基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记及其应用的制作方法

文档序号：17448490发布日期：2019-04-17 06:17阅读：301来源：国知局

本发明涉及鉴别大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的基因标记方法及相应引物，所述方法属于农业生物技术领域，可以用于大麦半矮秆多分蘖种质的快速筛选和含fol-a突变基因的分子标记辅助育种。

背景技术：

人口增长、气候变化和自然环境破坏等诸多因素导致了全球粮食短缺，如何提高作物的产量成为育种家普遍关注的问题。上个世纪60年代，半矮秆基因的应用显著提高了作物产量，被称之为“绿色革命”(pengetal.,1999；monnaetal.,2002)，“绿色革命基因”涉及赤霉素代谢途径。半矮秆作物增加了作物的抗倒性，但同时也增加了肥料的投入量，导致了生产成本的提高和环境污染等问题。因此，迫切需要寻找一种新的遗传变异来提高作物的产量。

分蘖和株高是影响作物产量和株型的两个非常重要的农艺性状(sakamotoandmatsuoka,2004；wangandli,2008；alqudahetal.,2016)，虽然他们受到光照，温、湿度、营养和种植方式等环境因素的影响，但是在很大程度上还是由遗传因素决定。因此，研究控制分蘖和株高的基因对于提高作物产量具有重要的意义。

在大麦中，目前报道了5个半矮秆多分蘖基因，分别是int-c,mnd,gra-a,int-m和fol-a(drukaetal.,2011；hussienetal.,2014)。然而，只有int-c和mnd被克隆，int-c是水稻和玉米tb1基因的同源基因，mnd编码细胞色素p450蛋白酶(ramsayetal.,2011；mascheretal.,2014)，其他3个基因gra-a,int-m和fol-a分别定位在大麦染色体3hl，5hl和2hl上。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克隆了一个大麦半矮秆多分蘖基因fol-a，提供了一种与半矮秆多分蘖性状关联的分子标记；本发明所获得的分子标记snpe3，可以鉴定大麦中是否含有fol-a半矮秆多分蘖基因。

为了解决上述技术问题，本发明一种控制半矮秆多分蘖性状的基因fol-a，所述基因的核苷酸序列如seqidno：1所述。

本发明还同时提供了上述半矮秆多分蘖基因fol-a编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seqidno：3所述。

本发明还同时提供了基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记snpe3，以大麦作为物种，所述分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，

正向引物为：

bw370allele-1gaaggtgaccaagttcatgcttttatgctggaacaaacccagg

bowmanallele-2gaaggtcggagtcaacggatttttatgctggaacaaacccaga

反向引物(共同反向引物)acgacacattaactaggccttcc。

注：带下划线的为接头引物。

本发明还同时提供了利用上述分子标记snpe3鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测大麦品种基因组dna(采用ctab法(steinetal.,2001)；

(2)利用分子标记snpe3对大麦基因组dna进行pcr扩增；

(3)根据pcr产物荧光信号的差异，使用quantstudioreal-timepcr软件分析，进而鉴别出每个待测大麦的基因型(即，鉴定出属于纯合野生型，纯合突变型和杂合型，这3类基因型中的哪种)。

作为本发明的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的方法的改进，步骤2)的kasparpcr反应体系为：

1μl基因组dna(浓度为100ng/μl)，0.1μl引物，1.4μl灭菌水和2.5μlkaspbuffer，反应总量为5μl；pcr反应在abiviia7荧光定量pcr仪上进行，反应程序为：95℃15min；94℃变性20s，61℃(-0.6℃/循环)退火60s，10个循环；再94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环；

所述0.1μl引物中，2种正向引物浓度各为10pmol/l，反向引物(共同反向引物)浓度为30pmol/l。

本发明使用的突变体材料bw370，它是由辐射诱变突变体proctor与大麦品种bowman多次回交获得的(drukaetal.,2011，www.nordgen.org)；本发明利用突变体材料bw370，进行分子标记定位和rna-seq试验，克隆了控制bw370半矮秆多分蘖性状的基因fol-a，该基因的核苷酸序列如seqidno：1所述。该半矮秆多分蘖基因fol-a编码的蛋白质具有seqidno：3所述的氨基酸序列。

相对应的，野生型大麦horvu2hr1g098820基因的核苷酸序列如seqidno：2所述，其编码的蛋白质，具有如seqidno：4所述的氨基酸序列。

本发明的研究发现fol-a基因是由于其野生型大麦基因horvu2hr1g098820内含子3的第一个碱基由g变为a，使该基因的剪切方式发生改变，从而导致编码的蛋白发生改变，产生半矮秆多分蘖表型，该基因编码一种胰蛋白酶，不同于以前报道的大麦半矮秆多分蘖基因。利用该突变位点本发明设计了一个kasp标记能够快速准确的检测大麦材料中是否含有fol-a突变基因。

即，本发明经序列分析发现，野生型大麦horvu2hr1g098820基因与半矮秆多分蘖突变体bw370的fol-a基因在核苷酸序列上存在一个单碱基突变，horvu2hr1g098820基因的第3个内含子第一个碱基由g变为a，该突变导致了基因剪切方式发生改变，从而导致编码蛋白提前终止，产生了半矮秆多分蘖的表型。

半矮秆多分蘖突变体bw370和其野生型bowman相比其外在表现为：叶片变细窄(叶宽约为野生型bowman的1/2)，叶色变深，株高变矮(约为野生型bowman的2/3)，分蘖增多(约为野生型bowman1.52-1.84倍)。

本发明利用生物技术克隆了一个大麦半矮秆多分蘖基因fol-a，它不同于以前报道的已克隆的大麦半矮秆多分蘖基因，利用其单碱基突变位点发明人设计了一个kasp标记snpe3，该标记具有以下优点：

1)、本发明所获得的基因标记是根据基因内部碱基突变设计的，因此不存在遗传交换，也不需要表型的进一步验证。

2)、本发明设计的kasp标记直接利用采集的荧光信号进行基因分型，无需电泳、染胶、读带等过程，可以简单快速，高通量的鉴别大麦种质资源中是否含有fol-a基因。

3)、利用本发明方法进行分子标记辅助选择育种，显著提高大麦品种的选择效率。

4)、利用该标记进行fol-a基因的半矮秆多分蘖育种辅助选择可以保证100％的准确率，加快大麦半矮秆多分蘖育种进度。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为fol-a基因结构及其与野生型的差异位点；

图2突变体bw370和bowman中基因fol-a的氨基酸序列对比；

具体是突变体bw370半矮秆多分蘖基因fol-a和bowman中相对应基因horvu2hr1g098820的氨基酸序列比对。

图3为利用本发明设计的kasp标记snpe3鉴定突变体bw370和bowman的fol-a基因型。

左上角为bowman(在彩色图中显示为蓝色)，右下角的●为突变体bw370(在彩色图中显示为红色)，■为阴性对照，均为2个重复。

图4为利用本发明设计的kasp标记snpe3鉴定大麦种质资源；

左上角为野生型(在彩色图中显示为蓝色)，右下角的●为突变体bw370(在彩色图中显示为红色)，中间的为杂合型(在彩色图中显示为绿色)，■为阴性对照。

说明：软件自动形成的图中，红色圆圈代表纯合基因型allel1/allel1，蓝色圆圈代表纯合基因型allel2/allel2，绿色圆圈代表杂合allel1/allel2，×表示基因型不确定。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、设计分子标记snpe3

1)、供试材料：突变体bw370和bowman；

从该突变体bw370克隆到控制半矮秆多分蘖性状的基因fol-a，该基因的核苷酸序列如seqidno：1所述。该半矮秆多分蘖基因fol-a编码的蛋白质具有seqidno：3所述的氨基酸序列。

辐射诱变突变体proctor(诱变后的突变体具有半矮秆多分蘖性状)与大麦品种bowman多次回交获得突变体bw370，其具有bowman的遗传背景，但表现半矮秆多分蘖性状。

野生型bowmanhorvu2hr1g098820基因的核苷酸序列如seqidno：2所述，其编码的蛋白质，具有如seqidno：4所述的氨基酸序列。

2)、半矮秆多分蘖基因fol-a分子标记的获得：根据序列比对结果，发现基因fol-a在突变体bw370和其野生型bowman间存在一个碱基突变，使用premier5软件结合这个单碱基突变位点设计kasp标记，命名为snpe3。

正向引物为：

bw370allele-1gaaggtgaccaagttcatgcttttatgctggaacaaacccagg(5’-3’)

bowmanallele-2gaaggtcggagtcaacggatttttatgctggaacaaacccaga(5’-3’)

反向引物(共同反向引物)acgacacattaactaggccttcc(5’-3’)

注：带下划线的为接头引物。

实施例2、用分子标记鉴定突变体bw370和bowman的序列差异：

1)、dna提取：取大麦叶片100mg，使用ctab法提取dna，具体步骤如下：

①剪叶片于液氮中研磨后装入1.5ml离心管中，每管加ctab600μl于65℃温水浴50-60min(每隔10min取出轻摇)；

②加氯仿/异戊醇(24：1)600微升充分混匀15min，动作缓慢，两两称重，平衡后离心9600转，10min，4℃离心；

③吸取上清液至另一1.5ml新离心管，加2倍体积的无水乙醇轻微混匀(置-20℃冰箱30-60min沉淀)；

③用枪头挑出沉淀，置1.5ml离心管中，用70％乙醇洗2遍风干；

④加100μl超纯水，4℃冰箱溶解(母液)母液：工作液＝1:20。

2)、kasparpcr反应及结果分析：

引物如实施例1所述。

kasppcr反应体系为：1μl基因组dna(浓度为100ng/μl)，0.1μl引物(2种正向引物浓度各为10pmol/l，反向引物(共同引物)浓度为30pmol/l)，1.4μl灭菌水和2.5μlkaspbuffer，反应总量为5μl。pcr反应在abiviia7荧光定量pcr仪上进行，反应程序为：95℃15min；94℃变性20s，61℃(-0.6℃/循环)退火60s，10个循环；再94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环。

注：kaspbuffer为购自lgc公司的kaspmastermix试剂盒；-0.6℃/循环代表每个循环减0.6℃。

直接在abiviia7荧光定量pcr仪上进行pcr反应，所述pcr仪连接quantstudioreal-timepcr软件，从而直接获得分析结果，所得结果如图3，即，软件自动将检测样品按照不同的基因型分成纯合野生型，纯合突变型和杂合型。

quantstudioreal-timepcr软件分析当出现同突变体bw370同样颜色的圆点时，表示圆点对应的材料基因型同bw370，是纯合突变型；当出现同野生型bowman同样颜色的圆点时，表示圆点对应材料的基因型同bowman，是纯合野生型；当出现绿色圆点时，表示圆点对应材料的基因型是杂合型的。

备注说明：2个正向引物前分别设置各自的荧光接头(为不同颜色)，分别对应allele1和allele2，如果检测的材料是纯合基因型，扩增的时候只会选其中对应的一个引物扩增(例如，bw370突变型只能与“bw370allele-1”发生反应)，根据荧光的差异，分辨出所测材料是allel1/allel1还是allel2/allele2，如果检测的材料是杂合型的，扩增时2个引物都会被用到，产生的荧光不同于纯合基因型的材料，从而实现区分杂合的基因型。

软件自动形成的图中，红色圆圈代表纯合基因型allel1/allel1，蓝色圆圈代表纯合基因型allel2/allel2，绿色圆圈代表杂合allel1/allel2，×表示基因型不确定。

实施例3、按照实施例2所述方法利用分子标记snpe3检测32份大麦种质资源(包括突变体bw370和bowman，2个重复)，该大麦种质资源包含野生大麦，地方品种和来自世界各地的大麦育成品种以及bw370与vlamingh杂交所得的f1(见表1)；

结果如图4所示。

检测结果显示这些材料中bw370/vlamingh的f1杂交种为杂合型，突变体bw370为突变型的基因型；其他材料均为野生型的基因型，观测它们的表型也不同于突变体bw370的半矮秆多分蘖表型，说明它们不含有hvthd突变基因，也证明该分子标记能够用于大麦种质资源的检测。

表1、使用分子标记snpe3检测的32份大麦种质资源信息

验证实验：将表1所述的大麦进行dna检测，所得结果为：仅在突变体bw370中检测出如seqidno:1所述的基因序列，bw370/vlamingh的f1杂交种检测出如seqidno:1和seqidno:2所述的基因序列，而其他材料只检测出如seqidno:2所述的基因序列；即所得结果完全同上述实施例3所得结果。

实施例4、将表2所述的大麦按照实施例3所述方法进行检测，检测结果显示这些材料(除bw370外)均为野生型的基因型，观测它们的表型也不同于突变体bw370的半矮秆多分蘖表型，说明它们不含有fol-a突变基因，也证明该分子标记能够用于大麦种质资源的检测。

表2、使用分子标记snpe3检测的82份大麦种质资源信息

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>基于内含子3的鉴定大麦半矮秆多分蘖基因fol-a的分子标记及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4945

<212>dna

<213>大麦(hordeumvulgarel.)

<400>1

gccgggctgctcgtcgtccctctttggtggttgagttgccaatctggtatgccaggttgt60

tgctccctgccagtgccatgggagttccgtgatgcctgcacagtaacagcttcaggcgtt120

ctcttcttatttccttccgccttccttgttggcctcgcttccggggccaaatgccacgga180

aagcttagcagctcggcctccaagaatcttcgccacgggagcagggagctccattgccgc240

tctgcaaccggcatcaatccaagctcgcgtgccttcagctgcaggctctcttctgcggcc300

agataaaagttgcattgctccagcaaaaccgatttcaggcctgctattggatgtaacaca360

aggggagagtgcttgccgtttgttccccccgatttcttgtcggcgggttgtttcttcttt420

tgattatgccttttctctttcagcaaagtgcacgatgcctttgccaaacttcacccgcgg480

tgccgcctgcttaatttgcgcgtaggccctacccttttcgcgtcgatatttttgttatca540

tcacaagtactccgtgtggtagttgtcatgtggatttatgccaattccctgtgtttaaag600

gcagaatttgtgccatgcctttcgccgaacaaacggatggagacttcctccaccctctgg660

cttttgcagattccactctcctgtgatattctctgcttggttctacggcggatgcgcaac720

aagaatatacatatacaatgggtcatattcgtcgtacagaggattcctcttatgatatta780

tctgcttttgtttgcgtggttgcaatcctgcaagaacctattccccgagaatatcaggct840

actccaccagcacttgtttatttattttcttgtgtataatagcttggatgctagctagcc900

tcacactcatacattgcttaatttcaccatacatttcccagtctgatgtaggtctattag960

ggtgcaaacacatttggtagattgctgagtgctaactttccagtgtctcctctcctgaca1020

tttttgccttggggcaagattatgttctcagacttgtttgctctaatttttagggccata1080

gcttctcctgtccactacgcctgtcaactgttcggcacgatgaagccttcagatgacagg1140

atgcagctctcaggtttgacgcggtcggaagagtcgtctcttgatgtggaggggcattgc1200

tctcaccatgaggcatttccttgttctccgtcgatgcaaccggttgcttctgggtgcgtg1260

cacacagaaaacagcgcggcatacttcttatggccgacttcaaacctgcagcattgtgcg1320

gcggagggacgggcaaactactttgggaacctccagaaaggattactgccggtactccct1380

ggaaagctgcccaagggtcagcaagcaaatagcttgcttgatttgatgaccataagagct1440

ttccacagcaagatattgcggcgtttcagccttgggacggcagtgggcttccgcataaca1500

aaaggggttctcacagaaacccctgccattcttgtcttcgttgctcgaaaggttcacaag1560

aaatggcttaatccgaaccaatgccttcctgcaattcttgcggtatgagaacctcatttt1620

atctcttgtcttatattattggacaggcttgttttcagacttggagtcgtttttgtcttt1680

gactaatatctttcacttggctggatgtttacagggtccaggaggtgtttggtgtgatgt1740

tgatgtcgtagaattttcatactatggtgcgccggctcaaacacctaaagaacagacgtt1800

tagtgagcttgttaataagctgtgtggcagtgacgaatatattggttcaggctctcaggt1860

ttatacatctatgctcttatctgtattggtttgcattacctagatatcatcttcttgaag1920

cagtgaatgctgccatgtgtacaaattggattgggcacaaacatgcactactagttattt1980

tctctgtcttgccagtgggctgttcaaattttgtgaagattctttggacaaagtgaataa2040

aattgcagtgcccataaggttatgacaatggctgataggtactatgtcagttcacactgt2100

tatgcataacaatgagctactagaagtcctgccagtgctaactttgttcttgtttagttt2160

aaataaatctttgttcgtttttcttgcggtcgtctctagagtgccaactggatgtaactt2220

aagttaatcccattgtgaactgatcagcaatcagaagtaactttcttaacggcagtctct2280

agagtgtcatgtcatttaatgactaagtacttgaatggtctaagttatcatatgcagctg2340

aacaattgggtccctgcacaaatctagacaccacttatctttaaaactcatgtaccattt2400

tgaatgacagtttttttttctttccaaaacagaactaaattatatactctagaagttaga2460

gcagcatatagtgcattgaatgattcaagagggcatgctctcatttcctgcttgagagtt2520

ctctatacctgtttcactgtctcaggttgcaagccaggatacatttggaactttgggtgc2580

aattgtgaaacgacgcaccaacaacaagcaagttggtttcctcacgaaccgacatgttgc2640

agttgatttggactatcctaaccagaagatgtttcacccgttgccgccgaatcttgggcc2700

tggtgtttatcttggagctgtcgagagggcaacatctttcatcacagatgatgtttggta2760

tggaatttatgctggaacaaacccagatagagcagctacaaattatgcggttgatatagg2820

ggattcatgtattattcgcagaattgaactttaaagtatatgttatagaggaaggcctag2880

ttaatgtgtcgtctatttaaacacaatgtcttaaatgcataaaatgaataaattgatgca2940

ttccacaaacacaaacataagtttgtgatgcaggacttgtctttctgattgtaccagttt3000

ttgtcagtcaggtcaacaacaacttgtgctttagactacataggaacaaaacaatatctg3060

tttatggaacaaaaaacttagtttatgttttatatatgtaaatttataatttatgtttta3120

tatatgtagatttataaacttataagtttctccttctgtttagtgttgttatatatgatg3180

catatgtgctgttctaatccccaaacatatatgctgcccctctgtggacctgcagagaca3240

tttgtacgagctgacggcgcattcatcccatttgctgatgactttgacatttccacagtc3300

acaactgtagttagggaagttggtgagattggggatgttaagattatagatctgcagtgt3360

cctatcaagagcctcatcgggaggcaagtttgcaaagtcggcagaagttccggtcacaca3420

actgggactgtgatggcatatgcccttgagtacaatgatgagaaaggaatatgcttcttc3480

actgacctcctcgttgttggtgagaatcgccaaacatttgatttggagggtgacagcgga3540

agccttattatcctgaccagccaggatggggagaagccacgtcctattgggataatatgg3600

ggtggcacagcaaaccgtgggaggataaagctcacaagtggctatggtcctgaaaactgg3660

actacaggggttgatcttggccgccttcttgatcgcctagaacttgatcttatcataaac3720

gacgaatcgctcaaaggtgagcactgcaacagtttccttcatattccagtgttgtcctgg3780

aaatacatttgccatgcaaacttttattatgttattggcatttttcatatctcattgttg3840

aatcccgtttgctccaatgttacaaggctgacgtaattcatctataataaagatgctgtg3900

caggagcaaaggaatgcttttgtggctgcaattaactctgctattggggagtcctctgcg3960

gtgactgttactgccccagaagccaccccagcagagaaggttgaagagatctttgagcct4020

cttgggatccaaattcagcagctgcctcgtcacgacccgacaagcgccgcagacgaaggg4080

gagggcgcagccaacacaccgtccgacatggaagagcgtcagttcatctcgaacttcgtt4140

ggcatgtctccggtgcgccgtgaccatgatgctcggaggaccattgccaacctgaacaac4200

ccgtcagaggaagagcttgccatgtcgctgcacctaggcgaccgggagcccaagcggcta4260

cgtttggacccggaatcaaacctagacctcgagaagcagcctcacccggaccaggaaccg4320

agcctagatctggagaagcagcctcgttcggacccggaaatgatgagcctagacctggag4380

aagcagcctcgctcggacccggaaccgggcctggacctggagaagcgccttccagctgac4440

ccggagccgagcatagacttggagaagtgaactcgctgattcgaatgacgtctttggaat4500

gagcttgcaaacgataaaatcgagtagatggaagaacccctgtggttcagcaaactggac4560

ctgcgatgttagcttaagttaactactactgctggccttgtggggaagcatatcatttca4620

tatcatgtactagtatggcacttgattcagctccttgtaggatattgttgggtggtatag4680

ccctgcagttttgctgtgctcataagatttgatatacagaatgctgaatctgaatctctt4740

ctcttggagaacaatatgccggcactgatggatgagactctgggatgattgatgtctctt4800

tccaaatcactgatggagtaattgtttgatcttacgatgtatttcttccattccataatt4860

tttgtcgtgtttttagttcaaggggagtacttctcaaatctagcccttgttcaggatctt4920

tttttaaaacccaaattcagaatct4945

<210>2

<211>4945

<212>dna

<213>大麦(hordeumvulgarel.)

<400>2