本发明属于生物工程领域，涉及磁性氧化铁纳米颗粒在分离枸杞发酵物中抗肿瘤活性成分枸杞多糖中的用途，具体涉及一种从枸杞发酵物中分离抗肿瘤活性成分的方法。
背景技术：
研究发现，枸杞多糖能抑制多种肿瘤的生长，枸杞多糖可以通过激活机体的免疫系统来达到抗肿瘤目的。枸杞多糖3p通过增加免疫和降低脂质过氧化显著抑制s180肉瘤的生长，有资料表明枸杞多糖的抗肿瘤作用与调节钙离子浓度有关，如对人类肝癌qgy7703细胞株的研究表明，枸杞多糖能在分裂循环的s期抑制qgy7703细胞的增殖并能诱导其凋亡，细胞内rna的量和钙离子浓度上升，还能使细胞内钙离子的分布改变。枸杞多糖可以抑制前列腺癌pc3和du145细胞系的生长，并存在剂量和时间反应关系，引起癌细胞dna断裂，通过bcl2和bax蛋白表达诱导凋亡，体内实验表明枸杞多糖可以抑制裸鼠pc3肿瘤的生长。也有研究发现枸杞水提物可促进肝癌细胞的凋亡。
在食品工业领域中，生物活性物质的分离纯化通常会使用溶剂萃取法，沉淀法，超滤法和制备型液相色谱法。然而，这些分离方法均有一定缺陷，如耗时较长，设备昂贵，溶剂浪费等。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种磁性氧化铁纳米颗粒于在离抗肿瘤因子枸杞多糖中的用途，以克服现有技术的不足。
本发明提供了一种从枸杞发酵物中分离抗肿瘤活性成分的方法，包括：将粒径为9.1～128.6nm的磁性氧化铁纳米颗粒直接加入枸杞发酵液中，并控制摇床转速为80～250rpm，吸附时间为2～12h，使磁性氧化铁纳米颗粒充分吸附抗肿瘤因子枸杞多糖；在完成吸附后，以电磁铁将磁性氧化铁纳米颗粒从枸杞发酵液中分离出，并分散于水-乙醇混合溶剂中，超声10～30min，之后将磁性氧化铁纳米颗粒分离回收，所得清液包含富集的抗肿瘤因子枸杞多糖。
优选地，所述磁性氧化铁纳米颗粒于枸杞发酵液中的添加量为4～9g/l。
优选地，将回收的磁性氧化铁纳米颗粒以去离子水和浓度为0.05～0.1mol/l的乙酸缓冲液交替清洗，实现对所述磁性氧化铁纳米颗粒的再生处理。
优选地，将三价铁盐溶液与碱溶液于35～70℃搅拌0.2～1小时，之后转移至高压釜内反应，反应温度为120～200℃，时间为2～4h，制得磁性氧化铁纳米颗粒；其中，三价铁盐溶液的浓度为0.1～1m，碱溶液浓度为0.2～1.5m，三价铁盐溶液和碱溶液的体积比为1:1～1:5。
优选地，所述三价铁盐包括氯化铁、硫酸铁和硝酸铁中的任意一种或两种以上的组合。
优选地，所述碱溶液包括氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液和硼氢化钠溶液中的任意一种或两种以上的组合。
优选地，所述枸杞发酵液的制备方法包括：
1)将枸杞粉碎后加入8～15倍量水，浸泡2～4小时后煎煮1～3小时，药液滤过，滤液备用，在相同条件下将药渣重复提取1～3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.06～1.55，得到浓缩滤液；
2)将上述浓缩滤液与药渣混合，搅拌均匀后按照0.5％～5％质量比接入甜酒曲或黄酒曲，调节ph至7～9，温度为16～35℃，厌氧发酵处理7～14天，得到混合发酵物；
3)将上述混合发酵物在100℃条件下灭菌1～3小时，冷却至室温后过滤，滤液经纯化后对其进行低温减压浓缩，直至相对密度为1.15～1.55，得到浓缩发酵液。
本发明有益效果：
(1)直接合成出具有吸附对枸杞多糖的磁性氧化铁纳米颗粒，无需在颗粒表面负载亲和物质，无需对发酵液进行预处理，且分离纯化工艺简单易操作。
(2)磁性氧化铁纳米颗粒的制备原料简单、合成条件温和、耗时短，且所获磁性氧化铁纳米颗粒可重复使用。
(3)合成的磁性氧化铁纳米颗粒纯度高、无毒无害、具有良好的磁性。
(4)提供的磁性氧化铁纳米颗粒可彻底吸附两种对苯醌，吸附容量为40mg/g-60mg/g。
(5)在外加磁场的作用下通过磁性分离可实现纳米颗粒分离，剥离靶物质后，纳米颗粒经超声清洗后可重复使用。
(6)枸杞多糖除了具有抗肿瘤作用，还有提升免疫力、抗衰老、清除自由基、抗疲劳、保肝、生殖功能保护和改善等作用。利用本发明分离方法，从枸杞发酵物中分离抗肿瘤活性成分枸杞多糖的提取率与抗肿瘤功效大幅提高。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1
本实施例提供了一种从枸杞发酵物中分离抗肿瘤活性成分的方法，包括：将粒径为9.1nm的磁性氧化铁纳米颗粒直接加入枸杞发酵液中，并控制摇床转速为80rpm，吸附时间为2h，使磁性氧化铁纳米颗粒充分吸附抗肿瘤因子枸杞多糖；在完成吸附后，以电磁铁将磁性氧化铁纳米颗粒从枸杞发酵液中分离出，并分散于水-乙醇混合溶剂中，超声10min，之后将磁性氧化铁纳米颗粒分离回收，所得清液包含富集的抗肿瘤因子枸杞多糖。
所述磁性氧化铁纳米颗粒于枸杞发酵液中的添加量为4g/l。
将回收的磁性氧化铁纳米颗粒以去离子水和浓度为0.05mol/l的乙酸缓冲液交替清洗，实现对所述磁性氧化铁纳米颗粒的再生处理。
将氯化铁溶液与碱溶液于35℃搅拌0.5小时，之后转移至高压釜内反应，反应温度为120℃，时间为2h，制得磁性氧化铁纳米颗粒；其中，三价铁盐溶液的浓度为0.1m，碱溶液浓度为0.5m，三价铁盐溶液和碱溶液的体积比为1:1。
所述三价铁盐为氯化铁。
所述碱溶液为氢氧化钠溶液。
所述枸杞发酵液的制备方法包括：
1)将枸杞粉碎后加入8倍量水，浸泡2小时后煎煮1小时，药液滤过，滤液备用，在相同条件下将药渣重复提取1次，过滤，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.06，得到浓缩滤液；
2)将上述浓缩滤液与药渣混合，搅拌均匀后按照0.5％质量比接入甜酒曲或黄酒曲，调节ph至7，温度为16℃，厌氧发酵处理7天，得到混合发酵物；
3)将上述混合发酵物在100℃条件下灭菌1小时，冷却至室温后过滤，滤液经纯化后对其进行低温减压浓缩，直至相对密度为1.15，得到浓缩发酵液。
实施例2
本实施例提供了一种从枸杞发酵物中分离抗肿瘤活性成分的方法，包括：将粒径为56nm的磁性氧化铁纳米颗粒直接加入枸杞发酵液中，并控制摇床转速为220rpm，吸附时间为4h，使磁性氧化铁纳米颗粒充分吸附抗肿瘤因子枸杞多糖；在完成吸附后，以电磁铁将磁性氧化铁纳米颗粒从枸杞发酵液中分离出，并分散于水-乙醇混合溶剂中，超声20min，之后将磁性氧化铁纳米颗粒分离回收，所得清液包含富集的抗肿瘤因子枸杞多糖。
所述磁性氧化铁纳米颗粒于枸杞发酵液中的添加量为6g/l。
将回收的磁性氧化铁纳米颗粒以去离子水和浓度为0.08mol/l的乙酸缓冲液交替清洗，实现对所述磁性氧化铁纳米颗粒的再生处理。
将三价铁盐溶液与碱溶液于50℃搅拌0.6小时，之后转移至高压釜内反应，反应温度为150℃，时间为3h，制得磁性氧化铁纳米颗粒；其中，三价铁盐溶液的浓度为0.5m，碱溶液浓度为0.9m，三价铁盐溶液和碱溶液的体积比为1:2。
所述三价铁盐为硫酸铁。
所述碱溶液为碳酸钠溶液。
所述枸杞发酵液的制备方法包括：
1)将枸杞粉碎后加入12倍量水，浸泡3小时后煎煮2小时，药液滤过，滤液备用，在相同条件下将药渣重复提取2次，过滤，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10，得到浓缩滤液；
2)将上述浓缩滤液与药渣混合，搅拌均匀后按照1.5％质量比接入甜酒曲或黄酒曲，调节ph至8，温度为22℃，厌氧发酵处理8天，得到混合发酵物；
3)将上述混合发酵物在100℃条件下灭菌1.5小时，冷却至室温后过滤，滤液经纯化后对其进行低温减压浓缩，直至相对密度为1.20，得到浓缩发酵液。
实施例3
本实施例提供了一种从枸杞发酵物中分离抗肿瘤活性成分的方法，包括：将粒径为128.6nm的磁性氧化铁纳米颗粒直接加入枸杞发酵液中，并控制摇床转速为250rpm，吸附时间为12h，使磁性氧化铁纳米颗粒充分吸附抗肿瘤因子枸杞多糖；在完成吸附后，以电磁铁将磁性氧化铁纳米颗粒从枸杞发酵液中分离出，并分散于水-乙醇混合溶剂中，超声30min，之后将磁性氧化铁纳米颗粒分离回收，所得清液包含富集的抗肿瘤因子枸杞多糖。
所述磁性氧化铁纳米颗粒于枸杞发酵液中的添加量为9g/l。
将回收的磁性氧化铁纳米颗粒以去离子水和浓度为0.1mol/l的乙酸缓冲液交替清洗，实现对所述磁性氧化铁纳米颗粒的再生处理。
将三价铁盐溶液与碱溶液于70℃搅拌1小时，之后转移至高压釜内反应，反应温度为200℃，时间为4h，制得磁性氧化铁纳米颗粒；其中，三价铁盐溶液的浓度为1m，碱溶液浓度为1.5m，三价铁盐溶液和碱溶液的体积比为1:5。
所述三价铁盐为硝酸铁。
所述碱溶液为硼氢化钠溶液。
所述枸杞发酵液的制备方法包括：
1)将枸杞粉碎后加入15倍量水，浸泡4小时后煎煮3小时，药液滤过，滤液备用，在相同条件下将药渣重复提取3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.55，得到浓缩滤液；
2)将上述浓缩滤液与药渣混合，搅拌均匀后按照5％质量比接入甜酒曲或黄酒曲，调节ph至9，温度为35℃，厌氧发酵处理14天，得到混合发酵物；
3)将上述混合发酵物在100℃条件下灭菌3小时，冷却至室温后过滤，滤液经纯化后对其进行低温减压浓缩，直至相对密度为1.55，得到浓缩发酵液。
抗肿瘤药效学对比试验
(—)试验材料
⑴受试动物：昆明种小鼠：18-22g，雌雄兼用，但每批次试验性别相同。
(2)受试样品
试验组：本发明实施例样品，20ml/支口服液；
对比组：发明专利cn201210188331.3方法制备的样品，20ml/支口服液。
(二)试验方法
(1)试验分组
将小鼠随机分为5个组，每组10只。其中：
a组：阴性对照组；b组:环磷酰胺阳性药组，60mg/kg；c组:试验组1，实施例1样品2.5g/kg；d组:试验组2，实施例2样品2.5g/kg；e组:对比试验组，专利cn201210188331.3方法制备的样品2.5g/kg。
(2)给药方法：环磷酰胺阳性药组，环磷酰胺60mg/kg腹腔注射一次；试验组和对比试验组样品，灌胃给药连续9次。
(3)造模方法：取生长良好的小鼠可移植肿瘤lewis胃癌、肝癌h22及肉瘤s180，按抗癌药药效学实验技术要求常规接种小鼠，于接种后24小时分组给药。
(4)检测方法：停药后24小时处死动物，剥瘤称重，计算抑瘤率，并进行统计学处理。
(三)试验结果
(1)对小鼠lewis胃癌的疗效试验
三批试验结果：试验组1(实施例1样品)的抑瘤率分别为：51.8％、48.1％、54.2％(p<0.001、p<0.001、p<0.001)；
试验组2(实施例2样品)的抑瘤率分别为：7.8％、33.5％、38.6％(p<0.01、p<0.01、p<0.01)；
对比试验组的抑瘤率分别为：34.3％、32.6％、37.0％(p<0.01、p<0.01、p<0.01)。
(2)对小鼠肝癌h22的疗效试验
三批试验结果：
试验组1(实施例1样品)抑瘤率分别为：30.1％、42.1％、35.2％(p<0.01、p<0.001、p<0.001)；
试验组2(实施例2样品)的抑瘤率分别为：26.5％、32.9％、23.5％(p<0.05、p<0.01、p<0.05)；
对比试验组的抑瘤率分别为：24.5％、25.6％、22.7％(p<0.05、p<0.05、p<0.05)。
(3)对小鼠肉瘤s180的疗效试验，三批试验结果：
试验组1(实施例1样品)的抑瘤率分别为：43.1％、41.7％、39.2％(p<0.01、p<0.01、p<0.01)；
试验组2(实施例2样品)的抑瘤率分别为：36.0％、33.1％、30.4％(p<0.05、p<0.05、p<0.05)；
对比试验组的抑瘤率分别为：34.2％、33.7％、26.8％(p<0.05、p<0.05、p<0.05)。
以上可以看出，本发明产品(实施例1和实施例2样品)和对比试验样品对三种小鼠肿瘤均表现出了明显的抑制作用，其中对小鼠lewis胃癌疗效最为显著，相比而言，本发明产品(实施例1样品)的抑制肿瘤作用明显优于对比试验样品。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。