西瓜种脐斑性状主效基因及检测该主效基因的分子标记和应用的制作方法

本发明涉及生物基因
技术领域：
，具体涉及西瓜种脐斑性状主效基因及检测该主效基因的分子标记和应用。
背景技术：
：西瓜(citrulluslanatus)是葫芦科葫芦属一年生植物，果肉鲜美、多汁，营养价值丰富，深受消费者喜爱，被誉为“瓜果之王”。在其栽培过程中，西瓜经过长期的自然选择和人工选择，形成诸多性状与品种。种脐斑是指西瓜种脐部位存在和种子表面不一致的颜色，这一性状可稳定遗传，品种之间差异明显，并且该性状在野生西瓜中不存在，因此种脐斑可成为西瓜种质资源、品种鉴定和遗传分类的主要依据。根据国内外文献查阅结果，未发现对种脐斑主效基因进行精细定位的相关研究。常规的遗传学研究效率不高，分子标记如indel、snp在高通量测序技术迅速发展的今天备受关注，其可广泛应用于园艺作物遗传图谱的构建、qtl分析、分子标记辅助选择育种等。dna分子标记和荧光定量pcr辅助验证，可为西瓜种脐斑基因精细定位和分子鉴定研究提供高效的技术手段。技术实现要素：本发明的目的在于开发与西瓜种脐斑性状相关的分子标记，以期快速、准确定位西瓜种脐斑性状相关基因，为西瓜种质资源鉴定和分子标记辅助育种提供新的技术方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供cla019481基因在鉴定西瓜种脐斑性状中的应用，所述cla019481基因为西瓜种脐斑性状主效基因，该主效基因位于西瓜基因组3号染色体上5704673～5707416bp处。本发明还提供了用于检测上述西瓜种脐斑性状主效基因的dcaps分子标记，所述分子标记的核苷酸序列为：ccgtcacgaaatgcatcatcg/aagtgacgaacttttatccgtgtagatttttggtatttccatcccttgcggagcgtcataattccaaaacggcaatgcaaaatcaggatccttaatcaaagaccccaatattctctcatgaaagtaaagataaaaacgatggaatgggaagaacagccacgagaaat，如seqidno:1所示，在核苷酸序列第21位处碱基由g突变为a，该突变位点位于西瓜基因组3号染色体5706652bp处。本发明还提供了上述的dcaps分子标记在西瓜种质资源种脐斑性状的鉴定和/或分子标记辅助育种中的应用。本发明还提供了上述的dcaps分子标记在西瓜种质资源种脐斑性状基因型纯度鉴定中的应用。本发明又提供了用于扩增上述的dcaps分子标记的引物对zshpr101，该引物对的核苷酸序列为：zshpr101-f：5’-ccgtcacgaaatgcatcatc-3’；zshpr101-r：5’-atttctcgtggctgttcttccc-3’。本发明又提供了用于鉴定西瓜种脐斑性状的试剂盒，该试剂盒包括上述的引物对和限制性内切酶taqi。本发明还提供了一种西瓜种脐斑性状基因型的鉴定方法，包括如下步骤：步骤1：西瓜dna提取：采用ctab法提取西瓜基因组dna。步骤2：pcr扩增和酶切：首先利用上述的引物对zshpr101对西瓜基因组dna进行扩增，得pcr扩增产物，然后利用限制性内切酶taqi对pcr扩增产物进行酶切，得酶切产物。步骤3：电泳图谱分析：对酶切产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，确定所属基因型。进一步地，步骤2中pcr反应体系为：100ng/μl西瓜基因组dna1μl、zshpr101-f(10μmol/l)1μl、zshpr101-r(10μmol/l)1μl、2×powertaqpcrmastermix12.5μl、ddh2o9.5μl；pcr反应程序：94℃5min；94℃20s、55℃1min、72℃30s，35个循环；72℃5min；酶切反应体系：pcr产物5μl，taqi限制性内切酶0.5μl，10×buffer1.5μl，ddh2o8μl；酶切反应程序：65℃恒温处理12小时。本发明的有益效果在于：1.本发明首次在西瓜基因组3号染色体定位了西瓜种脐斑性状的主效基因位点，并在西瓜bc1分离群体中进行应用，其基因型准确率为100％。2.本发明设计的dcaps分子标记变异稳定、成本低廉、检测方便。3.本发明为西瓜种脐斑性状主效基因定位提供方法，并为西瓜种质资源种脐斑性状鉴定和分子标记辅助育种研究提供新手段。附图说明图1bc1群体高密度的遗传连锁图谱。图2西瓜种脐斑性状的qtl定位结果图。图3引物对zshpr101在部分bc1群体中对西瓜基因组dna的扩增结果图，图中m表示marker。图4供试西瓜3个不同时期基因表达量柱形图，图中daf代表开花后的天数。具体实施方式根据附图和实施例来说明本发明具体实施方案，但以下实施方案仅为详细介绍本发明，而不以任何方式来限制本
发明内容。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的原料如无特别说明，均为市售常规原料；所涉及的检测方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1西瓜种脐斑性状基因位点的定位及分子标记的开发提取b176(bc1)群体父本、母本基因组测序信息，进行qtl初定位，设计开发qtl区域内indel与snp分子标记。具体步骤如下：(1)利用b132(母本)与b135(父本)为两亲本杂交获得f1代，f1与母本回交获得bc1群体。鉴定统计bc1群体种脐斑表型。所述b132无种脐斑，b135有种脐斑，f1有种脐斑。(2)利用全基因组简化测序技术和mstmap软件对西瓜bc1群体开发高密度分子标签，构建高密度遗传连锁图谱，如图1所示。(3)结合遗传图谱及bc1群体种脐斑性状统计结果，利用rqtl-im-binary方法进行qtl初定位，在3号染色体连锁群鉴定到一个西瓜种脐斑主效qtl，其lod峰值为3.87，解释了88.01％的表型变异，对应的物理位置为西瓜基因组3号染色体5366042～5784364bp。(4)利用母本与父本进行22×深度的高通量测序，两个亲本共检测到577866个snp位点和232762个indel位点。(5)结合两亲本深度重测序信息，在qtl初定位的物理位置区域内搜索≥5bp的indel和存在的snp多态性位点。设计分子标记引物分别在父本、母本、f1中进行多态性筛选。最终在qtl初定位的物理位置区域内搜索到一个snp突变位点，该位点在西瓜基因组3号染色体5706652bp处，碱基由g突变为a，该位点位于cla019481基因中。分析该snp位点，利用perl语言自编脚本提取该变异位点上下游各500bp的参考基因组序列，利用在线分析软件dcapsfinder2.0获得dcaps分子标记，该分子标记的序列如seqidno.1所示，片段大小为187bp，在该标记的21bp处存在一个g→a的snp突变，其可用于鉴定西瓜种脐斑性状。在具有种脐斑性状的西瓜中此snp位点为g，其傍邻的序列具有限制性内切酶taqi的酶切识别位点，在无西瓜种脐斑性状的西瓜样品中此snp位点为a，无法被限制性内切酶taqi识别，因此可以通过上述caps分子标记去鉴定西瓜种脐斑性状。当taqi可识别酶切位点时，具有种脐斑性状的西瓜的目标dna条带会被切成168bp和19bp大小的两个dna片段(电泳检测时只能看到168bp的条带，19bp条带因太短而较早从凝胶中跑出)，而无种脐斑性状的西瓜不会被限制性内切酶识别，而保持187bp大小的dna片段。当鉴定的育种材料的种脐斑性状不是纯合的时候，凝胶上会出现两条dna条带(187bp、168bp)，因此该标记还可用于鉴定育种材料的种脐斑性状的纯度。设计上述dcaps分子标记的引物对，命名为zshpr101，其核苷酸序列为：zshpr101-f：5’-ccgtcacgaaatgcatcatc-3’，如seqidno:2所示；zshpr101-r：5’-atttctcgtggctgttcttccc-3’，如seqidno:3所示。实施例2引物对zshpr101对西瓜bc1群体种脐斑性状的鉴定用实施例1的dcaps分子标记的引物对zshpr101对bc1群体进行分子标记分析。具体步骤如下：2.1采用ctab法提取bc1群体西瓜基因组dna(1)取1g新鲜的西瓜叶片放入研钵中，加入液氮充分碾磨成粉状，随即转入加有1ml65℃预热好的ctab抽取液的离心管中，上下颠倒使二者充分混匀，置于65℃恒温水浴60min，其间颠倒混合多次，以防止沉淀；(2)将样品从水浴锅取出后，8000rpm离心1min；(3)样品取上清液置于另一离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液(氯仿与异戊醇体积比为24：1)，轻轻颠倒使其充分混匀；(4)10000rpm离心5min，取上清液；(5)加入0.7倍体积的提前预冷30min的异丙醇，混匀后置于-20℃冷冻不超过30min，以析出dna；取出后10000rpm离心5min，留沉淀弃上清液；(6)用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，打开离心管盖子晾干；(7)加入200μl的蒸馏水溶解dna；用紫外分光光度计测定dna的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。2.2pcr反应体系和程序pcr反应体系：100ng/μl西瓜基因组dna1μl、zshpr101-f(10μmol/l)1μl、zshpr101-r(10μmol/l)1μl、2×powertaqpcrmastermix12.5μl、ddh2o9.5μl；pcr反应程序：94℃5min；94℃20s、55℃1min、72℃30s，35个循环；72℃5min。酶切反应体系：pcr产物5μl，taqi限制性内切酶0.5μl，10×buffer1.5μl，ddh2o8μl。酶切反应程序：65℃恒温处理12小时。2.3对酶切产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。(1)试剂配制：a.5×tbe：tris-base53.9g；edta3.72g；硼酸27.5g；用超纯水定容至1l。b.40％聚丙烯酰胺溶液：聚丙烯酰胺193.34g；甲叉双丙烯酰胺6.66g；用蒸馏水定容至500ml。c.8％聚丙烯酰胺凝胶：40％聚丙烯酰胺溶液10ml；5×tbe5ml；10％过硫酸铵(aps)200μl；四甲基乙二胺(temed)80μl；蒸馏水22ml。d.银染液：硝酸银1g；冰醋酸5ml；无水乙醇50ml；用去离子水定容至500ml。e.显影液：氢氧化钠15g；甲醛(37％)2.5ml；用去离子水定容至500ml。(2)凝胶板准备：凝胶玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子，凹形玻璃向内侧。在洗瓶内配制8％聚丙烯酰胺凝胶溶液，混匀后快速注入两板中间的缝隙内，并注意防止有气泡产生，注满后迅速插入有齿的梳子，梳子底部与胶面刚好接触为宜，等待溶液充分凝固。(3)电泳：将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1×tbe缓冲液。在酶切产物中加入0.2倍体积的6×dnaloadingbuffer，混匀后取0.8μl加入点样孔内，并点上maker标记，260v电泳35min。(4)染色和显影：电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，小心取下梳子，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15min，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶取出放入去离子水中清洗10s；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上观察并拍照保存。(5)带型判读：将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，观察bc1群体条带的位置，根据实施例1中的带型判读方法确定各个样品的基因型。部分bc1群体样品结果如图3所示。bc1群体基因型与表型完全一致，准确率为100％，统计结果如下表1(母本基因型为a，父本基因型记为b，杂合基因型为h)。结果表明dcaps分子标记可有效鉴定西瓜种脐斑这一性状，可确定3号染色体上cla019481基因为控制西瓜种脐斑性状的主效基因。表1bc1群体中的西瓜种脐斑性状的鉴定结果实施例3引物对zshpr101对西瓜自然群体种脐斑性状的鉴定根据实施例2的方法利用引物对zshpr101对西瓜自然群体种脐斑性状进行鉴定，母本基因型(无种脐斑)为a，父本基因型(有种脐斑)记为b，杂合基因型(有种脐斑)为h，统计结果如下表2。结果显示，利用zshpr101对自然群体鉴鉴定的基因型与表型一致率达到69％。表2自然群体中的西瓜种脐斑性状的鉴定结果实施例4荧光定量pcr验证基因表达选取4份西瓜材料，其中17qb47与17q140-18z无种脐斑，18cb83与18cb90有种脐斑，采用荧光定量pcr对上述4份材料在不同时期(开花后的第8天、18天、25天)的西瓜种脐斑主效基因cla019481进行验证。具体步骤如下：3.1rna的提取采用rnapreppure多糖多酚植物总rna提取试剂盒(tiangen)提取上述四份西瓜材料的rna。3.2反转录成cdna，反转录试剂盒为transcriptorfirststrandcdnasynthesiskit,(roche)，合成方法参照该试剂盒说明书。3.3引物设计提取西瓜种脐斑主效基因cla019481的cds序列并利用primer5软件设计引物，命名为zshpryg-2，其中以actin为内参。zshpryg-2-f为：5’-cgttaggaaagcggcacaatca-3’，如seqidno:4所示；zshpryg-2-r为：5’-tgggaagaacagccacgagaaa-3’，如seqidno:5所示。3.4荧光定量pcr检测基因表达变化(1)取各样品模板cdna3μl加入到42μlddh2o中稀释15倍。反应体系如下表3所示。表3荧光定量pcr反应体系试剂名称用量模板cdna(稀释15倍)1μlsybrgreen1mastermix5μlforwardprimer(10μm)0.5μlreverseprimer(10μm)0.5μlddh2o3μl(2)进行荧光定量pcr扩增，获得各个样品的ct，反应程序如下表4所示。表4荧光定量pcr反应程序(3)使用2-△△ct法对各个样品的ct进行计算，结果如图4所示，在开花后第8天、18天、25天这三个不同发育阶段内，无种脐斑的17q140-18z和17qb47基因表达量差异不显著；有种脐斑的18cb83和18cb90基因表达量逐渐增大，这是因为种子随发育时间的增长，才慢慢出现了种脐斑。上述内容反映了cla019481的表达量在不同时间阶段的有种脐斑的西瓜种子内有显著差异。以上结果说明dcaps分子标记可简单灵敏、有效鉴定西瓜种脐斑性状，西瓜基因组3号染色体cla019481为控制西瓜种脐斑性状的主效基因。上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属
技术领域：
的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。sequencelisting<110>中国农业科学院郑州果树研究所<120>西瓜种脐斑性状主效基因及检测该主效基因的分子标记和应用<130>无<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>187<212>dna<213>西瓜（citrulluslanatus）<220><221>variation<222>(21)..(21)<223>n=g或a<400>1ccgtcacgaaatgcatcatcnagtgacgaacttttatccgtgtagatttttggtatttcc60atcccttgcggagcgtcataattccaaaacggcaatgcaaaatcaggatccttaatcaaa120gaccccaatattctctcatgaaagtaaagataaaaacgatggaatgggaagaacagccac180gagaaat187<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ccgtcacgaaatgcatcatc20<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3atttctcgtggctgttcttccc22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgttaggaaagcggcacaatca22<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tgggaagaacagccacgagaaa22当前第1页12