酸调节ph值至6.5。流动相b：乙腈和水按体积比为4:1的比例混合得到的混合液。色谱柱：aglientc18(4.6×250mm×5μm)，流速为1.0ml/min，柱温为40℃，检测波长为254nm，进样量为10μl。分析挥发油成分时的色谱条件如下：石英毛细管色谱柱，长度30.0cm，直径250.00μm，厚度0.25μm。线速度43.4cm/sec，流速1.44ml/min，升温程序：初始温度为40℃，保持5min，然后以5℃/min升至260℃。最后280℃后运行7min，载气为he，进样口温度为280℃，分流比为20:1，进样量为1.0μl。分析挥发油成分时的质谱条件如下：标准电子ei源(70ev)，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，溶剂延迟3min，检测电压0.1kv，开始时间3.00min，结束时间60.00min，全扫描方式，扫描间隔0.30s，扫描速度为1428，扫描范围:m/z50.00-450.00。

本发明提供了所述的提取方法提取得到的红松松针精油，包括游离氨基酸和化合物；所述游离氨基酸含量为244.44mg/kg；以红松松针精油的质量为100％计，化合物占97.92％，其中烯烃类占87.97％，醇类占3.7％，酯类占5.77％，氧化物类占0.24％，酮类占0.14％和二萜类化合物占0.1％。

在本发明中，所述游离氨基酸优选包括以下浓度的氨基酸：6.89mg/kg天冬氨酸，1.76mg/kg谷氨酸，33.11mg/kg胱氨酸，5.05mg/kg丝氨酸，1.25mg/kg甘氨酸，34.28mg/kg组氨酸，16.99mg/kg精氨酸，8.44mg/kg苏氨酸，1.65mg/kg丙氨酸，1.4mg/kg脯氨酸，29.14mg/kg酪氨酸，1.23mg/kg缬氨酸，18.5mg/kg蛋氨酸，5.2mg/kg异亮氨酸，10.81mg/kg亮氨酸，4.71mg/kg苯丙氨酸和64.03mg/kg赖氨酸。

在本发明中，以红松松针精油的质量为100％计，所述烯烃类包括以下质量百分含量的组分：0.62％1,7,7-三甲基三环[2.2.1.02,6]庚烷，13.96％1,3,3-三甲基三环[2.2.1.02,6]庚烷，4.78％樟脑萜，0.31％桧烯，2.41％β-蒎烯，3.4％β-月桂烯，7.36％3-蒈烯，0.64％α-萜品烯，8.46％d-柠檬烯，1.05％3-亚甲基-6-(1-甲基乙基)环己烯，0.05％罗勒烯，0.27％γ-萜品烯，8.53％4-蒈烯，0.29％α-蒎烯，0.1％长叶烯，7.55％1-石竹烯，0.24％毕澄茄烯，0.12％香橙烯，0.11％α-荜澄茄油烯，0.11％反式-β-金合欢烯，1.39％α-石竹烯，0.17％毕澄茄烯，0.2％δ-杜松烯，14.38％大根香叶烯d，2.59％大根香叶烯b，0.28％α-蒎烯，4.15％δ-杜松烯，0.1％β--杜松烯，0.15％1,2,3,4,7-六氢化-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)萘，0.22％α-衣兰油烯，0.15％α-柏木烯和3.83％γ-杜松烯；

以红松松针精油的质量为100％计，所述醇类优选包括以下质量百分含量的组分：0.07％(s)-芳樟醇，0.35％2-莰醇，0.19％4-萜烯醇，0.19％α-松油醇，0.45％1-羟基-1,7二甲基-4-异丙基-2,7-环癸二烯，0.07％(-)-蓝桉醇，0.07％库贝醇和2.31％α-毕橙茄醇；

以红松松针精油的质量为100％计，所述酯类优选包括以下质量百分含量的含量组分：5.33％乙酸冰片酯和0.44％乙酸松油酯；

以红松松针精油的质量为100％计，所述氧化物类优选包括以下质量百分含量的组分：0.11％石竹素和0.13％环氧化蛇麻烯ii；

以红松松针精油的质量为100％计，所述酮类优选为0.14％2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯；

以红松松针精油的质量为100％计，所述二萜类化合物优选为0.1％西柏烯。

在本发明中，所述红松松针精油的抑菌机理如下：通过扫描电镜观察发现，随着时间延长菌体形态和结构不断发生变化，菌体出现皱缩、破裂、部分缺失等现象。

鉴于上述红松松针精油的抑菌机理，本发明提供了所述的红松松针精油在抑菌培养基中的应用。

在本发明中，所述的红松松针精油作为杀菌剂或抑菌剂添加到培养基中。所述培养基包括动物细胞培养用培养基或植物组织培养基用培养基。本发明对所述培养基的种类，也没有特殊限制，采用本领域所熟知的培养基的种类即可。在本发明实施例中，为了具体说明抑菌性能，所述培养基是以ms培养基为例实施。

在本发明中，所述红松松针精油的抑菌的种类包括青霉、黄曲霉、变形杆菌、酵母菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌或大肠杆菌。

在本发明中，所述金黄色葡萄球菌(staphylococcusaurousrosenbach)菌株包括保藏编号为atcc6538的菌株。粪肠球菌(enterococcusfacials)菌株包括保藏编号为atcc29212的菌株。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)菌株包括保藏编号为atcc6633的菌株。单核细胞增多性李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)菌株包括保藏编号为atcc19115的菌株。绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)菌株包括保藏编号为atcc27853的菌株。肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)菌株包括保藏编号为atcc46117菌株。肠炎沙门氏菌(salmonellaenteritidis)菌株包括保藏编号为atcc14028菌株。鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)菌株包括保藏编号为cmcc50115的菌株。副伤寒沙门氏菌(almonellaparatyphi)菌株包括保藏编号为cmcc50093的菌株。大肠杆菌(escherichiacoli)菌株包括保藏编号为atcc25922的菌株。

下面结合实施例对本发明提供的一种红松松针精油及其提取方法和在抑菌培养基中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

红松松针精油的制作

(1)将阴干好的松叶粉碎，称取250g，置于2000ml的蒸馏瓶中，加入1500ml的蒸馏水，浸泡4小时。

(2)安装容器

安装顺序从下到上，从左到右。固定蒸馏瓶在电热套中，装好蒸馏头，连接冷凝，调好接收瓶，检查各接口。

(3)加热蒸馏

电热套初始温度设定150℃，待液体沸腾后降到120℃，同时打开进水。蒸馏速度控制在2～3滴/秒为宜，当蒸馏时间4小时，蒸馏液澄清透明时，即可停止蒸馏。先关闭电源，然后停止进水，最后拆卸蒸馏装置，拆卸的顺序与安装时相反。

(4)油水分离

锥形瓶中收集到油水混合液400ml，加入浓度3％的nacl溶液100ml，就会出现明显的分层。用分液漏斗放掉下层水分，油水混合液粗略分离。粗略分离的油层，加入无水硫酸钠，吸水后的无水硫酸钠结晶，静置30min后用移液枪抽取上层澄清透明液体1ml到离心管中，用离心机13000转/min，离心3min，含水硫酸钠结晶析出，分离出油层。再次抽取油层，加入无水硫酸钠，每次加入2g左右，震荡并观察吸水状况，静置后再次离心，重复两次。最后淡黄色的油层即为挥发油，收集挥发油置梨形离心管中，得到红松松针精油。

实施例2

高效液相色谱仪分析游离氨基酸组分

分析仪器：日本岛津lc-20a型高效液相色谱仪。色谱条件：流动相a：以乙腈和0.1mol/l乙酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解)按3:97的体积比混合得到的混合液，用乙酸调节ph值至6.5。流动相b：乙腈和水按体积比为4:1的比例混合得到的混合液。色谱柱：aglientc18(4.6×250mm×5μm)，流速为1.0ml/min，柱温为40℃，检测波长为254nm，进样量为10μl，洗脱梯度如表1。

表1流动相的淋洗梯度表

高效液相检测游离氨基酸的17种氨基酸的标准色谱图见图1，具体数据详见表2。

表217种氨基酸数据表

通过表2可知，红松松针游离氨基酸总量可达到244.44mg/kg,已测出的氨基酸中，以赖氨酸的含量最高64.03mg/kg，组氨酸次之，为34.28mg/kg，缬氨酸含量最低，为1.23mg/kg。检测出8种人体必需氨基酸中的7种，赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸，占总氨基酸含量的46％。

实施例3

气相色谱—质谱分析挥发油成分

分析仪器：岛津公司气-质联用仪，gcms-qp2010，自动进样器：aoc-20i。

色谱条件：石英毛细管色谱柱，长度30.0cm，直径250.00μm，厚度0.25μm。线速度为43.4cm/s，流速为1.44ml/min，升温程序：初始温度为40℃，保持5min，然后以5℃/min升至260℃。最后280℃后运行7min，载气为he，进样口温度为280℃，分流比为20:1，进样量为1.0μl。

质谱条件：标准电子ei源(70ev)，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，溶剂延迟3min，检测电压0.1kv，开始时间3.00min，结束时间60.00min，全扫描方式，扫描间隔0.30s，扫描速度为1428，扫描范围:m/z50.00-450.00。

按上述操作条件对红松松针精油进行分析，得到样品的总离子流色谱图，采用计算机对各峰质谱结果在gcms-qp2010质谱数据库nist107中检索，利用峰面积归一化法计算各组分的相对含量。

红松松针挥发油化学成分gc-ms分析的总离子流图见图2，分离出现55个峰，通过计算机检索数据库中的标准谱图进行对比核对，得出化合物的分子结构，鉴定出含量较高的49种化合物，序号32、34、37、47是同一种化合物γ-杜松烯，所以挥发油的最后鉴定结果是46种化合物，占总离子流的97.92％。

红松松针挥发油gc-ms分析，通过gc-ms得到的分子结构，根据和标准谱库的匹配度，并结合已经公布的有关松针挥发油化学成分的相关文献，采用色谱峰面积归一法进行相对定量，分析出红松松针挥发油的化学成分见表3。

表3红松松针挥发油的化学成分一览表

通过表3可以看出，通过水蒸气蒸馏法提取红松松针挥发油gc-ms分析出的46种化合物,占挥发油总量的97.92％。它们是1,7,7-三甲基三环[2.2.1.02,6]庚烷(0.62％)、1,3,3-三甲基三环[2.2.1.02,6]庚烷(13.96％)、樟脑萜；莰烯(4.78％)、桧烯(0.31％)、β-蒎烯(2.41％)、β-月桂烯(3.4％)、3-蒈烯(7.36％)、α-萜品烯；松油烯(0.64％)、d-柠檬烯(8.46％)、3-亚甲基-6-(1-甲基乙基)环己烯(1.05％)、罗勒烯(0.05％)、γ-萜品烯,松油烯(0.27％)、4-蒈烯(8.53％)、α-蒎烯(0.29％)、长叶烯(0.1％)、1-石竹烯(7.55％)、毕澄茄烯(0.24％)、香橙烯(0.12％)、α-荜澄茄油烯(0.11％)、反式-β-金合欢烯(0.11％)、α-石竹烯(1.39％)、毕澄茄烯(0.17％)、δ-杜松烯(0.2％)、γ-杜松烯(1.4％)、大根香叶烯d(14.38％)、γ-杜松烯(0.65％)、大根香叶烯b(2.59％)、α-蒎烯(0.28％)、γ-杜松烯(1.59％)、δ-杜松烯(4.15％)、β-杜松烯(0.1％)、1,2,3,4,7-六氢化-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)萘(0.15％)、α-衣兰油烯(0.22％)、α-柏木烯(0.15％)、γ-杜松烯,(0.19％)、(s)-芳樟醇(0.07％)、合成右旋龙脑；2-莰醇(0.35％)、4-萜烯醇(0.19％)、α-松油醇(0.19％)、1-羟基-1,7二甲基-4-异丙基-2,7-环癸二烯(0.45％)、(-)-蓝桉醇(0.07％)、库贝醇(0.07％)、α-毕橙茄醇(2.31％)、氧化石竹烯；石竹素(0.11％)、环氧化蛇麻烯ii(0.13％)、2-异丙基-5-甲基茴香醚；2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯(0.14％)、乙酸冰片酯(5.33％)、乙酸松油酯(0.44％)、西松烯；西柏烯(0.1％)。匹配度都在88％以上，其中β-蒎烯、1-石竹烯等五种成分匹配度达到97％。

化合物中烯烃类32种占挥发油总量的87.97％，醇类8种占挥发油总量的3.7％，酯类2种占挥发油总量的5.77％，氧化物类有2种氧化石竹烯；石竹素和环氧化蛇麻烯ii，相对百分含量共占0.24％。占挥发油含量最高的是大根香叶烯d(14,38％)。含量高于10％的只有2种1,3,3-三甲基三环[2.2.1.02,6]庚烷(13.96％)和大根香叶烯d(14,38％)，其次是4-蒈烯(8.53％)、d-柠檬烯(8.46％)、毕澄茄烯(7.55％)、3-蒈烯(7.36％)、乙酸冰片酯(5.33％)、樟脑萜；莰烯(4.78％)。

实施例4

扫描电镜观察红松针叶精油处理对菌体结构的影响

1.材料仪器

1.1材料

样品：超临界co2萃取得到的红松针叶精油，棕色瓶子密封遮光，冰箱冷藏，备用。

测试细菌：肺炎克雷伯氏菌klebsiellapneumoniaatcc46117，菌种来自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心，采用液体石蜡保藏法，存于4℃冰箱。

试剂：培养基、氯化钠、牛血清蛋白储备液、tris-hcl缓冲液、冰醋酸、无水乙醇、甲醇、盐酸、正己烷、戊二醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、溴酚蓝。

1.2仪器

无菌操作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡培养箱、扫描电镜、紫外可见吸收光谱仪、恒温摇床、高速离心机、恒温水浴锅、电泳仪、真空干燥箱、培养箱、烘箱、分析天平、培养皿、ph计、试管、接种工具、移液枪、酒精灯。

2实验方法

2.1培养基的配制

mh琼脂培养基：称取21.0gmh培养基,去离子水500ml，加热溶解。营养肉汤(nb)培养基：称取18.0，加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装三角瓶或试管，121℃高压灭菌15min备用。

2.2菌悬液的配制

采用斜面低温保藏法保藏菌种。挑取适量菌种，涂布于培养基上，37℃培养24h，从经过活化的菌体平板上挑取一环菌体接种于相应的液体培养基中，放入恒温振荡培养箱培养至对数生长期(对数生长期的细胞代谢最旺盛，对外界环境因素十分敏感，故用作抑菌实验)。然后分别吸取供试菌液0.5ml，加入无菌水倍比稀释到105-106cfu/ml，备用。

2.6扫描电镜

(1)收集菌体：将培养至对数生长期的供试细菌加入到含红松松针叶精油的培养基20中，使菌种浓度为10⁷cfu/ml，摇床培养(37℃，150rpm)，分别于4h、8h、12h、24h分别取样5ml，对照菌体不加精油培养24h取样5ml。各样品离心10min(10000rpm)，收集菌体沉淀。用pbs(磷酸缓冲液，ph＝7.0)洗涤3次，每次10min。

(2)供试菌体中加入2.5％戊二醛固定2小时。

(3)用乙醇进行梯度脱水：采用50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、100％乙醇(3次，每次10min)。

(4)冷冻干燥。

(5)喷金、观察。

(6)扫描电镜下观察菌体形态和结构变化，以正常培养的肺炎克雷伯氏菌作为对照。

结果见图3，其中a，对照；a4、a8和a24是分别以红松松针叶精油(1×mic)处理4h、8h和24h后的菌体扫描电镜图。

通过扫描电镜观察发现，随着时间延长红松松针叶精油作用的肺炎克雷伯氏菌菌体形态和结构不断发生变化，菌体出现皱缩、破裂、部分缺失等现象。

实施例5

抑菌培养基的制作

1.母液配制及保存

选用化学纯或分析纯的化学药品，根据ms培养基配方，分别配制大量元素(50倍)、微量元素(200倍)、铁盐(200倍)、有机物(200倍)、植物生长调节物质(0.1～0.5mg/ml)，其中大量元素中的氯化钙(cacl2·2h2o)中的ca²⁺易沉淀，故单独配置。几种化合物的母液，将母液保存在4℃的冰箱里。

2.培养基配制

根据培养基配方需求，每升培养基中分别加入琼脂粉(7.0g)、蔗糖(30g)和各类母液，依次溶解于蒸馏水，每1000ml培养基加入7～10ml红松松针精油，定容后用0.1mol/lhcl或0.1mol/lnaoh溶液调节ph＝5.8，定量。

3.分装至培养瓶中并封口，制备成培养基，备用。

4.培养基灭菌

瓶装培养基需在10h内完成灭菌，采用高压蒸汽灭菌锅灭菌，在压力0.105mpa、温度121℃条件下灭菌25min。锅内的灭菌物以不超过锅的容量3/4为宜，高压灭菌时锅内使用蒸馏水。

以花楸为植物材料外植体接种

实施例6

1.外植体的选择

早春季节在晴天或露水干后，选择生长健康、强壮的植株作为采样母株，剪取母树下部较幼嫩的茎段及茎尖作为外植体，外植体大小在1cm～2cm之间。

2.外植体灭菌

先将外植体用洗涤剂作表面清洗，清除表面的尘土，再将外植体用流水冲洗30min后，放入消毒瓶中。把装有外植体的消毒瓶用75％的酒精棉擦拭后放入超净工作台，在超净工作台上打开装有外植体的消毒瓶，倒入75％酒精并摇晃消毒瓶，浸泡消毒10s，倒去酒精，用无菌水冲洗外植体3次～5次；然后用0.1％hgcl2溶液浸泡8min，无菌水冲洗3次～5次，并浸泡30min，再用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。

3.外植体切割

将表面消毒后的外植体切割，接入培养基中。叶片切割成边长1.0cm的正方形；茎在接种前用手术剪刀剪去两端，长1.0cm～2.0cm。

4.外植体接种

操作时，先将培养瓶的封口膜轻轻取下，放在一边，将培养瓶口倾斜在酒精灯外焰上旋转灼烧消毒，杀死瓶口的微生物。将枪式镊子在酒精灯上灼烧消毒并冷却后，将切割好的外植体放入培养瓶中，每个培养瓶放3个外植体，接种后盖上封口膜，并标注日期。

5.加入红松松叶精油的培养基100瓶；不加红松松叶精油的培养基100瓶

实验结果：加入红松精油的培养基染菌率1％；

不加精油的培养基染菌率45％。

实施例7

红松针叶精油抑菌活性研究

1材料仪器

1.1材料

样品：超临界co2萃取得到的红松针叶精油，棕色瓶子密封遮光，冰箱冷藏，备用。

测试细菌：包括4种革兰氏阳性菌，金黄色葡萄球菌staphylococcusaurousrosenbachatcc6538，粪肠球菌enterococcusfacialsatcc29212，枯草芽孢杆菌bacillussubtilisatcc6633，单核细胞增多性李斯特氏菌listeriamonocytogenesatcc19115。六种革兰氏阴性菌，绿脓杆菌pseudomonasaeruginosaatcc27853，肺炎克雷伯氏菌klebsiellapneumoniaeatcc46117，肠炎沙门氏菌salmonellaenteritidisatcc14028，鼠伤寒沙门氏菌salmonellatyphimuriumcmcc50115，副伤寒沙门氏菌salmonellaparatyphicmcc50093，大肠杆菌escherichiacoliatcc25922。以上菌种来自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心，菌种采用液体石蜡保藏法，存于4℃冰箱。

阳性对照：链霉素、氯霉素、四环素、青霉素。

1.2仪器

超净工作台、恒温振荡培养箱、高压灭菌锅、培养箱、烘箱、分析天平、培养皿、试管、接种工具、移液枪、酒精灯、滤纸、打孔器。

2实验方法

2.1培养基的配

mh琼脂培养基：称取21.0gmh培养基，去离子水500ml，加热溶解。

2.2菌悬液的配制

采用斜面低温保藏法保藏菌种。挑取适量菌种，涂布于培养基上，37℃培养24h，从经过活化的菌体平板上挑取一环菌体接种于相应的液体培养基中，放入恒温振荡培养箱，培养至对数生长期(对数生长期的细胞代谢最旺盛，对外界环境因素十分敏感，故用作抑菌实验)。然后分别吸取供试菌液0.5ml，加入无菌水，倍比稀释到10⁵～10⁶cfu/ml备用。

2.3滤纸片法测量抑菌圈

煮适量mh培养基，121℃高压灭菌15min后备用。称取0.1g红松针叶精油，加入2mldmso(1％)溶液，配成50mg/ml浓度的溶液备用。用打孔器将定性滤纸制成小圆纸片，直径6mm，放入平皿中干热灭菌120min备用。在超净工作台上，将培养基倒入平板，约1.5cm厚，静止30min。用移液枪吸取制备好的菌悬液10μl，均匀涂布在琼脂平板上，静置5min，将直径为6mm的滤纸片平铺在琼脂板上，每个培养皿贴3片，贴时注意滤纸片之间要保持一定的距离。用移液枪吸取5μl受试物滴在滤纸片上。以抗生素作为阳性对照，浓度选择为5μg/ml，用移液枪吸取5μl滴在滤纸片上。另外一个滤纸片滴不加样品的dmso(1％)作为阴性对照。于37℃培养箱中倒置培养24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，结果取重复试验的平均值。

3抑菌结果

3.1红松针叶精油的抑菌活性

本实验选择了10种细菌作为红松针叶精油抑菌活性实验的研究对象，精油对各菌种抑制作用如表1所示，每一个培养皿测试一种细菌，实验用到的抗生素有链霉素、氯霉素、四环素和青霉素，dmso(1％)溶液的阴性对照。

实验结果表明红松针叶精油对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有效果。实验以两种窄谱抗生素(链霉素、青霉素)和两种广谱抗生素(四环素、氯霉素)为阳性对照来鉴定精油的抗菌谱，结果表明精油具有广谱抗菌效果，显示红松针叶精油有开发为广谱抗菌剂的潜力。细菌的抑菌圈直径可分为以下几个等级：不敏感(-)直径小于等于8mm；敏感(+)直径在8～14mm之间；特别敏感(++)直径在14～20mm之间。

肺炎克雷伯氏的抑菌圈直径最大(15.08mm)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(13.61mm)、绿脓杆菌(11.29mm)、副伤寒沙门氏菌(14.23mm)、大肠杆菌(11.89mm)、金黄色葡萄球菌(12.07mm)、肠炎沙门氏菌(12.81mm)、枯草芽孢杆菌(8.74mm)，粪肠球菌的抑菌圈直径最小(8.74mm)，单核细胞增多性李斯特氏菌的抑菌圈直径没有检测到，可能是由于菌种保藏出现问题导致菌种生长活性较差。由抑菌圈直径的数据可以看出，红松针叶精油抑菌圈直径的值都在敏感和特别敏感的范围中，其抑菌圈直径与阴性对照(6mm)相比差异显著，说明精油对供试的大部分菌种都有很好的抑菌效果。红松针叶精油对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌圈直径数据差异小，因此说明红松针叶精油具有广谱抗菌效果。

表1精油对供试菌种的抑菌作用

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。