融合蛋白hBD2-haFGF1及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种融合蛋白hbd2-hafgf1及其制备方法和应用。
背景技术：
：人β防卫素-2(humanβdefensin-2,hbd-2)是一种来源于皮肤、呼吸道等上皮组织的阳离子抗菌肽。hbd-2在皮肤天然免疫中发挥了重要的作用，当皮肤发生细菌感染或者炎症时，可通过nf-κb通路和丝裂原活化蛋白激酶途径活化，使hbd-2的表达水平显著升高，hbd-2可通过直接杀灭病原菌和参与获得性免疫应答发挥抗菌功能。由于hbd-2具有抗菌活性和免疫调节功能，可通过直接与细菌细胞膜结合，破坏细胞膜完整性，从而导致菌体死亡，还可趋化树突状细胞和记忆t细胞，提高机体获得性免疫水平。在痤疮病损部位，p.acnes为hbd-2的主要诱导源，p.acnes可刺激皮脂腺细胞产生抗菌肽和hbd-2。hafgf和碱性成纤维因子(bfgf)均可用于痤疮的治疗，如与点阵铒激光、微晶磨面等技术相结合，促进痤疮患者瘢痕创面的愈合，下调ⅰ型前胶原基因的表达，减少i型胶原、iii型胶原、tgf-β1、vegf的含量。酸性成纤维细胞生长因子(humanacidicfibroblastgrowthfactors,hafgf)是成纤维细胞生长因子家族成员之一。hafgf具有广泛的生物学作用，能诱导多种细胞分化、增殖、营养和保护神经元，促进伤口修复，诱导缺血区血管形成。研究发现hafgf-1对创伤、糖尿病溃疡等多种皮肤损伤都有良好的促愈合作用。相对于hbfgf，hafgf结合能力更强，更适合创面酸性环境，更为温和持久的生物学活性，在痤疮中可取得更佳的治疗效果。痤疮是一种常见的毛囊、皮脂腺慢性炎症疾病，其发病主要与痤疮丙酸杆菌(p.acnes)、皮脂腺导管的角化、皮脂大量分泌、炎症因子产生有关[6]。痤疮的治疗以抗菌、抗角化、抗雄性激素和抑制瘢痕形成为主[7]。痤疮是一种自限性疾病，临床治疗过程中应避免使用副作用大的药物，同时严重痤疮如果得不到妥善治疗，痤疮导致的色素沉着和较大的瘢痕往往难以修复，极大的影响患者的美观和心理健康，为此开发新型抗痤疮药物有其现实意义。生物信息学是世纪80年代兴起的一门交叉学科，是以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学，可用于对蛋白质结构及功能的分析。融合基因，是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下，构成的嵌合基因。融合基因的表达产物为融合蛋白。根据构成融合基因的种类，可以将融合基因分为四大类：(1)由报告基因和功能基因构成的融合基因。常用的报告基因有：gfp(绿色荧光蛋白)基因、gus基因、lacz基因和luciferasese(虫荧光素酶)基因等，主要目的是对功能基因进行示踪，研究其功能及特性。(2)由信号肽或单体蛋白的序列与功能基因构成的融合基因。其主要目的是利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白，为生产或科研所用。(3)功能基因与功能基因的融合。可分为两类：a相同功能基因的融合，目的是增强基因的功能，扩大基因的应用范围，如杀虫基因之间的融合。b.不同功能基因的融合，为特殊需要而构建，如生产无毒疫苗等。(4)报告基因与抗药性基因的融合用于构建融合载体，以利于插入大片段的cdna或作为双功能标记。但是，随着融合基因的广泛应用，其缺陷也越来越多，经常会出现融合蛋白不稳定，治疗效果不显著等问题。中国专利申请cn102137869b公开了一种fn14/trail融合蛋白，所述fn14/trail融合蛋白包括第一结构域及第二结构域，可用于制备药物组合物，也可用在治疗或改善患有自身免疫病的患者中同种免疫性疾病的方法中。但是，该融合蛋白fn14/trail只包含两个结构域，无连接子连接，导致该融合蛋白不稳定，治疗效果不显著。综上可知，现有技术中的融合蛋白存在不稳定，功能效果低于单一蛋白的缺点。技术实现要素：针对现有技术中存在的缺点，本发明的目的是提供一种融合蛋白hbd2-hafgf1及其制备方法和应用。本发明提供的融合蛋白hbd2-hafgf1，具有连接子，融合后的蛋白质是一个亲水性蛋白，热稳定性强，经生物信息学验证，其理化性质稳定，可以有效用于制备痤疮相关药物。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种融合蛋白hbd2-hafgf1，由第一结构域及第二结构域通过连接子构成，所述第一结构域为β-防御素的保守结构域，所述第二结构域为成纤维细胞生长因子超家族保守结构域。优选地，所述融合蛋白hbd2-hafgf1的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述连接子的氨基酸序列如seqidno.2所示。metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargglyserglupheglyileglyaspprovalthrcysleulysserglyalailecyshisprovalphecysproargargtyrlysglnileglythrcysglyleuproglythrlyscyscyslyslysproglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserpheasnleuproproglyasntyrlyslysprolysleuleutyrcysserasnglyglyhispheleuargileleuproaspglythrvalaspglythrargaspargseraspglnhisileglnleuglnleuseralagluservalglygluvaltyrilelysserthrgluthrglyglntyrleualametaspthraspglyleuleutyrglyserglnthrproasngluglucysleupheleugluargleuglugluasnhistyrasnthrtyrileserlyslyshisalaglulysasntrpphevalglyleulyslysasnglysercyslysargglyproargthrhistyrglyglnlysalaileleupheleuproleuprovalserseraspleugluhishishishishishis(seqidno.1)；glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser(seqidno.2)。优选地，所述融合蛋白hbd2-hafgf1的表达基因的核苷酸序列如seqidno.3所示；atggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgggatccgaattcaggtataggcgatcctgttacctgccttaagagtggagccatatgtcatccagtcttttgccctagaaggtataaacaaattggcacctgtggtctccctggaacaaaatgctgcaaaaagccaggcggaggcggaagcggaggcggaggaagcggcggtggcggcagctttaatctgcctccagggaattacaagaagcccaaactcctctactgtagcaacgggggccacttcctgaggatccttccggatggcacagtggatgggacaagggacaggagcgaccagcacattcagctgcagctcagtgcggaaagcgtgggggaggtgtatataaagagtaccgagactggccagtacttggccatggacaccgacgggcttttatacggctcacagacaccaaatgaggaatgtttgttcctggaaaggctggaggagaaccattacaacacctatatatccaagaagcatgcagagaagaattggtttgttggcctcaagaagaatgggagctgcaaacgcggtcctcggactcactatggccagaaagcaatcttgtttctccccctgccagtctcttctgatctcgag(seqidno.3)。本发明还提供了所述融合蛋白hbd2-hafgf1的制备方法，包括如下步骤：s1、根据hbd-2基因序列和hafgf-1基因序列分别设计pcr引物，其中，hbd-2基因引物的序列信息如seqidno.4，seqidno.5所示，hafgf-1基因引物的序列信息如seqidno.6，seqidno.7所示，然后进行pcr扩增，得hbd-2基因和hafgf-1基因；ccggaattcaggtataggcgatcctgtt(seqidno.4)；ccgctcgagtggctttttgcagcattt(seqidno.5)；ccggaattcatttaatctgcctccaggg(seqidno.6)；ccgctcgagatcagaagagactggcag(seqidno.7)；s2、以步骤s1所得hbd-2基因和hafgf-1基因为模板，另设计引物，其中，hbd-2基因引物序列信息如seqidno.8，seqidno.9所示，hafgf-1基因引物序列信息如seqidno.10，seqidno.11所示，然后进行pcr扩增，得高度保守的hbd-2基因连接片段和hafgf-1基因连接片段；ccggaattcaggtataggcgatcctgtt(seqidno.8)；tggctttttgcagcatttgctgccgccaccgccgcttcctccgcctccgcttccgcctccgcc(seqidno.9)；ggcggaggcggaagcggaggcggaggaagcggcggtggcggcagcccggaattcatttaatctgcctccaggg(seqidno.10)；ccgctcgagatcagaagagactggcag(seqidno.11)；s3、以步骤s2所得高度保守的hbd-2基因连接片段和hafgf-1基因连接片段为模板，进行pcr扩增，得hbd2-hafgf1融合基因；s4、在步骤s3所得hbd2-hafgf1融合基因的f端引入ecori酶切位点，在r端引入xhoi酶切位点，对hbd2-hafgf1融合基因及pet21b质粒进行双酶切，插入pet21b质粒，构建hbd2-hafgf1基因和pet21bt4连接体系，得重组质粒hbd2-hafgf1/pet21b；s5、将步骤s4所得重组质粒hbd2-hafgf1/pet21b转化入dh-5α菌中，接种于氨苄青霉素抗性的lb培养基，筛选阳性转化子，得hbd2-hafgf1/pet21b/bl工程菌；s6、挑取hbd2-hafgf1/pet21b/bl单菌落接种于新的lb液体培养基中，加入异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，纯化，即得。优选地，所述步骤s1中进行pcr扩增时，配制50μl的反应体系，其中，dna聚合酶10μl，dntp4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板1μl，加入ddh2o至50μl；扩增程序为98℃10s，55℃15s，72℃40s，程序运行30个循环。优选地，所述步骤s3中进行pcr扩增时，pcr扩增具体程序如下：配制50μl的反应体系，dna聚合酶10μl，dntp4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，高度保守的hbd-2基因连接片段和hafgf-1基因连接片段各0.5μl，加入ddh2o至50μl；扩增程序为98℃10s，55℃15s，72℃40s，程序运行30个循环。优选地，所述步骤s4中对hbd2-hafgf1融合基因及pet21b质粒进行双酶切时所用体系为hbd2-hafgf1融合基因/pet21b质粒1μg，ecori1μl，xhoi1μl，buffer缓冲液5μl，加入ddh2o至50μl，37℃反应2h。优选地，所述步骤s4中构建hbd2-hafgf1基因和pet21bt4连接体系时配制10μl的溶液，其中，hbd2-hafgf1融合基因与质粒pet21b按3:1的质量比混合，t4连接酶1μl，buffer缓冲液1μl，加入ddh2o至10μl，16℃反应4h。本发明还提供了一种药物组合物，包括融合蛋白hbd2-hafgf1及药学上可接受的药物载体；所述药学上可接受的药物载体包括注射用水，藻酸盐，聚乙二醇，交联淀粉，壳聚糖，卡拉胶。本发明还提供了所述融合蛋白hbd2-hafgf1在制备痤疮药物中的应用。此外，本发明还利用生物信息学工具对hbd2-hafgf1的相关理化性质进行了预测，进一步证明了hbd2-hafgf1具有良好的热稳定性，为亲水蛋白，便于进一步分离纯化。与现有技术相比，本发明提供的融合蛋白hbd2-hafgf1，具有以下优点：(1)本发明提供的融合蛋白hbd2-hafgf1，是采用重叠pcr技术构建的，中间用15个氨基酸柔性连接，有利于融合蛋白hbd2-hafgf1的有效表达；(2)本发明提供的融合蛋白hbd2-hafgf1，以包涵体表达的形式存在，避免了对相关菌种的杀伤作用，有助于蛋白质大量表达；(3)经生物信息学验证，本发明提供的融合蛋白hbd2-hafgf1的热稳定性强，而且对痤疮还具有良好的治疗效果。附图说明图1为利用反转录pcr扩增hbd-2基因和hafgf-1基因的琼脂糖凝胶电泳结果图；图2为利用重叠pcr扩增得到的hbd-2基因连接片段和hafgf-1基因连接片段及融合基因hbd2-hafgf1的琼脂糖凝胶电泳结果图；图3为hbd2-hafgf1/pet21b双酶切鉴定结果图；图4为hbd2-hafgf1/pet21bpcr鉴定结果图；图5为用聚丙烯酰胺凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳对hbd2-hafgf1蛋白的诱导表达和鉴定结果图；图6为hbd2-hafgf1蛋白的α螺旋、β转角和无规则卷曲的分布图；图7为hbd2-hafgf1蛋白的疏水性分析图；图8为异丙基硫代半乳糖苷，ph值，时间，温度对hbd-2-hafgf表达的影响图；图9为诱导hbd-2-hafgf蛋白表达的结果图；图10为各因素交互影响对hbd-2-hafgf表达的影响图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。如dna聚合酶，逆转录试剂盒可购自日本takara公司，dna聚合酶的型号为高保真酶primestarhs；t4连接酶，ecori限制性内切酶，hoi限制性内切酶可购自美国neb公司；琼脂糖凝胶dna回收试剂盒，快速质粒小提试剂盒可购自天根生化科技有限公司；总rna提取试剂盒可购自碧云天生物技术公司；酵母粉可购自广东环凯微生物科技有限公司；大肠埃希菌e.colidh-5α、大肠埃希菌e.colibl(21)和pet21b载体均为本实验室保存。实施例1hbd-2基因和hafgf-1基因的克隆依据hbd-2基因序列(genbank:af071216.1)和hafgf-1基因序列(genbank:15055546)，分别设计2对pcr引物，引物序列如表1。采用碧云天mrna提取试剂盒采集人肝癌细胞hepg2mrna，检测rna纯度和质量合格后，反转录成cdna。以cdna为模板分别扩增hbd-2基因和hafgf-1基因。表1.hbd-2和hafgf-1rt-pcr引物rt-pcr体系：dna聚合酶(primerstarhs)10μl，dntp4μl，正向引物1μl，反向引物1μl，模板1μl，加入ddh2o至50μl。反应程序：98℃10s，55℃15s，72℃40s，程序运行30个循环。1.5％琼脂糖凝胶电泳，分别扩增获得123bp的hbd-2基因和420bp的hafgf-1基因，扩增结果见图1，其中，1-3为hbd-2基因，4为标准分子量，5-7为hafgf-1基因，同预期相符，用天根琼脂糖回收试剂盒回收目标条带，送上海英潍捷基测序。实施例2hbd2-hafgf1融合基因的构建重新设计2对引物，引物信息见表2，以成功克隆的hbd-2基因及hafgf-1基因的cdna序列为模板，分别扩增hbd-2-linker基因和linker-hafgf-1基因，用琼脂糖凝胶电泳分别回收基因条带，获得了168bp的hbd-2-linker基因和465bp的linker-hafgf-1基因，扩增结果见图2，其中，1为标准分子量，2为hbd-2-linker基因，3为linker-hafgf-1基因。同时以hbd-2-linker基因和linker-hafgf-1基因为模板扩增hbd2-hafgf1融合基因，获得588bp左右hbd2-hafgf1融合基因条带，扩增结果见图2中4为hbd2-hafgf1融合基因，hbd-2和hafgf-1基因之间采用45bp的linker基因连接。表2hbd-2-linker和linker-hafgf-1pcr引物soe-pcr反应体系：primerstarhs10μl，dntp4μl，引物f1μl，引物r1μl，hbd-2-linker0.5μl，linker-hafgf-10.5μl，加入ddh2o至50μl。反应程序：98℃10s，55℃15s，72℃40s，程序运行30个循环。1.5％琼脂糖凝胶电泳回收目标条带，送上海英潍捷基测序。实施例3hbd2-hafgf1/pet21b表达载体的构建分别在融合基因hbd2-hafgf1的f端引入ecori酶切位点，在r端引入了xhoi酶切位点，并且均设计了保护碱基(标灰色的部分为保护碱基)，然后分别对hbd2-hafgf1融合基因和pet21b质粒进行双酶切，双酶切结果见图3，其中，1为标准分子量，2为hbd2-hafgf1/pet21b，3和4分别为ecori和xhoi单酶切，5为ecori和xhoi双酶切。酶切体系的配制：质粒/基因1μg、ecori1μl，xhoi1μl，buffer5μl，加入ddh2o至50μl，37℃反应2h，琼脂糖凝胶电泳，分别回收588bp和5400bp左右条带。构建hbd2-hafgf1基因和pet21bt4连接体系，反应体系：hbd2-hafgf1：pet21b＝3:1，t4连接酶1μl，buffer1μl，加入ddh2o至10μl，16℃反应4h。连接产物转化e.colidh-5α，amp+lb板筛选阳性转化子。对阳性转化子分别进行pcr和酶切鉴定，鉴定结果见图4，其中，1为标准分子量，2为空白对照组，3-5为阳性转化子，6为阳性对照。另提取hbd2-hafgf1/pet21b质粒送公司测序，随后将鉴定正确的hbd2-hafgf1/pet21b表达载体转化入大肠埃希菌e.colibl(21)构建hbd2-hafgf1/pet21b/bl(21)工程菌。实施例4hbd2-hafgf1蛋白的诱导表达和鉴定从lb培养板中随机挑取hbd2-hafgf1/pet21b/bl(21)单菌落培养过夜活化，以1：100接种于新的lb液体培养基中，培养3.5h后，加入终浓度为0.75mm的iptg，诱导继续培养4h，收取菌液，离心去除培养基，超声破碎，12000r/min离心，分别取诱导前全菌和诱导后全菌、诱导后上清、诱导后沉淀进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用碧云天超快速染色试剂盒染色。诱导后的蛋白经过sds-page后，转膜，封闭1h，tbst洗涤3次，小鼠抗人6×his抗体4℃孵育过夜(1：2000)，tbst洗涤3次，室温孵育二抗1h，tbst洗涤3次，化学发光，成像系统扫描。结果显示：诱导后的全菌在23.8kd左右有明显蛋白条带，westernblot结果同样显示在23.8kd左右有特异条带，表明hbd2-hafgf1蛋白得到正确表达。比较超声破碎离心后的上清和沉淀，可发现表达主要存在于沉淀中(图5a)，其中，1为标准分子量，2为诱导前全菌检测结果，3为诱导后全菌检测结果，4为诱导后超声破碎后上清液的检测结果，5为诱导后超声破碎后沉淀的检测结果，hbd2-hafgf1蛋白的westernblot鉴定结果见图5b，其中，1为标准分子量，2为诱导后全菌的检测结果。实施例5hbd2-hafgf1重组蛋白的生物信息学分析hbd2-hafgf1物理化学性质采用protparamtool工具进行分析。二级结构预测采用sopmasecondarystructurepredictionmethod，预测蛋白的二级结构和折叠类型。氨基酸保守区域分析采用cdd工具。采用protscale工具分析各氨基酸的疏水性。三级结构预测采用cbs预测分析生成，采用spdbv_4.10软件导出三维构象图片。结果显示，hbd2-hafgf1的理论分子量为23.8kd，理论pi为8.81。分子式为c1040h1619n305o313s13，预测半衰期在哺乳动物中＞30h，在酵母中＞20h，在大肠埃希菌中＞10h，表明hbd2-hafgf1适合在原核系统中表达。不稳定指数(instabilityindex)为41.82，为不稳定蛋白，提示在后续的分离纯化中应注意避免蛋白的降解。脂溶性指数(aliphaticindex)61.59。两亲性指数(grandaverageofhydropathicity)为-0.609，表明蛋白具有较好的热稳定性。bd2-hafgf1融合蛋白主要由延伸链(27.27％)、β转角(13.18％)和随机卷曲(53.64％)组成，hbd2-hafgf1蛋白的二级结构各结构的含量见表3，结构的分布图见图6，其中，1代表薄片，2代表转角，3代表卷曲，4代表螺旋。表3.hbd2-hafgf1蛋白的二级结构分布项目数目(n)比例(％)α螺旋135.91％310-螺旋00.00％π螺旋00.00％β桥00.00％延伸链6027.27％β转角2913.18％弯曲区域00.00％无规则线圈11853.64％模糊状态00.00％其他状态00.00％经过ncbicdd程序分析显示，融合蛋白n端有β防御素保守结构域，c端具有fgf超家族保守结构域，e-value值显示均两者具有高度同源性。疏水性分析结果显示hbd2-hafgf1蛋白为亲水性蛋白。第108位天冬氨酸具有最高的亲水性(-2.767)，205位亮氨酸具有最高的疏水性，便于进一步的分离纯化。疏水性结果见图7。实施例6基于响应面分析方法对hbd-2-hafgf融合蛋白原核表达条件的优化6.1影响hbd-2-hafgf表达的单因素试验单因素实验结果显示：异丙基硫代半乳糖苷(iptg)浓度为0.6mm，ph＝7.0，诱导时间3h，诱导温度为40℃时，hbd-2-hafgf具有最大的产量。因此在设计4因素3水平响应面优化实验中，iptg浓度选择0.6mm、0.8mm和1.0mm，ph选择6、7和8，诱导时间为3h、4h和5h，诱导温度为37℃、40℃和43℃。4因素对hbd-2-hafgf的表达影响见图8。6.2响应面优化分析4因素3水平共计29次试验，试验结果见表4。表4box-behnken响应面试验设计优化结果试验编号诱导时间(h)phiptg(mm)诱导温度(℃)灰度值1470.84055.3522470.64358.0313370.64057.8724471.03744.7225461.04040.4346471.04352.6577370.83748.1768570.84364.2159380.84059.35310371.04049.70711460.64036.91512470.63738.74413370.84341.52614570.64039.79015460.83730.67316480.83744.5517470.84059.23618480.84050.10719461.04344.19620470.84058.05921480.84354.36722470.84051.15723560.84035.37924570.83732.12925360.84028.85326580.84043.47827470.84053.80728571.04051.81229480.64055.062这29次实验中诱导hbd-2-hafgf蛋白的表达结果见图9，其中，箭头的位置为hbd-2-hafgf蛋白的位置。6.3模型建立、响应面及等高线分析经过多元回归拟合，得到诱导温度、ph、诱导时间和iptg浓度与响应值灰度值之间的回归方程灰度值＝55.33-1.59a+0.754b+0.26c+6.33d-0.56ab+5.42ac+9.66ad-2.12bc-0.93bd-2.84cd-4.73a2-8.11b2-1.74c2-4.33d2,a＝时间，b＝ph，c＝iptg，d＝温度。模型的f数值为15.61，p值＜0.0001，表明模型具有显著性，只有0.01％的概率由于噪声导致f值偏大。失拟项的数值为0.91，p值＞0.05，表明失拟项对于误差不显著，回归方程拟合度较好。模型决定系数为r2＝0.9398，表明该模型可以解释响应面中93.98％的可变性。p值＜0.05表明因素具有显著性，在本研究中，ph、温度、时间-ph、时间-iptg、时间-温度、ph-ph、时间-时间、温度-温度均能对蛋白的表达具有显著影响。响应面曲线图可直观反映响应值和试验参数之间的相关关系。时间-ph、时间-iptg和时间-温度交互作用最为陡峭，等高线呈现椭圆形，表明时间-ph、时间-iptg和时间-温度的交互作用对蛋白的表达量具有显著的影响，与回归分析结果一致。通过响应面分析，该回归模型存在最大稳定点。诱导温度39.52℃，iptg浓度0.60mm，ph7.95，时间3h，可达到最大产量，预期灰度值为62.893。为验证该试验结果，采用最优实验条件进行了3次诱导表达，得到实际灰度值为60.258±2.245，占预测数值的95.8％，表明该模型能够反映各因素对hbd2-hafgf诱导表达的影响。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<110>广东药科大学<120>融合蛋白hbd2-hafgf1及其制备方法和应用<130>2018.12.28<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>220<212>prt<213>融合蛋白hbd2-hafgf1氨基酸序列(fusionproteinhbd2-hafgf1aminoacidsequence)<400>1metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargglysergluphe151015glyileglyaspprovalthrcysleulysserglyalailecyshis202530provalphecysproargargtyrlysglnileglythrcysglyleu354045proglythrlyscyscyslyslysproglyglyglyglyserglygly505560glyglyserglyglyglyglyserpheasnleuproproglyasntyr65707580lyslysprolysleuleutyrcysserasnglyglyhispheleuarg859095ileleuproaspglythrvalaspglythrargaspargseraspgln100105110hisileglnleuglnleuseralagluservalglygluvaltyrile115120125lysserthrgluthrglyglntyrleualametaspthraspglyleu130135140leutyrglyserglnthrproasngluglucysleupheleugluarg145150155160leuglugluasnhistyrasnthrtyrileserlyslyshisalaglu165170175lysasntrpphevalglyleulyslysasnglysercyslysarggly180185190proargthrhistyrglyglnlysalaileleupheleuproleupro195200205valserseraspleugluhishishishishishis210215220<210>2<211>45<212>prt<213>连接子蛋白的氨基酸序列(aminoacidsequenceofalinkerprotein)<400>2glyleutyrglyleutyrglyleutyrglyleutyrsergluarggly151015leutyrglyleutyrglyleutyrglyleutyrsergluargglyleu202530tyrglyleutyrglyleutyrglyleutyrsergluarg354045<210>3<211>642<212>dna<213>编码融合蛋白hbd2-hafgf1的碱基序列(basesequenceencodingthefusionproteinhbd2-hafgf1)<400>3atggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgggatccgaattcaggtataggcgat60cctgttacctgccttaagagtggagccatatgtcatccagtcttttgccctagaaggtat120aaacaaattggcacctgtggtctccctggaacaaaatgctgcaaaaagccaggcggaggc180ggaagcggaggcggaggaagcggcggtggcggcagctttaatctgcctccagggaattac240aagaagcccaaactcctctactgtagcaacgggggccacttcctgaggatccttccggat300ggcacagtggatgggacaagggacaggagcgaccagcacattcagctgcagctcagtgcg360gaaagcgtgggggaggtgtatataaagagtaccgagactggccagtacttggccatggac420accgacgggcttttatacggctcacagacaccaaatgaggaatgtttgttcctggaaagg480ctggaggagaaccattacaacacctatatatccaagaagcatgcagagaagaattggttt540gttggcctcaagaagaatgggagctgcaaacgcggtcctcggactcactatggccagaaa600gcaatcttgtttctccccctgccagtctcttctgatctcgag642<210>4<211>28<212>dna<213>扩增hbd-2基因的上游引物序列(amplificationoftheupstreamprimersequenceofthehbd-2gene)<400>4ccggaattcaggtataggcgatcctgtt28<210>5<211>27<212>dna<213>扩增hbd-2基因的下游引物序列(amplificationofthedownstreamprimersequenceofthehbd-2gene)<400>5ccgctcgagtggctttttgcagcattt27<210>6<211>28<212>dna<213>扩增hafgf-1基因的上游引物序列(amplificationoftheupstreamprimersequenceofthehafgf-1gene)<400>6ccggaattcatttaatctgcctccaggg28<210>7<211>27<212>dna<213>扩增hafgf-1基因的下游引物序列(amplificationofthedownstreamprimersequenceofthehafgf-1gene)<400>7ccgctcgagatcagaagagactggcag27<210>8<211>28<212>dna<213>扩增hbd-2-linker基因的上游引物序列(amplificationoftheupstreamprimersequenceofthehbd-2-linkergene)<400>8ccggaattcaggtataggcgatcctgtt28<210>9<211>63<212>dna<213>扩增hbd-2-linker基因的下游引物序列(amplificationofthedownstreamprimersequenceofthehbd-2-linkergene)<400>9tggctttttgcagcatttgctgccgccaccgccgcttcctccgcctccgcttccgcctcc60gcc63<210>10<211>73<212>dna<213>扩增linker-hafgf-1基因的上游引物序列(amplificationoftheupstreamprimersequenceofthelinker-hafgf-1gene)<400>10ggcggaggcggaagcggaggcggaggaagcggcggtggcggcagcccggaattcatttaa60tctgcctccaggg73<210>11<211>27<212>dna<213>扩增linker-hafgf-1基因的下游引物序列(amplificationofthedownstreamprimersequenceofthelinker-hafgf-1gene)<400>11ccgctcgagatcagaagagactggcag27当前第1页12