发明领域本发明涉及b细胞淋巴瘤3(bcl-3)的新抑制剂；新的治疗药或组合物，其包含所述b细胞淋巴瘤3(bcl-3)抑制剂；和所述治疗药或组合治疗癌症、特别是转移性癌症或继发性癌症的用途。发明背景癌症是宽泛的一组多发性疾病，所述疾病全都涉及不受调控的细胞生长。在癌症中，细胞不受控制地分裂和生长，形成恶性肿瘤。在2008年，全世界诊断出大约1270万例癌症，760万人死于癌症。作为一个组别，癌症占每年全部死亡的大约13%，其中最常见的是：肺癌(1,400,000人死亡)、胃癌(740,000人死亡)、肝癌(700,000人死亡)、结肠直肠癌(610,000人死亡)和乳腺癌(460,000人死亡)。这使得侵入性癌症成为发达国家的主要死因和发展中国家的第二主要死因。有超过100种不同类型的癌症，每种癌症的名称来源于其起源的组织或器官。确定不同癌症类型的病因是一个复杂的过程，这是因为普遍认为癌症的形成是多方面的过程。癌症主要是环境性疾病，90-95%的病例归因于环境因素，而5-10%由遗传所致。该疾病的存活机会随癌症的类型和部位以及治疗开始时疾病的程度而变。转移瘤或转移性疾病是癌症从起源组织或器官传播至另一组织或器官。构成原发性癌性肿瘤的细胞通常经历组织转化，随后异常增生，然后间变，导致恶性表型。这种恶性表型允许侵入循环，然后外渗至第二个部位进行肿瘤生成。在肿瘤细胞迁移至另一部位之后，它们再渗入血管或壁继续繁殖，最终形成另一临床上可探测的肿瘤(继发性肿瘤)。尽管对原发性肿瘤的治疗方案或治疗药已有相当好的理解，且功效和成功率得到了提高，尽管某些类型的转移性癌症可用目前这样的治疗治愈，但是大多数转移性癌症显示出反应性差。转移性疾病的治疗的确存在，诸如系统性治疗(化学疗法、生物疗法、靶向疗法、激素疗法)、局部治疗(手术、辐射疗法)或这些治疗的组合。然而，通常来说这些治疗的主要目标是控制癌症的生长或者缓解癌症引起的症状。因此，普遍认为死于癌症的大多数人死于转移性癌症。例如，乳腺癌是英国最常见的癌症，是全世界女性中最为流行的癌症（2008年全世界诊断出138万新病例，占所有新癌症病例的23%）。乳腺癌患者的相对存活率在过去35年中得到了很大提高，局部性疾病通常被认为是可治愈的，然而多达20%的患者可能发展出转移性疾病，而后者的预后差。乳腺癌肿瘤显示出与不同临床后果相关的不同且可再生的乳腺癌亚型。erbb(her2)阳性乳腺癌占所有乳腺肿瘤的大约三分之一，预后特别差，对一线抗癌药显示出抗性，常常发展成转移性疾病，这是患者死亡的常见病因。因此，这种特殊的临床亚型是一种侵入型乳腺癌，转移发生率提高且通常预后差。因此，对癌症向侵入性转移型发展以及对肿瘤细胞特异性分子途径的理解的提高对于改进和产生新疗法而言是必不可少的。然而，存在着各种各样的与靶向转移性疾病和发现新分子靶标相关的困难。早期和转移发展之间的差异需要有与原发性肿瘤靶向疗法不同的新的靶向疗法。此外，靶基因必须在已散播的肿瘤细胞中或者在转移前的原发性肿瘤中可被检测。由于原发性肿瘤发展和转移性疾病之间可能存在潜伏期，故靶向疗法需要施用延长的时期且副作用比常规的癌症疗法更少。nf-κb(活化b细胞的核因子κ轻链增强子)是一种蛋白复合物，其控制dna的转录，参与对刺激物(诸如应激、细胞因子、自由基、紫外辐射、氧化ldl以及细菌或病毒抗原)的细胞应答。nf-κb家族成员通过与dna序列结合，既可诱导也可抑制基因的表达，调节控制程序性细胞死亡、细胞粘附、增殖、免疫和炎症的大量基因。长久以来业已知晓炎症和癌形成(carcinogenesis)之间的关系，因此已知nf-κb提供了炎症和癌症进展之间的联系。此外，nf-κb被真核细胞广泛用作控制细胞增殖和细胞存活之基因的调节物。因此，许多不同类型的人类肿瘤使nf-κb去调节，亦即nf-κb具有组成型活性。去调节的nf-κb已被记载存在于许多癌症中，包括诸如乳腺癌、黑素瘤、肺癌、结肠癌、胰腺癌、食道癌的实体癌中，也存在于血液学恶性肿瘤中。例如，业已表明：nf-κb活化在86%的her2+/er-乳腺癌中明显增加，在33%的基底样癌症中明显增加，这些与无疾病间隔缩短、存活差和抗癌症治疗相关(1)。此外，肿瘤细胞、肿瘤相关基质细胞和内皮细胞中的nf-κb活化被认为在肿瘤发展和侵入中发挥作用(2)。在肿瘤细胞中，nf-κb或者因编码nf-κb转录因子的基因本身突变或者因控制nf-κb活性的基因(诸如iκb基因)突变而具有活性；另外，某些肿瘤细胞分泌使nf-κb成为有活性的因子。阻断nf-κb可使肿瘤细胞停止增殖、死亡或对抗肿瘤药更为敏感。所以，作为抗肿瘤治疗的靶标，nf-κb是制药公司中非常活跃的研究主题，而众多的nf-κb抑制剂和nf-κb诱导物是可获得的。b细胞淋巴瘤3(bcl-3)是调节nf-κb信号转导的原癌基因，其最初被鉴定为b细胞慢性淋巴细胞性白血病中的染色体易位。业已报道在许多肿瘤中存在去调节型bcl-3的过表达，所述肿瘤包括几种白血病和淋巴瘤，诸如间变性大细胞淋巴瘤(alcls)、典型性霍奇金淋巴瘤(chl)和非霍奇金淋巴瘤(3&4)。另外，去调节型表达也已在实体瘤癌症诸如乳腺癌、鼻咽癌和肝癌中观察到(5-7)。已经表明了nf-κb和bcl-3在转移性结肠直肠癌中的作用，其中观察到nf-κb的活化发生在转移传播之前(8)。值得注意的是，bcl-3表达也在正常组织和肿瘤组织中观察到，但是观察到核bcl-3和患者存活之间有关联。也观察到bcl-3表达在乳腺癌细胞系和患者乳腺癌样本中分别相对于非肿瘤发生性细胞系和正常的相邻组织中增加(9)。过表达bcl-3的细胞也导致在乳腺癌发展中支持bcl-3作用的肿瘤数目显著更高(10)。bcl-3的潜在癌基因功能从未被完全阐明。然而，基于对癌细胞系进行的体外实验的已确立的意见是：它在细胞增殖和细胞存活提高中有作用。相比之下，我们先前已经表明：bcl-3特异性地促进erbb2乳腺癌驱动型肿瘤形成转移瘤(11)。尽管bcl-3缺陷型erbb2(mmtv/neu)鼠模型中的原发性肿瘤生长不受影响，但表明由原发性乳腺肿瘤出现已形成的肺转移瘤显著降低40%。此外，有丝分裂指数和凋亡的显著降低在继发性肿瘤病灶中观察到，而在原发性肿瘤中未观察到。另外，通过基因表达敲除研究，表明bcl-3的缺失导致肺转移瘤降低80%，这归因于细胞迁移的丧失，但重要的是，对正常乳腺功能或整体系统性生存力无影响。得自这些观察并且得到该领域先哲支持的含义是：特异性地靶向单个bcl-3亚基或其共活化剂可能是比抑制其上游调节物更为有益的治疗策略，抑制其上游调节物似乎表现出有害的全身毒性。因此，这提示：bcl-3可能代表预防癌症转移和继发性肿瘤形成的适宜治疗靶标。bcl-3通过与nf-κb家族的蛋白p50和p52结合而调节转录。我们已经发现：bcl-3功能可以通过破坏其结合而被抑制，并且bcl-3的抑制导致nf-κb活化、细胞迁移和增殖能力被降低。利用与其同源nf-κb蛋白伴侣结合的bcl3蛋白的分子建模，我们已经鉴定出bcl3蛋白上的新药效团，该药效团影响与nf-κb蛋白的相互作用。我们鉴定了能够抑制bcl3-nf-κb蛋白相互作用、抑制nf-κb信号转导和减弱导致在体内观察到的转移性表型的细胞特征的化合物。因此，这些化合物可用于治疗或预防癌症，尤其是转移性疾病和继发性肿瘤形成。发明叙述按照本发明的第一方面，提供通式(i)化合物：或其盐，其中：a为苯基或吡啶基；各个r1独立地为氢、卤素、硝基、氰基、c1-6烷基、c2-6烯基、c1-6卤代烷基、or5或n(r5r6)；r5和r6各自独立地为氢、c1-6烷基或c1-6卤代烷基，或者，当两个or5取代基与相邻的碳原子连接时，它们可以与所连接的碳原子结合形成5元或6元环；m为1-5；r2为氢或c1-6烷基；q为包含c1-6亚烷基的二价连接基，其中一个或两个-ch2-部分任选地被-o-置换，或者其中两个氢原子任选地被基团(ch2)p置换，其中p为2-4，致使形成环状基团，其中所述二价连接基可以任选地被选自卤素和oh的一个或多个取代基取代；r3为苯基或者5元或6元杂芳基，所述苯基或杂芳基中的任一个可以任选地被选自c1-4烷基、c1-4卤代烷基或oh的一个或多个取代基取代；或者r3为nr7r8；其中r7和r8各自独立地为氢或c1-6烷基，或者r7和r8与它们所连接的氮原子一起形成5-7元杂环，所述杂环任选含有选自n、o和s的一个或多个其他杂原子；各个r4独立地为氢、卤素、硝基、氰基、c1-6烷基、c2-6烯基、c1-6卤代烷基、or9或n(r9r10)；且r9和r10各自独立地为氢、c1-6烷基或c1-6卤代烷基，或者两个or9取代基与相邻的碳原子连接，它们与所连接的碳原子结合形成5元或6元杂环；n为1-4，条件是：所述化合物不是2-[(2-氟苯甲酰基)氨基-n-2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺。在本发明的另一方面，提供通式(i)化合物，包括通式(ia)化合物：或其盐，其中：各个r1独立地为卤素、硝基、氰基、c1-6烷基、c2-6烯基、c1-6卤代烷基、or5或n(r5r6)；r5和r6各自独立地为氢、c1-6烷基或c1-6卤代烷基；m为0、1或2；q为(ch2)p；p为1、2、3或4；r3为吗啉基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑啉基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、咪唑基、三唑基或氨基；各个r4独立地为硝基、氰基、c1-6烷基、c2-6烯基、c1-6卤代烷基、or9或n(r9r10)；r9和r10各自独立地为氢、c1-6烷基或c1-6卤代烷基；且n为0、1或2，条件是：所述化合物不是2-[(2-氟苯甲酰基)氨基-n-2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺。如上所述，这些化合物能够抑制bcl3-nf-κb蛋白的相互作用、抑制nf-κbnf-κb信号转导和减弱导致在体内观察到的转移性表型的细胞特征的化合物，因此这些化合物适用于治疗癌症，尤其是治疗或预防转移性疾病和继发性肿瘤。在本说明文件的说明书和权利要求书全文中，词语“包含(comprise)”和“含有(contain)”或这些词语的变体例如“包括(comprising)”和“含(comprises)”，意指“包括但不限于”，并不排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。在本说明文件的说明书和权利要求书全文中，所述单数包括复数，除非上下文另有要求。特别是，当使用不定冠词时，本说明文件应当理解为考虑复数形式以及单数形式，除非上下文另有要求。本说明文件中引用的所有参考文献(包括任何专利或专利申请)通过引用而结合到本文中。并未承认任何参考文献构成现有技术。此外，也未承认任何现有技术构成本领域的公知常识。本发明各个方面的优选特征可以与任一其他方面相联系来描述。在本说明文件中，提及通式(i)或(ia)化合物时包括无定形形式和晶体形式(包括所有的多晶型)以及同位素变体，例如：通式(i)或(ia)化合物，其中一个或多个氢原子被氘置换、一个或多个碳原子被14c置换，或者一个或多个氮原子被15n置换。在本说明文件中，“c1-6烷基”意指具有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃链。实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基和正己基。术语“c1-4烷基”具有与上述相似的意思，只是它意指具有1-4个碳原子的直链或支链烃链。在本说明文件中，“卤素”意指氟、氯、溴或碘。术语“卤代烷基”意指被一个或多个卤素原子取代的如上定义的烷基。该基团可以具有单个卤素取代基，或者它可以是全卤素基团。实例包括氯甲基、三氟甲基、1,2-二氯乙基、1,1,1-三溴-正丙基和全氟-叔丁基。术语“c2-6烯基”意指含有至少一个碳-碳双键并具有2-6个碳原子的直链或支链烃链。实例包括乙烯基、丙烯-1-基和丙烯-2-基。“c1-6亚烷基”意指具有1-6个碳原子的直链或支链二价烃连接基团。实例包括-ch2-、-ch2ch2-、-ch2ch2ch2ch2-、-ch(ch3)-和-ch(ch2ch3)-。术语“杂环”和“杂环基”意指其中一个或多个环原子被选自n、o和s的杂原子置换的非芳族环状基团。实例包括氮杂丙环、氮杂丁环、吡咯烷、吡咯啉、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吗啉、氧杂丁环、四氢呋喃和噁唑啉。进一步的实例包括稠合或桥接环系，诸如八氢喹啉或降莨菪碱。本说明文件上下文中的术语“杂芳性(heteroaromatic)”和“杂芳基(heteroaryl)”意指具有5-10个环原子(除非另有限定)并含有一个环或两个稠合环的具有芳族特征的环系，其中至少一个环原子是选自n、o和s的杂原子。当杂芳基含有超过一个环时，并非所有环皆必须为芳香性的。单环杂芳基的实例包括吡啶、嘧啶、呋喃、噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、噁唑、异噁唑、噻唑和异噻唑。双环全芳族杂芳基的实例包括喹啉、异喹啉、吲哚、苯并呋喃、苯并咪唑和苯并噻唑。其中一个环不为全芳族的双环杂芳基的实例包括二氢喹啉、四氢喹啉、四氢异喹啉、苯并吡喃、苯并二氢吡喃、苯并咪唑啉、苯并吗啉、异吲哚啉和吲哚啉。本发明化合物的盐包括：有机酸、特别是羧酸和有机磺酸的盐，羧酸盐包括但不限于乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、泛酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、丁酸盐、双葡糖酸盐、环戊酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、草酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、烟酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、乳糖醛酸盐、新戊酸盐(pivolate)、樟脑酸盐、十一酸盐和琥珀酸盐，有机磺酸的盐诸如甲磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、樟脑磺酸盐、2-萘磺酸盐、苯磺酸盐、对氯苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐；和无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、半硫酸盐、硫氰酸盐、过硫酸盐、磷酸和磺酸。适宜时，通式(i)或(ia)化合物的药学上或兽医学上可接受的盐也可以包括碱加成盐，诸如钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、锌盐、镁盐和其他金属盐以及胆碱、二乙醇胺、乙醇胺、乙二胺和其他众所周知的碱加成盐。盐优选为药学上或兽医学上可接受的，但其他盐作为中间体仍可以有价值。在本发明的适宜化合物中，各个r1独立地为氢、卤素、硝基、c1-4烷基、c1-4卤代烷基或or5。r5如上所限定，但更适宜为氢、甲基或乙基、甲基和乙基中的任一个可以任选地被一个或多个卤素取代基取代。在更适宜的通式(i)化合物中，各个r1独立地为氢、卤素、硝基、甲基、三氟甲基、oh、甲氧基或三氟甲氧基。适宜的是，m为1、2或3。在适宜的通式(i)化合物中，a为苯基。在某些适宜的本发明化合物中，r2为氢、甲基或乙基。其中r2为氢的化合物特别适宜。连接基团q适宜为直链或支链c1-6亚烷基。更适宜的是，q为基团(ch2)p，其中p为1-4的整数。在再更适宜的化合物中，p为2或3。在某些适宜的通式(i)化合物中，r3为苯基或5元或6元杂芳基，其中任一种可以任选地被选自c1-4烷基、c1-4卤代烷基或oh的一个或多个取代基取代。更适宜的是，在该实施方案中，r3为苯基或5元或6元含氮杂芳基，所述杂芳基诸如吡啶基、吡咯基、嘧啶基、咪唑基或三唑基、它们中的任一个可以任选地如上所述被取代。再更为适宜的是，r3为苯基或者吡啶基，特别是吡啶基。在其他适宜的化合物中，r3为nr7r8，其中r7和r8各自独立地为氢或c1-6烷基，或者r7和r8与它们所连接的氮原子一起可以形成5-7元杂环，该杂环任选含有选自n、o和s的一个或多个其他杂原子。在该实施方案的更适宜化合物中，r7和r8与它们所连接的氮原子一起可以形成5-7元杂环，该杂环任选含有选自n、o和s的一个或多个其他杂原子。在特别适宜的化合物中，r3为基团nr7r8，其为5元或6元含氮杂环。特别适宜的该类型r3基团包括吗啉、哌啶、哌嗪、吡咯烷、吡唑烷和咪唑啉，特别适宜为吗啉、哌啶、哌嗪和吡咯烷。在某些适宜的通式(i)化合物中，各个r4独立地为氢、卤素、硝基、氰基、c1-4烷基、c1-4卤代烷基或or9；其中r9为氢、c1-4烷基或c1-4卤代烷基。再更适宜的是，各个r4独立地为氢、卤素或甲基或乙基，甲基和乙基中的任一个任选地被一个或多个卤素取代基取代。适宜的是，n为1、2或3。在适宜的式(ia)化合物中，各个r1独立地为卤素、硝基、c1-4烷基、c1-4卤代烷基或or5。r5如以上在式(ia)中所限定，但适宜为氢，或为甲基或乙基，甲基和乙基中的任一个可以任选地被一个或多个卤素取代基取代。在更适宜的通式(ia)化合物中，各个r1独立地为卤素、硝基、甲基、三氟甲基、oh、甲氧基或三氟甲氧基。在再更适宜的通式(ia)化合物中，至少一个r1为氟，更适宜为2-氟。在其他更适宜的通式(ia)化合物中，至少一个r1为or5。r5适宜为c1-6烷基，更适宜为甲基。适宜的是，在通式(ia)化合物中，m为1或2。在某些适宜的通式(ia)化合物中，r3为吗啉基、哌啶基、哌嗪基和吡咯烷基，特别适宜为吗啉基。在某些适宜的通式(ia)化合物中，p为2或3。在某些适宜的通式(ia)化合物中，各个r4独立地为c1-4烷基或or9。r9如以上在式(ia)中所限定，但适宜为氢、c1-4烷基或c1-4卤代烷基，更适宜的是，各个r4独立地为甲基或甲氧基。适宜的是，在通式(ia)化合物中，n为0或1，更适宜为0。特别适宜的通式(i)或(ia)化合物包括：2-[(3-氟苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-[(2-甲氧基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-[(3-甲氧基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-[(4-甲氧基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-[(2-硝基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-[(3-硝基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-[(4-硝基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-[(2-甲基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-苯甲酰氨基-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；3,4-二甲氧基-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺；3,5-二甲氧基-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺；3,4,5-三甲氧基-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺；3,5-二氟-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺；2,6-二氟-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺；2,4-二氟-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺；2-[(2-氟苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基丙基)苯甲酰胺；2-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-n-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺；2-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-n-(吡咯烷-3-基甲基)苯甲酰胺；2-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-n-(哌啶-3-基甲基)苯甲酰胺；2-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-n-(哌嗪-3-基甲基)苯甲酰胺；n-(2-氨基乙基)-2-(2-氟苯甲酰氨基)苯甲酰胺；2-[(2-氟苯甲酰基)氨基]-3-甲基-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-[(2-氟苯甲酰基)氨基]-3-甲氧基-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-[(2-氟苯甲酰基)氨基]-5-碘-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-[(2-氟苯甲酰基)氨基]-2-氯-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺；2-氟-n-(2-((2-吗啉基乙基)氨基甲酰基)苯基)苯甲酰胺；及其药学上或兽医学上可接受的盐。通式(i)化合物可以通过任何适宜的途径制备。例如，通式(i)化合物可以由通式(ii)化合物通过与通式(iii)化合物反应来制备：其中a、r1、m、r4和n如同对通式(i)化合物所限定的；其中q、r2和r3如同对通式(i)化合物所限定的。同样，通式(ia)化合物可以通过任何适宜的途径制备。例如，通式(ia)化合物可以由通式(iia)化合物通过与通式(iiia)化合物反应来制备：其中r1、m、r3、r4如同对通式(ia)化合物所限定的。这些方法构成本发明的又一方面。这些反应可以在碱、通常为非亲核碱、例如叔胺(如n,n-二异丙基乙胺)存在下进行。这些反应可以在有机溶剂如n,n-二甲基甲酰胺、在15-30℃、更通常为约18-25℃(室温)的温度下进行。通式(iii)或(iiia)的胺为众所周知且为容易获得的或可以采用本领域技术人员所熟知的文献中的方法来制备。通式(ii)化合物可以由通式(iv)化合物通过与通式(v)化合物反应来制备：其中r4和n如同对通式(i)化合物所限定的；其中a、r1和m如同对通式(i)化合物所限定的，而x为离去基团，通常为卤素、诸如氯。通式(iia)化合物可以由通式(iva)化合物通过与通式(va)化合物反应来制备：其中r1、m、r4和n如同对通式(ia)化合物所限定的，而x为离去基团，通常为卤素、诸如氯。这些反应可以在有机溶剂如吡啶、在15-30℃、更通常为约18-25℃(室温)的温度下进行。通式(iv)、(iva)、(v)和(va)化合物为众所周知且为容易获得的或可以采用本领域技术人员所熟知的文献中的方法来制备。如上所述，本发明化合物为bcl3抑制剂，因此可用于治疗癌症，例如白血病和淋巴瘤，诸如间变性大细胞淋巴瘤(alcls)、典型性霍奇金淋巴瘤(chl)和非霍奇金淋巴瘤；和实体瘤癌症，诸如乳腺癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌和肝癌。因此，在本发明的另一方面提供用于医药的通式(i)化合物、通式(ia)化合物或2-[(2-氟苯甲酰基)氨基-n-2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺、特别是，提供用于治疗癌症的通式(i)或(ia)化合物，所述癌症例如为：白血病和淋巴瘤，诸如间变性大细胞淋巴瘤(alcls)、典型性霍奇金淋巴瘤(chl)和非霍奇金淋巴瘤；和实体瘤癌症，诸如乳腺癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌和肝癌。在本发明的另一方面，提供通式(i)化合物、通式(ia)化合物或2-[(2-氟苯甲酰基)氨基-n-2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺在制备治疗癌症的药中的用途，所述癌症例如为：白血病和淋巴瘤，诸如间变性大细胞淋巴瘤(alcls)、典型性霍奇金淋巴瘤(chl)和非霍奇金淋巴瘤；和实体瘤癌症，诸如乳腺癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌和肝癌。所述化合物可以或者用于人用医药或者用于兽医药，所述患者可以是哺乳动物，例如但尤其可以为人类。本发明也提供治疗癌症的方法，所述癌症例如为：白血病和淋巴瘤，诸如间变性大细胞淋巴瘤(alcls)、典型性霍奇金淋巴瘤(chl)和非霍奇金淋巴瘤；和实体瘤癌症，诸如乳腺癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌和肝癌，所述方法包括给需要此治疗的患者施用有效量的通式(i)化合物、通式(ia)化合物或2-[(2-氟苯甲酰基)氨基-n-2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺。所述化合物尤其可用于治疗或预防癌症转移。适宜的是，所述癌症为乳腺癌，更尤其是三重阴性乳腺癌或富her2乳腺癌。式(i)或(ia)化合物业已显示尤其在这些乳腺癌亚型模型中预防或治疗转移方面有效。然而，这并不排除其在其他肿瘤类型的转移性疾病方面的适用性或功效。此外，我们在人类癌细胞系中的实验证据表明：bcl-3抑制对肿瘤细胞生存力也可能存在有益治疗效果，这是因为对bcl-3的基因抑制和应用式(i)或(ia)化合物两者都部分地但显著地减少体外肿瘤细胞数量。本发明化合物通常可以配制用于所需途径施用。因此，在本发明的另一方面，提供药物组合物，其包含通式(i)化合物、通式(ia)化合物或2-[(2-氟苯甲酰基)氨基-n-2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺以及药学上或兽医学上可接受的赋形剂或载体。所述载体或每种载体(若存在超过一种载体时)就与制剂中的其他成分相容而言必须是可接受的，且对接受者无害。所述制剂包括适用于经口、直肠、鼻、局部(包括滴眼剂、经口腔含化和舌下)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)施用的制剂，可以通过制药领域熟知的任何方法来制备。给药途径将取决于所治疗的病症，但优选配制用于胃肠外施用的组合物。胃肠外制剂通常是无菌的。所述组合物可以通过将如上限定的活性剂与载体结合而制得。一般而言，所述制剂通过使所述活性剂与液体载体或细碎的固体载体或这两者均匀紧密地结合来制得，如有必要然后使产品定型。本发明延伸至制备药物组合物的方法，包括使通式(i)化合物、通式(ia)化合物或2-[(2-氟苯甲酰基)氨基-n-2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺与药学上或兽医学上可接受的赋形剂或载体相结合。通常，所述化合物的剂量将为约0.01-100mg/kg；以便将血浆中的药物浓度维持在有效抑制bcl3的浓度。通式(i)化合物、通式(ia)化合物或2-[(2-氟苯甲酰基)氨基-n-2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺的治疗有效精确量以及这些化合物的最佳给药途径容易地由本领域普通技术人员通过比较所述活性剂的血液水平与具备治疗效果所需的浓度来确定。通式(i)化合物、通式(ia)化合物或2-[(2-氟苯甲酰基)氨基-n-2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺可以与可用于治疗癌症的一种或多种其他活性剂联合应用。这些活性剂的实例包括但不限于：用于靶向原发病灶或抑制后期疾病发展的一线或辅助性抗激素药、放射治疗或化学治疗药；例如：抗her2药，诸如曲妥珠单抗和帕妥株单抗；和标准辅助治疗方案，诸如5-氟尿嘧啶、多柔比星和环磷酰胺(fac)；5-氟尿嘧啶、表柔比星和环磷酰胺(fec)；以及多柔比星和环磷酰胺(ac)；环磷酰胺、氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(cmf)；以及多西他赛、多柔比星、环磷酰胺(tac)。其他适宜与本发明化合物联用的活性剂为抗血管生成药/抗转移药，诸如贝伐单抗(阿伐斯汀)。本发明的其他特征将从以下实例显而易见。一般来讲，本发明延伸至本公开内容(包括所附的权利要求书和附图)中所公开的任何新特征或任何新特征组合。因此，结合本发明的特定方面、实施方案或实例所述的特征、整数、特性、化合物或化学部分应当被理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实例，除非与其不相容。此外，除非另有所述，否则本文所公开的任何特征皆可以被服务同一目的或相似目的的替代特征所替代。现在将通过例如仅提及以下的实施例和后附的附图来描述本发明，其中：图1.化合物1a的细胞毒性。将mcf-10a[a]、mda-mb-231[b]和skbr3[c]乳腺癌细胞与一系列摩尔浓度的化合物1a在贴壁生长条件下一起培养。24小时后通过细胞滴定度蓝色生存力测定测量细胞生存力，将所得荧光相对于用相关浓度的dmso处理的对照细胞的荧光归一化。数据代表6孔的平均值，误差线代表±sem。剂量反应曲线用graphpad软件生成。每个细胞系的ic50显示在各图的左边。图2.通过间接夹心elisa测定确立化合物1a抑制bcl3与其关联蛋白伴侣nfkb1(p50)结合的能力。将过表达带flag标记的bcl-3的hek-293细胞与一系列摩尔浓度的化合物1a或dmso在正常贴壁生长条件一起培养24小时。在非变性条件下制备细胞裂解液。[a]在抗flag包被elisa板上，用p50抗体进行间接夹心elisa测定。测量405nm下的吸光度，将其相对于dmso对照的吸光度归一化。误差线代表三个独立孔的±sem。剂量反应曲线用graphpad软件生成。化合物1a的ic50嵌入显示。[b]和[c]在flag包被elisa板上，用bcl-3抗体进行间接elisa测定。测量405nm下的吸光度。误差线代表三个独立孔的±sem。图3.通过nf-κb启动子-报告蛋白(荧光素酶)测定确立化合物1a抑制nf-κb信号转导的能力。将过表达bcl-3的mda-mb-231[a]、过表达bcl-3的hek-293细胞[b]和过表达bcl-3和p52的hek-293[c]与一系列摩尔浓度的化合物1a或dmso对照一起培养24小时，然后用nf-κb荧光素酶报告基因连同对照一起转染48小时。nf-κb活性以dmso对照的%来表示。误差线代表三个独立实验的±sem。剂量反应曲线用graphpad软件生成。各个细胞系的ic50嵌入显示。图4.通过boyden室测定(boydenchamberassay)确立化合物1a对细胞运动性的作用。[a]将过表达bcl-3的mda-mb-231细胞与相应浓度的化合物1a(10μm,1μm,100nm,10nm)或dmso在正常贴壁生长条件一起培养24小时，然后与过表达bcl-3结合突变体ankm123的细胞一起平行接种至boyden运动室达24小时。由三个重复boyden室各室的三个视野，计数迁移的细胞。误差线代表±sem。剂量反应曲线用graphpad软件生成。ic50嵌入显示。[b]过表达bcl-3且用化合物1a或dmso处理过的mda-mb-231细胞的已迁移细胞的代表性图像。比例尺代表200μm。图5.系列3化合物的细胞毒性。将mda-mb-231细胞[a-c]和hek-293细胞[d-f]与来自系列1、2或3的化合物(10nm、100nm、1μm和10μm)在贴壁生长条件下一起培养。24小时后通过细胞滴定度蓝色生存力测定(celltitreblueviabilityassay)测量细胞生存力，将所得荧光针相对于用dmso在相同条件下处理的各种细胞的荧光归一化。数据代表6孔的平均值，误差线代表±sem。图6.在mda-mb-231细胞中用系列1-3化合物进行的nf-κb测定。将过表达bcl-3的mda-mb-231细胞与1μm浓度的来自1[a]、2[b]和3[c]的化合物或dmso对照一起培养24小时，然后用nf-κb荧光素酶报告基因连同对照一起转染48小时。nf-κb活性在对数标尺上以相对光单位作图，相对于非过表达bcl-3的mda-mb-231细胞的nf-κb活性归一化。误差线代表三个独立转染的±sem(t检验,*=p<0.05，相对于mda-mb-231bcl-3wt)。图7.通过mda-mb-231细胞中的荧光素酶-报告蛋白测定确立选定类似物对nf-κb信号转导的作用。将过表达bcl-3的mda-mb-231与一系列摩尔浓度的类似物1f[a]、2a[b]、2c[c]和3a[d]或dmso对照一起培养24小时，然后用nf-κb荧光素酶报告基因连同对照一起转染48小时。nf-κb活性以dmso对照的%来表示。误差线代表三个独立转染的±sem。剂量反应曲线用graphpad软件生成。各类似物的ic50显示在各图的左边。图8.通过间接夹心elisa测定确立选定类似物对bcl3与p50结合的作用。将过表达带flag标记的bcl-3的hek-293细胞与一系列摩尔浓度的化合物1f[a]、2a[b]、2c[c]和3a[d]或dmso在正常贴壁生长条件一起培养24小时。在非变性条件下制备细胞裂解液。在flag包被elisa板上，用p50抗体进行间接夹心elisa测定。测量405nm下的吸光度，将其相对于dmso对照的吸光度归一化。误差线代表三个独立孔的±sem。剂量反应曲线用graphpad软件生成。各类似物的ic50显示在各图的左边。在flag包被elisa板上，用bcl-3抗体进行间接elisa测定。测量405nm下的吸光度。误差线代表三个独立孔的±sem。图9.通过boyden室测定(boydenchamberassay)确立选定类似物对细胞运动性的作用。将过表达bcl-3的mda-mb-231细胞与一系列摩尔浓度范围的化合物1f[a]、2a[b]、2c[c]和3a[d]或dmso在正常贴壁生长条件一起培养24小时，然后与表达bcl-3结合突变体ankm123的细胞一起平行接种至boyden运动室达24小时。由三个重复boyden室各室的三个视野计数迁移的细胞。误差线代表±sem。剂量反应曲线用graphpad软件生成。各类似物的ic50显示在各图的左边。图10.确立类似物1f对细胞生存力的作用。将mda-mb-231细胞与一系列摩尔浓度的类似物1f在贴壁生长条件下一起培养。24小时后通过细胞滴定度蓝色生存力测定测量细胞生存力，将所得荧光相对于用相关浓度的dmso处理的对照细胞的荧光归一化。数据代表6孔的平均值，误差线代表±sem。剂量反应曲线用graphpad软件生成。ic50显示在图的左边。图11.二取代和三取代类似物[a]和[b]的生物学评估。将mda-mb-231细胞与一系列摩尔浓度的来自系列1的二取代和三取代化合物(1l-1q)在贴壁生长条件下一起培养。24小时后通过细胞滴定度蓝色生存力测定测量细胞生存力，将所得荧光相对于在相同条件下用dmso处理的相应细胞的荧光归一化。数据代表6孔的平均值，误差线代表±sem。[c]将过表达bcl-3的mda-mb-231细胞与1μm浓度的来自系列1的化合物(1l-1q)一起培养24小时，然后用nf-κb荧光素酶报告基因连同对照一起转染48小时。nf-κb活性在对数标尺上以相对光单位作图，相对于mda-mb-231细胞的nf-κb活性归一化。误差线代表三个独立转染的±sem(t检验,*=p<0.05，相对于mda-mb-231)。图12.通过mda-mb-231细胞中的荧光素酶-报告蛋白测定确立选定二取代和三取代类似物对nf-κb活性的作用。将过表达bcl-3的mda-mb-231与一系列摩尔浓度的类似物1o[a]、1p[b]、1q[c]或dmso对照一起培养24小时，然后用nf-κb荧光素酶报告基因连同对照一起转染48小时。nf-κb活性以dmso对照的%来表示。误差线代表三个独立转染的±sem。剂量反应曲线用graphpad软件生成。ic50显示在各图的左边。实施例化合物的合成本发明化合物按照流程1所示的通用方法来合成。流程1流程1阐述了邻氨基苯甲酸衍生物(iv)和化合物(v)的环化缩合反应，该反应得到中间体(ii)。在第二步中，中间体(ii)与胺(iii)反应，得到终产物(i)。该研究中所用的所有化学药品皆得自商业供应商(sigmaaldrich)，无需进一步纯化而使用。在每个实验之前，将所有的玻璃器皿洗净并干燥。溶剂用buchi旋转蒸发器蒸发。熔点在griffin仪器上用毛细管法测量。1h、13cnmr谱在brukeravance500光谱仪上在25℃下分别以500mhz和126mhz记录。化学位移(δ)以百万分之(几)(ppm)记录。j值以赫兹(hz)记录。二甲基亚砜(dmso)用作溶剂。所用的缩写包括s(单峰)、d(双峰)、t(三峰)、q(四峰)、m(多峰)、dd(双双峰)、dt(双三峰)、td(三双峰)。tlc用mercktlc硅胶60板f254(40-60μm)进行，用uv光(254-366nm)检测。质谱用电离(ei)和电喷雾(es)分别在watersgctpremier或waterslctpremierxe上进行。质谱由卡迪夫大学化学学院(schoolofchemistry,cardiffuniversity)作为服务机构来进行。元素分析(chn)微量分析由medacltd,surrey作为服务机构进行。高分辨质谱由epsrcnationalmassspectrometryservice(swansea,uk)在ltqorkitrapxl上进行。步骤1的通用方法在第一步中，将邻氨基苯甲酸衍生物(iv)溶于吡啶(5ml)和2.2当量取代的苯甲酰氯(v)中，于室温下搅拌。反应通过tlc监测，在邻氨基苯甲酸(v)完全消失后大约1小时终止反应。将反应混合物倾入10%碳酸钠溶液(3g碳酸钠,27ml蒸馏水)中。所生成的沉淀通过在减压下过滤收集，作为中间体(ii)。步骤2的通用方法在第二步中，向搅拌的中间体(ii)的dmf(10ml)溶液中加入2当量dipea和2.2当量胺(iii)。反应混合物在室温下搅拌过夜。原材料(ii)的完全消失通过tlc监测。将反应混合物溶于dcm中，用水洗涤3次。产物在减压下蒸发，使所得固体从乙醇中重结晶。所合成的所有化合物皆通过1h、13cnmr分析。最终化合物的纯度也通过元素分析加以证实。实施例1–系列1化合物的合成系列1化合物具有通式：步骤1–中间体的合成2-(2-氟苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1a)的合成化学式：c14h8fno2,分子量：241.22合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量2-氟苯甲酰氯(0.96ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为85%(0.75g),mp97℃。2-(3-氟苯基-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1b)的合成化学式：c14h8fno2,分子量：241.22合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量3-氟苯甲酰氯(0.98ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为80%(0.71g),mp96℃。2-(4-氟苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1c)的合成化学式：c14h8fno2分子量：241.22合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量4-氟苯甲酰氯(0.95ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为91%(0.80g)，熔点为159℃。2-(2-甲氧基苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1d)的合成化学式：c15h11no3分子量：253.25该合成方法按照上述的通用方法，采用溶于无水条件、氮气氛下的干燥吡啶(5ml)和2.2当量2-甲氧基苯甲酰氯(1.19ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为98%(0.91g)，熔点为107℃。2-(3-甲氧基苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1e)的合成化学式：c15h11no3分子量：253.25合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于无水条件、氮气氛下的干燥吡啶(5ml)和2.2当量3-甲氧基苯甲酰氯(1.13ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为97%(0.90g)，熔点为103℃。2-(4-甲氧基苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1f)的合成化学式：c15h11no3分子量：253.25合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于无水条件、氮气氛下的干燥吡啶(5ml)和2.2当量4-甲氧基苯甲酰氯(1.09ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为71%(0.66g)，熔点为121℃。2-(2-硝基苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1g)的合成化学式：c14h8n2o4分子量：268.22合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量2-硝基苯甲酰氯(1.06ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集黄色固体，收率为77%(0.75g)，熔点为169℃。2-(3-硝基苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1h)的合成化学式：c14h8n2o4分子量：268.22合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量3-硝基苯甲酰氯(1.06ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集，为黄色固体，收率为96%(0.94g)，熔点为115℃。2-(3-硝基苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1i)的合成化学式：c14h8n2o4分子量：268.22合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量4-硝基苯甲酰氯(1.49g,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集黄色固体，收率为96%(0.94g)，熔点为169℃。2-(邻甲苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1j)的合成化学式：c15h11no2分子量：237.25合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量2-甲基苯甲酰氯(1.05ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集黄色固体，收率为99%(0.86g)，熔点为102℃。2-苯基-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1k)的合成化学式：c14h9no2分子量：223.23合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量苯甲酰氯(0.93ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集黄色固体，收率为95%(0.77g),mp91℃。2-(3,4-二甲氧基苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1l)的合成化学式：c16h13no4分子量：283.28合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量3,4-二甲氧基苯甲酰氯(1.61g,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为83%(0.86g)，熔点为166℃。2-(3,5-二甲氧基苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1m)的合成化学式：c16h13no4分子量：283.28合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量3,5-二甲氧基苯甲酰氯(1.61g,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为93%(0.97g)，熔点为165℃。2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1n)的合成化学式：c17h15no5分子量：313.30合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量3,4,5-二甲氧基苯甲酰氯(1.85g,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为91%(1.04g)，熔点为165℃。2-(3,5-二氟苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1o)的合成化学式：c14h7f2no2分子量：259.21合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量3,5-二氟苯甲酰氯(0.95ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为94%(0.89g)，熔点为122℃。2-(2,6-二氟苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1p)的合成化学式：c14h7f2no2分子量：259.21合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量2,6-二氟苯甲酰氯(1.01ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为97%(0.92g)，熔点为119℃。2-(2,4-二氟苯基)-4h-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体1q)的合成化学式：c14h7f2no2分子量：259.21合成方法按照上述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量2,4-二氟苯甲酰氯(0.99ml,8.02mmol)中的邻氨基苯甲酸(0.50g,3.65mmol)。收集白色固体，收率为81%(0.76g)，熔点为102℃。步骤2–实施例化合物的合成2-[(2-氟苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺(化合物1a)的合成化学式：c20h22fn3o3分子量：371.41合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用dmf(10ml)中的中间体1a(1.00g,4.15mmol)、2当量dipea(1.19ml,8.29mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(1.44ml,9.12mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为47%(0.73g)，熔点为131℃。化合物1a盐酸盐的合成将化合物1a(0.31g,0.81mmol)溶于150ml甲醇中。加入甲醇中的氯化氢(1.2ml,1.25m)，将混合物于室温搅拌1小时。从混合物中蒸发甲醇，然后加入己烷并蒸发己烷。向混合物中加入dcm(2ml)，然后加入己烷，减压过滤所生成的白色沉淀。收率为79%,(0.26g)，熔点为145℃。c20h22fn3o3(371.41)的计算值:c,64.68；h,5.97；n,11.31。实测值：c,64.49；h,6.08；n,11.29.ms(ei+):372.22-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺(化合物1c)的合成化学式：c20h22fn3o3分子量：371.41合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1c(0.50g,2.06mmol)、2当量dipea(0.72ml,4.12mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.60ml,4.54mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为8%(0.05g)，熔点为129℃。c20h22fn3o3(371.41)的计算值:c,64.62；h,6.09；n,11.32。实测值:c,64.49；h,6.08；n,11.29。2-[(3-甲氧基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺(化合物1e)的合成化学式：c21h25n3o4分子量：383.44合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1e(0.50g,1.97mmol)、2当量dipea(0.69ml,3.94mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.57ml,4.34mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为0.33g(44%)，熔点为105℃。c21h25n3o4(383.44)的计算值:c,65.78；h,6.57；n,10.95.实测值:c,65.71；h,6.77；n,10.98.2-[(4-甲氧基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺(化合物1f)的合成化学式：c21h25n3o4分子量：383.44合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1f(0.50g,1.97mmol)、2当量dipea(0.69ml,3.94mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.57ml,4.34mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为32%(0.24g)，熔点为110℃。c21h25n3o4(383.44)的计算值:c,65.78；h,6.57；n,10.95。实测值：c,65.63；h,6.62；n,10.95.2-[(2-硝基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺(化合物1g)的合成化学式：c20h22n4o5分子量：398.16合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1g(0.50g,1.87mmol)、2当量dipea(0.65ml,3.74mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.54ml,4.11mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为49%(0.37g)，熔点为139℃。c20h22n4o5(398.16)的计算值:c,60.29；h,5.57；n,14.06.实测值:c,60.34；h,5.61；n,13.97.2-[(4-硝基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺(化合物1i)的合成化学式：c20h22n4o5分子量：398.16合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1i(0.50g,1.87mmol)、2当量dipea(0.65ml,3.74mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.54ml,4.11mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为51%(0.38g)，熔点为148℃。c20h22n4o5(398.16)的计算值:c,60.29；h,5.57；n,14.06。实测值：c,60.36；h,5.54；n,14.05.2-[(2-甲基苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺(化合物1j)的合成化学式：c21h25n3o3分子量：367.44合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1j(0.50g,2.11mmol)、2当量dipea(0.61ml,4.64mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.74ml,4.22mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为14%(0.11g),mp76℃。c21h25n3o3(367.44)的计算值:c,68.64；h,6.86；n,11.44。实测值：c,68.27；h,6.71；n,11.28.3,4-二甲氧基-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺(化合物1l)的合成化学式：c22h27n3o5分子量：413.47合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1l(0.25g,0.88mmol)、2当量dipea(0.31ml,1.77mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.26ml,1.94mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为22%(0.19g)，熔点为106℃。c22h27n3o5(413.47)的计算值:c,63.91；h,6.58；n,10.16。实测值：c,63.54；h,6.86；n,10.113,5-二甲氧基-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺(化合物1m)的合成化学式：c22h27n3o5分子量：413.47合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1m(0.25g,0.88mmol)、2当量dipea(0.31ml,1.77mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.26ml,1.94mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为58%(0.21g)，熔点为120℃。c22h27n3o5(413.47)的计算值:c,63.91；h,6.58；n,10.16。实测值：c,63.66；h,6.43；n,10.03.3,4,5-三甲氧基-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺(化合物1n)的合成化学式：c23h29n3o6分子量：443.21合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1n(0.25g,0.80mmol)、2当量dipea(0.28ml,1.60mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.23ml,1.76mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为52%(0.18g)，熔点为117℃。c23h29n3o6(443.21)的计算值:c,62.29；h,6.59；n,9.47。实测值：c,62.29；h,6.46；n,9.49.3,5-二氟-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺(化合物1o)的合成化学式：c20h21f2n3o3分子量：389.40合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1o(0.25g,0.96mmol)、2当量dipea(0.33ml,1.92mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.28ml,2.11mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为40%(0.15g)，熔点为116℃。c20h21f2n3o3(389.40)的计算值:c,61.69；h,5.44；n,10.79。实测值：c,61.56；h,5.27；n,10.68.2,6-二氟-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺(化合物1p)的合成化学式：c20h21f2n3o3分子量：389.40合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1p(0.25g,0.96mmol)、2当量dipea(0.33ml,1.92mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.28ml,2.11mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为61%(0.25g)，熔点为136℃。c20h21f2n3o3(389.40)的计算值:c,61.69；h,5.44；n,10.79。实测值：c,61.68；h,5.31；n,10.82.2,4-二氟-n-(2-[(2-吗啉-4-基乙基)氨基甲酰基]苯基)苯甲酰胺(化合物1q)的合成化学式：c20h21f2n3o3分子量：389.40合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1q(0.25g,0.96mmol)、2当量dipea(0.33ml,1.92mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.28ml,2.11mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为55%(0.21g)，熔点为121℃。c20h21f2n3o3(389.40)的计算值:c,61.69；h,5.44；n,10.79。实测值：c,61.59；h,5.24；n,10.70.实施例2–系列2化合物的合成系列2化合物具有通式：步骤1–实施例化合物的合成2-[(2-氟苯甲酰基)氨基]-n-2-吗啉-4-基丙基)苯甲酰胺(化合物2a)的合成化学式：c21h24fn3o3分子量：385.43合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1a(0.50g,2.07mmol)、2当量dipea(0.72ml,4.14mmol)和2.2当量3-吗啉基丙-1-胺(0.67ml,4.56mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为17%(0.14g)，熔点为108℃。c21h24fn3o3(385.43)的计算值:c,65.44；h,6.28；n,10.09。实测值：c,65.44；h,6.39；n,10.94.2-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-n-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物2b)的合成化学式：c21h18fn3o2分子量：363.38合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1a(0.50g,2.07mmol)、2当量dipea(0.72ml,4.14mmol)和2.2当量2-(吡啶-2-基)乙胺(0.55ml,4.56mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为褐色固体。收率为44%(0.34g)，熔点为88℃。ms(es+):362.13[m+1].高分辨ms:364.1456[m-1]–组成:c21h19fn3o2(δppm0.1)或c18h21f5o2(δppm-0.1).2-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-n-(吡咯烷-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物2c)的合成化学式：c20h22fn3o2分子量：355.17合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1a(0.50g,2.07mmol)、2当量dipea(0.72ml,4.14mmol)和2.2当量2-(吡咯烷-1-基)乙胺(0.58ml,4.56mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为黄色/褐色固体。收率为41%(0.30g)，熔点为89℃。c20h22fn3o2(355.17):c,67.59；h,6.24；n,11.82。实测值：c,67.66；h,6.19；n,11.67.2-[(4-氟苯甲酰基)氨基]-n-(哌啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物2d)的合成化学式：c21h24fn3o2分子量：369.43合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1a(0.50g,2.07mmol)、2当量dipea(0.72ml,4.14mmol)和2.2当量2-(哌啶-1-基)乙胺16d(0.65ml,4.56mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为51%(0.39g)，熔点为94℃。c21h24fn3o2(369.43)的计算值:c,68.27；h,6.55；n,11.37。实测值：c,67.95；h,6.82；n,11.44.n-(2-氨基乙基)-2-(2-氟苯甲酰氨基)苯甲酰胺(化合物2f)的合成化学式：c16h16fn3o2分子量：301.32合成方法按照上述步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体1a(0.50g,2.07mmol)、2当量dipea(0.72ml,4.14mmol)和2.2当量乙-1,2-二胺(0.31ml,4.56mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为黄色固体。收率为43%(0.27g)，熔点为96℃。ms(el+):301.12.高分辨ms:302.1301[m-1].组成:c21h18o2(δppm-0.1),c13h19o2f5(δppm0.4),c16h17o2n3f1(δppm0.6).实施例3–系列3化合物的合成系列3化合物具有通式：步骤1–中间体的合成2-(2-氟苯基)-8-甲氧基-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体3a)的合成化学式：c15h10fno3分子量：271.24合成方法按照对步骤1所述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量2-氟苯甲酰氯(0.79ml,6.58mmol)中的2-氨基-3-甲氧基苯甲酸(0.50g,2.99mmol)。收集白色固体，收率为92%(0.75g)，熔点为131℃。2-(2-氟苯基)-8-甲氧基-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体3b)的合成化学式：c15h10fno2分子量：255.21合成方法按照对步骤1所述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量2-氟苯甲酰氯(0.87ml,7.28mmol)中的2-氨基-3-甲基苯甲酸(0.50g,3.31mmol)。收集白色固体，收率为97%(0.81g)，熔点为106℃。2-(2-氟苯基)-8-甲氧基-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体3c)的合成化学式：c14h7fino2分子量：367.11合成方法按照对步骤1所述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量2-氟苯甲酰氯(0.50ml,4.18mmol)中的2-氨基-5-碘苯甲酸(0.50g,1.90mmol)。收集白色固体，收率为90%(0.63g)，熔点为159℃。5-氯-2-(2-氟苯基)-3,1-苯并噁嗪-4-酮(中间体3d)的合成化学式：c14h7clfno2分子量：275.66合成方法按照对步骤1所述的通用方法进行，采用溶于吡啶(5ml)和2.2当量2-氟苯甲酰氯(0.76ml,6.41mmol)中的2-氨基-6-氯苯甲酸(0.50g,2.91mmol)。收集白色固体，收率为89%(0.71g)，熔点为104℃。步骤2–实施例化合物的合成2-[(2-氟苯甲酰基)氨基]-3-甲氧基-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺(化合物3a)的合成化学式：c21h24fn3o4分子量：401.43合成方法按照步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的中间体3a(0.50g,1.84mmol)、2当量dipea(0.64ml,3.69mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.53ml,4.06mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为14%(0.27g)，熔点为131℃。对于c21h24fn3o4(401.43)的计算值:c,62.83；h,6.03；n,10.47。实测值：c,62.76；h,6.17；n,10.53.2-[(2-氟苯甲酰基)氨基]-3-甲基-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺(化合物3b)的合成化学式：c21h24fn3o3,分子量：385.43合成方法按照步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的2-(2-氟苯基)-8-甲基-3,1-苯并噁嗪-4-酮(0.50g,1.96mmol)、2当量dipea(0.68ml,3.91mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.57ml,4.31mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为白色固体。收率为42%(0.32g)，熔点为165℃。c21h24fn3o3(385.43)的计算值:c,65.44；h,6.28；n,10.90。实测值：c,65.66；h,6.27；n,10.96.2-[(2-氟苯甲酰基)氨基]-2-氯-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺(化合物3d)的合成化学式：c20h21fcln3o3分子量：405.85合成方法按照步骤2的通用方法进行，采用在dmf(8ml)中的2-(2-氟苯基)-5-氯-3,1-苯并噁嗪-4-酮(0.50g,1.83mmol)、2当量dipea(0.64ml,3.65mmol)和2.2当量2-吗啉基乙胺(0.53ml,4.02mmol)。产物从乙醇中重结晶出来，为黄色固体。收率为33%(0.25g)，熔点为121℃。c20h21fcln3o3(405.85)的计算值:c,59.19；h,5.22；n,10.35。实测值：c,59.40；h,5.21；n,10.38.生物学实施例材料和方法克隆程序nf-κb荧光素酶报告质粒nf-κb荧光素酶测定用3xκb荧光素酶报告质粒进行，该质粒由ronhay教授(universityofst.andrews)馈赠。含有lacz序列的pcdna3.1质粒用作转染效率的对照(由trevordale教授(schoolofbiosciences,cardiffuniversity)馈赠)。对于阳性对照和阴性对照，分别使用pgl3荧光素酶报告载体(promega)pgl3control和pgl3basic。细胞培养物的维持和贮存实验细胞系人胚肾细胞(hek-293)由vladimirbuchman教授(schoolofbiosciences,cardiffuniversity)馈赠。人乳腺癌细胞系mda-mb-231、skbr3和zr-7s-1由juliagee博士(departmentofpharmacyandpharmaceuticalsciences,cardiffuniversity)馈赠。人正常乳腺癌细胞系mcf-10a由torstenstein博士(divisionofcancersciencesandmolecularpathology,universityofglasgow)馈赠。下文对所用的主要细胞系进行描述。hek-293为来源于人胚肾细胞的非肿瘤发生性细胞系。hek-293细胞方便地用于我们的研究是因为它们容易被转染并且其bcl-3蛋白的基础水平不可检测。mda-mb-231为从腺癌胸腔积液分离的高度转移性人基底上皮细胞系。所述细胞为“三重阴性”，因为它们缺乏雌激素、孕酮和erbb2受体，并且它们强烈地过表达egfr。该细胞系中的所述受体表达已得到宿主实验室(hostlaboratory)证实。skbr3细胞系为来源于胸腔积液的差转移性的人乳腺导管腔上皮细胞(luminalepithelial细胞系)。skbr3细胞为雌激素和孕酮受体阴性，过表达erbb2受体，且其egfr受体水平非常低。zr-7s-1细胞系为来源于具有浸润性导管癌的恶性腹水积液的中度转移性人乳腺导管腔上皮细胞。zr-7s-1细胞为雌激素和孕酮受体阳性。它们表达非常低水平的erbb2受体且过表达egfr。mcf-10a为乳腺上皮细胞系，被认为是非肿瘤发生性乳腺细胞的模型。mcf-10细胞来源于健康状况良好的36岁女性的乳腺组织，无限增殖化mcf-10a系可以在培养物中生长，具有稳定的近二倍体核型以及经过培养物适应的乳腺上皮细胞典型的适度基因修饰。细胞系的维持hek-293细胞系在添加10%v/v胎牛血清(fbs,sigma,dorset,uk)、青霉素(50u/ml,invitrogen)、链霉素(50u/ml,invitrogen)和l-谷氨酰胺(2mm,invitrogen)的dulbecco修饰eagle氏培养基(dmem,invitrogen)中维持。mda-mb-231、zr-75-1和skbr3细胞系在添加10%v/vfbs、青霉素(50u/mlinvitrogen)、链霉素(50u/ml,invitrogen)和l-链霉素(2mm,invitrogen)的rpmi培养基(invitrogen)中维持。mcf-10a细胞系在添加5%v/v马血清(sigma,dorset,uk)、青霉素(50u/ml,invitrogen)、链霉素(50u/ml,invitrogen)、表皮生长因子(egf,20ng/ml,sigma)、氢化可的松(0.5mg/ml,sigma)、霍乱毒素(100mg/ml,sigma)和胰岛素(10μg/ml,sigma)的dulbecco修饰eagle氏培养基营养混合物f-12(dmem/f-12,invitrogen)维持。所有细胞系于37℃、5%co2下、在t25或t80组织培养瓶(nunc,leics,uk)中孵育，每3-8天当其达到80-90%融合时以1:4-1:12的分传比进行常规传代。基于细胞的测定细胞滴定度蓝色生存力测定(celltitreblueviabilityassay)特定测定实验终点时的细胞生存力采用细胞滴定度蓝色试剂(celltitrebluereagent,promega,southampton,uk)测定。该试剂用刃天青作为指示染料测量细胞的代谢活性。因此，活细胞具有代谢活性，会将刃天青还原成高荧光的试卤灵。测定所得的荧光水平，指示细胞生存力。将细胞一式三份以低融合度于96孔板中铺板于100μl完全生长培养基中，于37℃、5%co2下孵育所需的试验暴露周期。对于96孔板内的每100μl培养基，加入20μl细胞滴定度蓝色试剂，随后于37℃、5%co2下孵育1小时。然后在flurostaroptima读板仪(bmgtabtech,bucks,uk)上通过将激发/发射波长设定为560/590nm来测量荧光。细胞计数为了确立三天时间周期的细胞生存力，将各种细胞一式三份以低融合度接种于96孔板内的100μl完全生长培养基中，于37℃、5%co2下孵育。24小时后，第一个时间点的来自三个重复孔的细胞用0.25%胰蛋白酶/edta(invitrogen)分离，重悬于完全生长培养基中，进行单独计数。对于接种后48小时和72小时的每个细胞系进行同样的操作。细胞nf-κb活性的测定对于nf-κb荧光素酶测定，将细胞以适宜的密度接种于透明底黑色96孔板(corninglnc.,lowell,us)内的无抗生素培养基中。24小时后，细胞每孔用10ng3xκb荧光素酶质粒和10ngpcdna3.1-lacl质粒转染。也包括空pcdna3.1质粒，以便将转染的dna总重量归一化为100ng。对于阳性对照和阴性对照，分别用10ngpgl3control或pgl3basic代替3xkb荧光素酶质粒进行转染。转染用lipofectamineltx试剂(invitrogen,paisley,uk)进行。用荧光素酶报告质粒后转染48小时后，吸出培养基，用50μl/孔glo-裂解缓冲液(promega,southampton,uk)裂解细胞。将板置于摇床上20min，以促进细胞完全裂解。然后每孔取出20μl裂解液，将其转移至新的透明底黑色孔板中测量lacz活性，作为转染效率对照，然后加入20ul/孔beta-glo底物(promega,southampton,uk)，室温下培养至少20min。随后，向原始板中加入30μl/孔bright-glo荧光素酶底物(promega,southampton,uk)，立即评估荧光活性。用flurostaroptima读板仪(bmgtabtech,bucks,uk)读取由任一反应产生的荧光。然后将所得荧光素酶活性相对于由beta-glo测量获得的lacz活性归一化，以相对光单位(r.t.u)显示。boyden室迁移测定人乳腺癌细胞系的迁移能力或侵入能力用boyden室测定进行评估。将细胞接种于具有多孔膜(具有8μm孔的透明聚对苯二甲酸乙二酯(pet)膜)作为固体载体的室(对于迁移测定)内或者接种于具有包被有matrigel基底膜基质的多孔膜的室(bdbiocoat生长因子还原侵入室(bdbiocoatgrowthfactorreducedinvasionchambers))(对于侵入测定)内的低血清培养基中。将细胞插件置于具有完全生长培养基的孔中，因此细胞受到血清梯度刺激，从而通过孔跨膜迁移或侵入。将总共750μl含有10%血清的完全生长培养基加入24孔细胞培养物插件陪伴板(cellcultureinsertcompanionplate)(bdbiosciences,oxford,uk)的合适孔中。然后用镊子将细胞培养物插件(bdbiosciences,oxford,uk)小心地置于插件陪伴板的各孔中。用0.25%w/v胰蛋白酶/edta(invitrogen)使细胞从组织培养板上分离下来，以13000rpm离心5min。通过重悬浮和离心将细胞在无血清培养基中洗涤2次。将适当数量的细胞(2x105细胞/ml，对于mda-mb-231细胞)重悬于仅含0.1%血清的正常生长培养基。将350μl细胞悬液加入细胞培养物插件的合适上室中，将板于37℃、5%co2下孵育24小时。孵育后，通过在室的顶部和底部用70%冰冷的乙醇(fisherscientific)替换培养基，将膜上的细胞固定。板于-20℃孵育至少1小时。固定后，用镊子将插件浸入自来水中，以确保除去所有的乙醇。然后用润湿的药棉签机械去除固定在膜上侧的所有细胞。通过单独将插件浸入经过滤的harris苏木精(sigma,dorset,uk)中1min，将细胞染色。此后，插件用一烧杯自来水洗涤以去除染料，将其浸入0.5%经过滤的曙红(sigma,dorset,uk)中2min。然后经染色的插件用自来水再次洗涤。将glycerolgelatin(sigma,dorset,uk)在一烧杯沸水中加热，将其再次液化，将1滴置于有适当标记的显微镜载玻片(r.a.lamb,loughborough,uk)上。从插件上切下膜，用镊子将其转移至相应的载玻片上。在膜顶部加入glycerolgelatin，在坚实的压力将盖玻片置于载玻片上。让经固定的载玻片风干，然后进行分析。蛋白质分析从细胞提取蛋白质从细胞提取蛋白质以便通过elisa测定进行分析。去除组织培养瓶中的培养基，细胞用冰冷的pbs(sigma,dorset,uk)冲洗。向培养瓶中加入适当体积的pbs(对于t25为5ml,对于t80为10ml)，用细胞刮棒(nunc,leics,uk)取出细胞。将细胞悬液转移至15ml管中，于室温下以11000rpm离心5min。所得沉淀立即用于蛋白质提取，或贮存于-20℃待用。用非变性裂解缓冲液(表1)制备非变性蛋白质提取物，用于分析蛋白质-蛋白质相互作用。表1.用于全细胞蛋白质提取的缓冲液组成将完全小蛋白酶抑制剂片(completeminiproteaseinhibitortablets,roche,welwyngardencity,uk)、10mm氟化钠(flukabiochemika)、1mm焦磷酸钠和1mm原矾酸钠(sigma,dorset,uk)加入缓冲液中待用。将细胞沉淀重悬于适当体积的非变性缓冲液(50-200μl)中，在冰上孵育5min。将细胞悬液转移至微量离心管中，冰上超声处理(3x5s)，4℃下以10000rpm离心10min。所得的上清液立即使用或贮存于-20℃待用。elisa测定在我们的案例中，用elisa测定，分别采用间接elisa或夹心elisa，探测单独的flag-bcl-3蛋白的量或者探测与p50复合的flag-bcl-3的量。对于间接elisa测定和夹心elisa测定而言，非变性细胞裂解液(如上所述)用添加0.5%v/vtween(sigma,dorset,uk)的tbs/t[tris缓冲液盐溶液(tbs,calbiochem,merck)]稀释至0.5-1μg/μl浓度，将100μl加至抗flag包被平底elisa板(sigma,dorset,uk)上。一式三份加入样品，用tbs/t作为阴性对照。将板于37℃下孵育1小时，然后用3x200μltbs/t洗涤。第一抗体为bcl-3(santacruzbiotech)(对于间接elisa而言)和p50(abcam)(对于夹心elisa而言)中的任一种，将其以已知体积(125μl)和浓度加入各孔，加盖避光于室温孵育1小时。再用200μltbs/t洗涤3次，然后与碱性磷酸酶(ap)缀合的第二抗体一起孵育。同时，按照生产商的指示制备磷酸对硝基苯酯溶液(pnpp,santacruzbiotechnology,california,usa)(5mgpnpp二钠盐溶于5mlpnpp底物缓冲液)。将溶液充分混合，加盖避光待用。pnpp为选择用于碱性磷酸酶的底物，产生黄色的可溶性终产物。因此，可以测量颜色变化，其代表ap存在量。与第二抗体孵育后，各孔用3x200μltbs/t洗涤，加入pnpp溶液(50μl/孔)，于室温加盖避光孵育1小时。加入3nnaoh(20μl/孔)终止反应，使用读板器测量405nm的比色变化。统计学分析用student氏t检验来确定正常分布数据组之间以及样本大小为n=3的数据组之间的统计学差异。该检验用excel2008软件实施。实施例4-实施例化合物1a的表征我们确定了化合物1a在最常用溶剂中溶解度非常低(表2)，这表示存在生物学评估的问题。因此，合成了化合物1a的盐酸盐，分析溶解度。所得的盐在水和甲醇中的溶解度得到了改进(表2)，然而它不溶(<0.1g/100ml)于磷酸缓冲盐溶液(pbs)。pbs是含有氯化钠、磷酸钠、氯化钾和磷酸钾的水基盐溶液，而缓冲液的磷酸盐基团帮助维持恒定的ph。pbs是无毒的，通常用作基于细胞的测定和动物研究的等渗缓冲溶液。表2–前导化合物在有机溶剂中的溶解度实施例5–化合物1a的体外细胞毒性用人乳腺癌细胞系评价化合物1a的体外毒性。为了比较在肿瘤生成性乳腺癌细胞和非肿瘤生成性乳腺癌细胞中的毒性，我们选择mcf-10a作为非肿瘤生成性人乳腺癌细胞系，选择mda-mb-231和skbr3作为肿瘤生成性人乳腺癌细胞系的细胞模型。mcf-10细胞来源于健康状况良好的36岁女性的乳腺组织，无限增殖化mcf-10a细胞系可以在培养物中生长，具有稳定的近二倍体核型以及经过培养物适应的乳腺上皮细胞典型的适度基因修饰，包括p16基因座的丧失。所述细胞表达正常的p53，它们不在无免疫应答小鼠中生长。将化合物1a溶于dmso中，用培养基稀释成最高浓度1mm(10-3m)。用细胞滴定度蓝色生存力测定评估一系列摩尔浓度24小时的细胞毒性。将化合物1a对细胞生存力的影响均相对于dmso对照归一化，用graphpad软件生成剂量反应曲线(图1)。无法确定在任何细胞系中的ic50值，这是因为即便是最高浓度也未导致细胞生存力降低50%。然而，我们可以观测到非肿瘤生成性细胞系和肿瘤生成性细胞系之间在细胞毒性方面有差异。在最高浓度1mm下，相比于dmso对照(100%)，mcf-10a细胞系的生存力为96%，mda-mb-231的生存力为72%，skbr3的生存力为57%。这种低毒性预示为bcl-3的特异性抑制剂，因为先前的研究已经表明：对bcl-3的基因抑制对癌细胞体外细胞生存力仅有温缓的影响，对非肿瘤生成系影响很小或没有影响(11)。用graphpad软件计算ic50，通过外推剂量反应曲线，得出mcf-10a的ic50值为14.9mm，mda-mb-231ic50值为2.70mm，对skbr3为1.37mm。实施例6–确立化合物1a的体外生物学作用a.通过间接夹心elisa确立对蛋白结合的影响过表达bcl-3的hek-293细胞与一系列摩尔浓度的化合物1a一起孵育24小时，然后在非变性条件下获得细胞裂解液。用graphpad软件生成剂量反应曲线(图2a)。测定的ic50为385.5nm。间接elisa测定用bcl-3抗体进行，显示出用化合物1a(图2b)和对照(图2c)处理的样品的负载相同。b.确立对细胞内nf-κb活性的影响化合物1a对nf-κb活性的影响通过过表达bcl-3的mda-mb-231和hek-293细胞中的nf-κb荧光素酶测定和过表达p52的hek-293细胞中的nf-κb荧光素酶测定来测定。将细胞与一系列摩尔浓度的化合物1a一起孵育24小时，然后用nf-κb荧光素酶报告质粒转染48小时，分析nf-κb活性。用graphpad软件生成剂量反应曲线(图3)。在mda-mb-231细胞中测定的ic50为49.43nm，hek-293细胞中测定的ic50为159.6nm，hek-293p52过表达细胞中测定的ic50为210.6nm。c.确立化合物1a对细胞迁移的影响先前业已确定：化合物1a在10μm下显著抑制mda-mb-231细胞的迁移能力。因此，我们制作了剂量反应曲线，以确定该测定的ic50。将过表达bcl-3的mda-mb-231细胞与一系列摩尔浓度的化合物1a和dmso对照一起孵育24小时，然后接种到boyden迁移室上。通过细胞计数，监测到各样品间该测定期间存在的活细胞数量恒定。用graphpad软件生成剂量反应曲线(图4)。测定的ic50为310.4nm。实施例7–来自系列1-3的类似物的生物学评估a.细胞毒性将所选化合物溶于dmso中，稀释至最高浓度为10μm(0.1%dmso)。在所有测定中，总是使用dmso对照。在用于基于细胞的测定之前，测试所选化合物在hek-293和mda-mb-231细胞中的细胞毒性。用细胞滴定度蓝色生存力测定评估一系列摩尔浓度24小时的细胞毒性。单取代化合物1a、1c、1e、1f、1g、1i、1j、2a、2b、2c、2d、2f、3a、3b和3d的结果示于图5。化合物在两个细胞系中被很好地耐受，甚至10μm浓度下细胞生存力也高于70%。二取代和三取代化合物1l、1m、1n、1o、1p和1q的结果示于图11a和b。化合物在两个细胞系中被很好地耐受甚至10μm浓度下细胞生存力也高于90%。b.nf-κb测定所选类似物对nf-κb活性的影响通过mda-mb-231细胞中的nf-kb荧光素酶测定来测定。将mda-mb-231bcl-3过表达细胞与1μm浓度的来自系列1-3的化合物一起孵育24小时，然后用nf-κb荧光素酶报告质粒以及对照转染48小时，分析nf-κb活性。单取代化合物1a、1c、1e、1f、1g、1i、1j、2a、2b、2c、2d、2f、3a、3b和3d的结果示于图6)。可以看出：来自系列1的单取代类似物的nf-κb活性与化合物1a的活性相当，观察到与dmso对照相比，化合物1a和类似物1f显著降低nf-kb活性。与bcl-3wtdmso对照相比，系列2类似物2a和2d显著降低nf-κb活性。类似物2a显示出与化合物1a相当的活性，其他类似物的活性较低。系列3类似物3a对nf-κb活性的影响与化合物1a相当。与dmso对照相比，类似物3c也显示出显著降低nf-κb活性，然而未达到化合物1a的水平。基于该系列类似物的结果，我们已经确定了一系列摩尔浓度的来自系列1(1f)、系列2(2a和2c)和系列3(3a)的所选类似物的剂量反应曲线。将mda-mb-231bcl-3wt细胞与一系列摩尔浓度的来自系列1-3的所选化合物一起孵育24小时，然后用nf-κb荧光素酶报告质粒连同对照一起转染48小时，分析nf-κb活性(图7)。我们观察到类似物1f的ic50测定值提高(6.97nm)。与化合物1a相比，其他类似物显示出抑制nf-κb活性的能力降低。类似物2a的ic50测定值为2.50μm，类似物2c的ic50测定值为2.49μm，类似物3a的ic50测定值为1.07μm(参看表3)。二取代和三取代化合物1l、1m、1n、1o、1p和1q的结果示于图11c(与化合物1a相对比)和图12以及示于表3。与bcl-3wt过表达mda-mb-231细胞相比，化合物1a显示出最有效地抑制nf-κb活性(图11c)。确定了三种所选类似物的(1o-q)的ic50值。所测试的所有三种类似物皆显示出对nf-κb活性的抑制能力低于化合物1a。类似物1o的ic50测定值为237.80nm，类似物1p的ic50测定值为705.90nm，类似物1q的ic50测定值为988.87nm(图12；表3)。表3–测试化合物ic50值的比较c.间接夹心elisa测定通过间接夹心elisa测定，测定所选类似物(1f、2a、2c、3a)破坏bcl-3-p50结合的能力。将hek-293bcl-3wt细胞与一系列摩尔浓度的所选化合物一起孵育24小时，然后在非变性条件下获得细胞裂解液。用graphpad软件生成所选类似物的剂量反应曲线(图8a-d)。我们观察到类似物1f和3a的ic50相比于化合物1a提高，ic50值分别为60.17nm和119.3nm。无法确立系列2类似物2a和2c的ic50，用graphpad软件由剂量反应曲线计算所述ic50，类似物2a的ic50为15.23μm，类似物2c的ic50为10.41μm。用bcl-3抗体进行了间接elisa测定，显示出用化合物1f、2a、2c和3a处理的样品的负载相同(图8e-h)。d.细胞迁移测定如实施例6所示，化合物1a引起细胞迁移显著降低，ic50值为310.4nm。因此，我们希望确定所设计的类似物是否具有相似或改进的抑制细胞迁移的能力。将mb-231bcl-3过表达细胞与一系列摩尔浓度的所选类似物(1f、2a、2c、3a)和dmso一起孵育24小时，然后接种到boyden迁移室上。24小时后，对迁移的细胞进行显示和计数。用graphpad软件生成剂量反应曲线(图9)。通过细胞计数，监测到各样品间在该测定期间存在的活细胞数量恒定。与得自nf-κb测定和间接夹心elisa测定的结果相一致，类似物1f显示出提高的抑制细胞迁移的能力，ic50值为28.93nm。有趣的是，即使在10nm下，细胞迁移也被抑制至低于50%。其他类似物显示出抑制细胞迁移的能力低于化合物1a。类似物2a的ic50测定值为1.33μm，类似物2c的ic50测定值为3.65μm，类似物3a的ic50测定值为900nm。f.确立类似物1f的ec50类似物1f的活性高于化合物1a；因此接下来我们测定了该类似物在mda-mb-231细胞系中的毒性。将化合物1a溶于dmso中，用培养基稀释至最高浓度为2mm。用细胞滴定度蓝色生存力测定评估一系列摩尔浓度下24小时的细胞毒性。总将化合物1a对细胞生存力的影响针对dmao对照归一化，用graphpad软件生成剂量反应曲线(图10)。类似物1f的ec50测定值为781.3μm。概述我们已经合成了2-[(2-氟苯甲酰基)氨基]-n-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺(化合物1a)和该化合物的多种新类似物，我们已经表明：这些化合物为bcl3的抑制剂，因为它们能够抑制bcl3-nfkb蛋白质相互作用并且抑制nf-κb信号转导。这表明：所述化合物可用于治疗癌症，特别是转移性癌症。参考文献1.biswas,d.k.和iglehart,j.d.2006.linkagebetweenegfrfamilyreceptorsandnuclearfactorkappab(nf-κb)signalinginbreastcancer(乳腺癌中egfr家族受体与核因子κb(nf-κb)信号转导之间的关联).journalofcellularphysiology,209,645-652。2.kim,h.,hawke,n.和baldwin,a.2006.nf-кbandikkastherapeutictargetsincancer(作为癌症治疗靶标的nf-кb和ikk).celldeathdiff.,13,738-747。3.au,w.y.,horsman,d.e.,ohno,h.,klasa,r.j.和gascoyne,r.d.2002.bcl-3/ightranslocation(14;19)(q32;q13)innon-hodgkin'slymphomas(非霍奇金淋巴瘤中的bcl-3/igh易位(14;19)(q32;q13)).leukemia&lymphoma,43,813-816。4.nishikori,m.,maesako,y.,ueda,c.,kurata,m.,uchiyama,t.和ohno,h.2003.high-levelexpressionofbcl3differentiatest(2;5)(p23;q35)-positiveanaplasticlargecelllymphomafromhodgkindisease(bcl3的高水平表达使来自霍奇金病的t(2;5)(p23;q35)-阳性恶性大细胞淋巴瘤分化).blood,101,2789-2796。5.cogswell,p.c.,guttridge,d.c.,funkhouser,w.k.和baldwin,a.s.2000.selectiveactivationofnf-κbsubunitsinhumanbreastcancer:potentialrolesfornf-κb2/p52andforbcl-3(人乳腺癌中nf-κb亚单位的选择性活化：nf-κb2/p52和bcl-3的潜在作用).oncogene,19,1123-1131。6.thornburg,n.j.,pathmanathan,r.和raab-traub,n.2003.activationofnuclearfactor-κbp50homodimer/bcl-3complexesinnasopharyngealcarcinoma(鼻咽癌中核因子κbp50同二聚体/bcl-3复合物的活化).cancerres.,63,8293-8301。7.o'neil,b.,buzkova,p.,farrah,h.,kashatus,d.,sanoff,h.,goldberg,r.,baldwin,a.和funkhouser,w.2007.expressionofnuclearfactor-kappabfamilyproteinsinhepatocellularcarcinomas(肝细胞癌中核因子κb家族蛋白的表达).oncology,72,97-104。8.puvvada,s.d.,funkhouser,w.k.,greene,k.,deal,a.,chu,h.,baldwin,a.s.,tepper,j.e.和o’neil,b.h.2010.nf-кbandbcl-3activationareprognosticinmetastaticcolorectalcancer(nf-кb和bcl-3活化在转移性直肠结肠癌中具有预测性).clin.transl.res.,78,181-188。9.cogswell,p.c.,guttridge,d.c.,funkhouser,w.k.和baldwin,a.s.2000.selectiveactivationofnf-κbsubunitsinhumanbreastcancer:potentialrolesfornf-κb2/p52andforbcl-3(人乳腺癌中nf-κb亚单位的选择性活化：nf-κb2/p52和bcl-3的潜在作用).oncogene,19,1123-1131。10.pratt,m.a.c.,bishop,t.e.,white,d.,yasvinski,g.,ménard,m.m.,niu,m.y.和clarke,r.2003.estrogenwithdrawal-inducednf-κbactivityandbcl-3expressioninbreastcancercells:rolesingrowthandhormoneindependence(乳腺癌细胞中雌激素突然降低诱导的nf-κb活性和bcl-3表达：在生长和激素依赖性方面的作用).mol.cell.biol.,23,6887-6900。11.wakefielda,soukupovaj,montagnea,rangerj,frenchr,mullerw和clarksonr(2012)bcl3selectivelypromotesmetastasisoferbb2-drivenmammarytumours(bcl3选择性地促进erbb2-驱动的乳腺肿瘤转移)cancerresearch(电子出版物)10.1158/0008-5472.can-12-1321。当前第1页12当前第1页12