抗PPO抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法及试剂盒。

背景技术：

原卟啉原氧化酶(简称ppo)，是植物光合作用的关键酶。ppo抑制剂类除草剂是以ppo酶为靶标的除草剂。该类除草剂喷施到杂草后，阻碍了原卟啉原ix在质体和线粒体中叶绿素的合成，从而导致原卟啉原ix的大量积累，积累的大量原卟啉原ix从质体和线粒体内泄露到细胞质中，转化为原卟啉ix，破坏叶绿素的合成，影响光合作用，使杂草枯萎直至死亡。在我国，广泛用于大豆田杂草防除的ppo抑制剂类除草剂主要有：乳氟禾草灵、三氟羧草醚、乙氧氟草醚、乙羧氟草醚、苯草醚等。

近几年来，黑龙江、内蒙古部分地区的农民反映氟磺胺草醚等ppo抑制剂类除草剂对大豆田反枝苋防治效果不明显，田间剂量已无法有效将其杀死，并且发现有些反枝苋种群对乳氟禾草灵等ppo抑制剂类除草剂也产生了交互抗性。由于对抗药性杂草认知不足，农民盲目加大药剂使用量，既增加用药成本，又加大药害风险，并且会导致更多抗性杂草的出现与发展，严重影响我国当前农药减量使用，影响粮食增产，农民增收和国家粮食安全。因此，开发一种快速、简便易操作的抗药性杂草检测方法十分迫切。

传统的抗药性杂草检测方法通常到田间采集疑似抗性杂草的种子，催芽后播种在培养盆中，培养一定叶龄后喷施系列剂量的除草剂，继续培养一段时间，剪取地上部分称鲜重或烘干称干重计算抑制中浓度和抗药性指数。此方法直观性强，能客观评价杂草抗性水平。但也有局限性，主要表现在：一是需建立植物培养室，并且培养杂草和检测周期长；二是不能从微观分子角度解释其抗性机制，不能指导科学用药来防止抗药性种群的发展。随着分子生物学技术在杂草抗药性机制方面的应用与发展，越来越多的抗药性杂草被发现，抗药性机制被明确。目前反枝苋的抗ppo抑制剂类除草剂的抗性机制还未见报道。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法及试剂盒。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：本发明通过结合软件设计和大量的人工优化设计筛选，获得1对具有较高扩增效率和特异性的引物对，对不同农田采集的对ppo抑制剂具有不同抗性的反枝苋进行pcr扩增和扩增产物的测序分析，通过对抗性反枝苋和敏感反枝苋的ppx2基因序列进行比对分析，发现反枝苋中导致ppo抑制剂类除草剂抗性的ppx2基因突变位点。

本发明首先提供与反枝苋ppo抑制剂类除草剂抗药性相关的特异性dna片段，所述特异性dna片段包括核苷酸序列如seqidno.1所示的dna片段编码氨基酸的第128位的精氨酸突变为甘氨酸。

反枝苋的ppx2编码基因序列含有如seqidno.1所示的序列，上述核苷酸序列的突变位点对应反枝苋的ppx2的氨基酸序列(如seqidno.2所示)第128位精氨酸突变为甘氨酸。

本发明进一步提供用于检测抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋的特异性引物对，其核苷酸序列如seqidno.3～4所示。

在此基础上，本发明提供包含所述用于检测抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋的特异性引物对的试剂盒。

为更好地满足检测需要，作为优选，所述试剂盒还包括pcr反应缓冲液、dntps、标准阳性模板、mg²⁺、dna聚合酶中的一种或多种。

进一步地，本发明提供所述特异性引物对或所述试剂盒在检测抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋或指导农田除草用药中的应用。

本发明还提供一种抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法，以待测反枝苋样品的基因组dna为模板，利用所述特异性引物对或包含所述特异性引物对的试剂盒进行pcr扩增，分析扩增产物的序列。

作为优选，所述pcr扩增的反应条件为：94～98℃预变性2～5min，94～98℃变性10～30s，55～60℃退火10～30s，72℃延伸10～60s，循环25～40次，72℃延伸2～10min。

为获得更优的扩增效率和特异性扩增效果，通过优化反应条件得到所述pcr扩增的反应条件为：95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸5min。

为提高扩增效率和特异性，经优化得到：所述pcr扩增的50μl反应体系如下：10×pcr反应缓冲液5μl，2.5mmdntps2μl，上下游引物各1μl，taqdna聚合酶1u，模板dna2μl，双蒸水补至50μl。

上述分析扩增产物的序列为采用测序分析，所述抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋的判断标准如下：若所述待测反枝苋样品的ppo的第128位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸，则所述待测反枝苋为抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋。

本发明的有益效果在于：(1)本发明发现了与反枝苋抗ppo抑制剂类除草剂抗性相关的突变位点，针对相应突变位点精心设计的特异性引物对具有较高的扩增效率和特异性，能够高效特异灵敏地扩增反枝苋是否存在ppo抑制剂类除草剂抗性；(2)本发明提供的抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法具有操作简便，速度快、成本低、准确度高的优势。

附图说明

图1为针对能够涵盖突变位点的目的片段设计了4对引物的扩增效果图。m为dnamarkerdl2000；第1泳道为本发明引物ppx2-1f/1r扩增条带；2-4泳道分别为引物ppx2-2f/2r，ppx2-3f/3r和ppx2-4f/4r扩增效果。

图2为pcr扩增不同反枝苋种群ppx2基因结果；m为dnamarkerdl2000；1-12为不同反枝苋种群ppx2基因pcr扩增条带。

图3的s图为敏感反枝苋种群ppx2第128位测序结果(agg编码精氨酸)；图3的r图为抗性反枝苋种群ppx2第128位测序结果(ggg编码甘氨酸)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法的建立

1、发明人从我国不同地区收集了大量对ppo抑制剂类除草剂产生抗性反枝苋样品，共450份，以及对ppo抑制剂类除草剂敏感的反枝苋样品共100份，进行生物信息学分析，发现对ppo抑制剂类除草剂敏感的反枝苋(简称敏感反枝苋)和对ppo抑制剂类除草剂有抗性的反枝苋(简称抗性反枝苋)在seqidno.2所述的氨基酸序列在两个位点存在差异，426份抗性反枝苋在seqidno.2所述的氨基酸序列的第128位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸。并且敏感反枝苋中，95份样品的seqidno.2所述的氨基酸序列的第128位氨基酸为精氨酸。

2、反枝苋基因组dna的提取

取反枝苋叶片100mg，液氮充分研磨，ctab法提取反枝苋基因组dna，dna浓度需大于2ng/μl。

3、引物设计与合成

根据genbank中登记的糙果苋ppx2基因序列(dq386113)，利用软件oligo7设计了1对特异性引物(目的片段为983bp)。特异性引物包括了前述发现的1个氨基酸突变位点。糙果苋有报道在ppx2基因序列的seqidno.2所示的第210位的甘氨酸缺失能使糙果苋产生对ppo抑制剂类除草剂的抗性，发明人参考本发明发现的抗性反枝苋的突变位点(第128位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸)和糙果苋的上述抗性反枝苋的突变位点，进行引物设计，由于扩增长度需涵盖这2个位点，在引物设计过程中，发明人做了大量的探索，设计了多对引物序列，比较结果后，最终选取引物对ppx2-1f/1r作为本发明确定的用于检测抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋的特异性引物对。引物筛选实验见图1，泳道1为本发明引物对ppx2-1f/1r的扩增产物，泳道2，3，4分别为针对突变序列设计的其他引物对的扩增产物。电泳检测验证结果显示泳道1的引物扩增结果特异性强，扩增效率高。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。用于检测反枝苋ppx2基因突变位点的特异性引物序列如下：

引物1序列ppx2-1f：5，-ctttcaccaaaacttgcattgccat-3，(seqidno.3)和ppx2-1r：5，-cgaattggagcagtgacaaccaca-3，(seqidno.4)；

引物筛选实验所用的其他三对引物序列如下：

ppx2-2f：5，-aaactctttcccaaaatgtcgctca-3，(seqidno.5)

ppx2-2r：5，-cgggaagaacccagtaagtcgaa-3，(seqidno.6)

ppx2-3f：5，-ggggtaccatggtaattcaatccattac-3，(seqidno.7)

ppx2-3r：5，-gctctagattatgcggtcttctcattc-3，(seqidno.8)

ppx2-4f：5，-tccattacccacctttcacc-3，(seqidno.9)

ppx2-4r：5，-ttacgcggtcttctcatccat-3，(seqidno.10)

4、用于检测反枝苋ppx2基因突变位点的pcr反应体系

pcr反应体系，其中10×pcr反应缓冲液5μl，dntps(2.5mm)2μl，正反向引物各1μl，taqdna聚合酶1u，模板dna2μl，双蒸水补足至50μl。

5、用于扩增反枝苋ppx2基因的反应程序

pcr扩增反应条件为95℃预变性4min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸5min，4℃保存。

6、pcr反应灵敏度试验

将提取的反枝苋dna稀释为5ng/μl后，分别吸取0、0.5、1、1.5和2μl反枝苋dna作为模板，进行pcr反应，检测pcr反应的灵敏度，如图2所示，当模板为2μl时，pcr产物条带清晰。通过计算得出用于检测的反枝苋dna的量应不少于10ng。

7、pcr产物鉴定与测序

pcr扩增产物经1％的琼脂糖凝胶检测后送北京华大基因公司测序。抗性和敏感反枝苋种群ppx2基因测序后进行序列比对分析，寻找ppx2突变位点。

实施例2本发明检测方法的应用

采集疑似发生抗性反枝苋样品，约取200mg反枝苋叶片迅速加入液氮研磨，采用ctab法提取基因组dna，dna浓度需大于5ng/μl。试验方法参见实施例1。检测引物对扩增反枝苋ppx2基因的特异性显示此引物具有很好的特异性，引物ppx2-1f/1r扩增ppx2基因片段约为1000bp(图1)，利用此引物扩增抗性和敏感反枝苋ppx2基因，对pcr产物分别进行测序，通过比对找突变位点(图3)。

对黑龙江、内蒙古不同大豆田采集的疑似抗性的反枝苋样品12个，按照本发明的检测方法进行检测，结果显示，12个样品的ppx2均在128位由agg突变为ggg，导致由精氨酸突变为甘氨酸，但在210位未发现甘氨酸缺失(表1，图3)。

由此可见，本发明实施例1建立的检测方法可以快速、准确的检测田间疑似抗性的反枝苋ppx2突变位点和氨基酸突变种类，可以指导是否可以继续使用ppo抑制剂类除草剂来防除抗性反枝苋。

表1.pcr法检测不同反枝苋种群ppx2突变位点

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>抗ppo抑制剂类除草剂反枝苋的检测方法及试剂盒

<130>khp191110265.6

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>983

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctttcaccaaaacttgcattgccatcgccattgtcagtttccaccaagaactacccagta60

gctgtaatgggcaacatttctgagcgggaagaacccacttctgctaaaagggttgctgtt120

gttggtgctggagttagtggacttgctgcagcatataagctaaaatcccatggtttgaat180

gtgacattgtttgaagctgattcgagagctggaggcaaacttaaaactgttaaaaaagat240

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<210>2

<211>327

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

leuserprolysleualaleuproserproleuservalserthrlys

151015

asntyrprovalalavalmetglyasnilesergluarggluglupro

202530

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354045

alaalaalatyrlysleulysserhisglyleuasnvalthrleuphe

505560

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65707580

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100105110

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115120125

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130135140

seralalysserlysleuglnilemetleuglupropheleutrparg

145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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245250255

glyserpheserphehisglyglymetglnthrleuvalaspthrmet

260265270

cyslysglnleuglygluaspgluleulysleuglncysgluvalleu

275280285

serleusertyrasnglnlysglyileproserleuglyasntrpser

290295300

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305310315320

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325

<210>3

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<212>dna

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