一种用于检测乙型流感病毒的RPA引物、探针、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学检测
技术领域：
，具体涉及一种用于检测乙型流感病毒的rpa引物、探针、试剂盒及应用。
背景技术：
：流感主要是由流感病毒甲型(flua)和乙型(flub)引起的传染性呼吸道疾病，全球死亡人数高达65万。通常，流感需要在疾病发作后的48小时内进行抗病毒治疗，而流感病毒的快速诊断能够显著减少抗生素的滥用，并实施必要的感染控制措施。一般情况下，医生会基于病人的临床症状，实现流感病毒的诊断。然而，其他病毒或细菌也会引起流感样疾病。因此，基于临床症状的诊断易造成疾病的误诊。尽管病毒分离培养作为诊断流感病毒的黄金标准，但2-5天的周转时间限制了该方法在临床诊断和流行病学调查上的应用。快速流感诊断测试(ridt)最常用于诊断流感病毒的方法。ridt方法的具有特异性高，操作检测，tat时间短。但是，ridt的敏感性较低。因此，有效的准确区分感染甲型或乙型流感病毒对于抗病毒治疗具有重要意义。由于特异性高和敏感性好，分子诊断技术被广泛用于流感病毒的检测，特别是在临床实验室中。由于病毒rna在临床样品中是极微量的。因此，在许多分子诊断测定中，提取，扩增和分析通常是必不可少的，在分子检测过程中，探针的设计对于检测的特异性和灵敏度有重要作用。聚合酶链式反应即pcr技术为分子扩增的一种常用方法，但pcr技术对硬件设备要求很高，仪器通常比较昂贵，且扩增速度慢，因此现有重组酶聚合酶扩增(rpa)技术应运而生，rpa技术对硬件设备的要求低，是一种等温扩增技术，大大提高了反应速度。rpa技术的关键在于探针和引物的设计，但pcr扩增所用的探针和引物多半不适用rpa技术。技术实现要素：本发明旨在提供一种用于检测乙型流感病毒的rpa引物、探针、试剂盒及应用，此处的应用既包括了乙型流感病毒的rpa引物、探针用于检测乙型流感病毒的方法，也包括了其应用于同时检测乙型流感病毒和甲型流感病毒，还包括乙型流感病毒的rpa引物在pcr中的应用，提供了快速、特异性、灵敏地检测乙型流感病毒以及同时检测甲型和乙型流感病毒的方法。为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种用于检测乙型流感病毒rpa引物，所述rpa引物核酸序列为：上游引物：b-f：5’-tctgctggaattgaagggtttgagccatac-3’，下游引物：b-r：5’-tcaaacggaacttcccttctttctgagtgt-3’；一种用于检测乙型流感病毒rpa探针，所述rpa探针的核酸序列为seqidno.2：5’-gttcctcaaatagcaactgtccgaaatacaat-thf-ggaccgattaccctt-3’。一种用于同时检测乙型流感病毒和甲型流感病毒的多重rpa引物，包括乙型流感病毒rpa的引物和探针，还包括甲型流感病毒的rpa引物和探针。优选的，所述甲型流感病毒的rpa引物序列为：上游引物序列为：mf146：5’-ggctctcatggaatggctaaagacaagac-3’，下游引物序列为：mr425：5’-ttgtatatgaggcccatgcaactggcaagtg-3’，所述的甲型流感病毒的探针序列为：seqidno.1：5’-ttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttg-3’。含有用于检测乙型流感病毒rpa引物或探针或含有用于同时检测乙型流感病毒和甲型流感病毒的多重rpa引物和探针的试剂盒或检测试纸。一种检测乙型流感病毒的方法，包括以下步骤：(1)提取待测病毒的rna；(2)合成用于检测乙型流感病毒的探针，以提取待测样本的rna为模板，进行逆转录反应，合成cdna，而后采用乙型流感病毒rpa扩增体系扩增，rpa扩增采用用于检测乙型流感病毒的引物和探针；(3)分析上述扩增产物。一种同时检测甲型和乙型流感病毒的方法，包括以下步骤：(1)提取待测病毒的rna；(2)rpa扩增：合成用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的多重rpa引物和探针，以提取的待测样本的rna为模板，进行逆转录反应，而后采用甲型和乙型流感病毒双重rpa扩增体系扩增，双重rpa扩增采用用于检测甲型流感病毒的引物和探针以及用于检测乙型流感病毒的引物和探针，所述的甲型和乙型流感病毒探针的修饰物不同；(3)分析上述扩增产物。所述的甲型和乙型流感病毒的探针的3’端分别标记有间臂spacer(c3)，甲型流感病毒探针序列的32位置以及乙型流感病毒探针序列的33位置的胸腺嘧啶替换为四氢呋喃。优选的，同时检测甲型和乙型流感病毒的方法中步骤(3)分析方法采用核酸免疫侧流层析试纸进行检测分析。核酸免疫侧流层析方法不用采用过于复杂的仪器，且操作简便，结果直观。优选的，上述同时检测甲型和乙型流感病毒的方法，甲型和乙型流感病毒的rpa下游引物的5’端均标记有生物素，即biotin，用于检测甲型和乙型流感病毒的rpa探针的修饰物分别为荧光素fitc和地高辛dig，核酸免疫侧流层析试纸上的两条检测线上分别喷涂荧光素抗体anti-fitc和地高辛抗体anti-dig，核酸免疫侧流层析试纸上金标垫上喷涂有牛血清蛋白bsa，质控线上喷涂生物素化牛血清白蛋白，即b-bsa。优选的，上述同时检测甲型和乙型流感病毒的方法，anti-fitc的浓度为至少为12.5ng/strip，anti-dig的浓度至少为75ng/strip，biotin-bsa的浓度至少为50ng/strip；核酸侧流层析时间至少为5分钟；双重rpa扩增的温度为35-45℃；双重rpa扩增的时间至少为5分钟；双重rpa扩增的所用的引物浓度分别为：甲型流感病毒rpa上下游引物浓度各为：50-200nm，乙型流感病毒rpa上下游引物浓度各为：50-200nm。多重rpa体系参数和核酸侧流层析参数维持在该范围内均可达到检测的目的。优选的，上述同时检测甲型和乙型流感病毒的方法，其中anti-fitc的浓度为50ng/strip，anti-dig的浓度为250ng/strip，biotin-bsa的浓度为50ng/strip核酸侧流层析时间至少为20分钟；双重rpa扩增的温度为39℃；双重rpa扩增的时间为20分钟；双重rpa扩增的所用的引物浓度分别为：甲型流感病毒rpa上下游引物浓度各为：100nm，乙型流感病毒rpa上下游引物浓度各为：150nm。多重rpa体系参数和核酸侧流层析参数维持在该值可在较短时间内得到清晰的检测结果。优选的，本发明的用于检测乙型流感病毒的rpa下游引物b-r除了可作为rpa扩增的引物外，还可以作为pcr的下游引物。本发明的有益效果如下：本发明提供了一种用于检测乙型流感病毒rpa引物和探针，可应用该引物及探针对乙型流感病毒的逆转录cdna进行快速rpa扩增，同时，还可将该发明发现的探针和引物组合应用于试剂盒或者检测试纸上用于快捷方便的检乙型流感病毒。本发明还提供了用该引物及探针单独检测乙型流感病毒的方法及同时检测甲型和乙型流感病毒的方法，该发明的方法检测的灵敏度很高，特异性强，耗时短，且因是采用的rpa扩增和核酸侧流层析技术，不需要像pcr一般频繁得升温，因此不需要特殊的设备，操作也较为简便。附图说明图1rpa扩增原理图及核酸侧流层析试纸检测图图2抗体浓度对核酸免疫侧流层析结果的影响实验结果图图3层析时间对核酸免疫侧流层析结果的影响实验结果图图4同时检测乙型流感病毒和甲型流感病毒体系优化实验结果图图5检测特异性实验结果图图6检测灵敏性实验结果图具体实施方式根据genebank数据库中已发表的乙型流感病毒的非结构蛋白(flubns)基因，利用软件dnaman进行序列比对，设计引物与探针如下：其中，b-f为上游引物，b-r为下游引物，seqidno.2为探针。乙型流感病毒的rpa探针的标记可以为荧光基团或药物或光敏剂或医学造影剂。在本实施例中，选取地高辛(dig)为其修饰物。本实施例中所用乙型流感病毒的rpa探针的5’端和3’端分别标记地高辛(dig)和间臂spacer(c3)，序列33位置胸腺嘧啶替换为四氢呋喃，即为：dig-gttcctcaaatagcaactgtccgaaatacaat-thf-ggaccgattaccctt-spacer(c3)。本实施例中所用乙型流感病毒的rpa下游引物b-r标记有生物素，即为biotin-tcaaacggaacttcccttctttctgagtgt-3’。从而使得扩增后的产物带有双标记。本实施例中所用的甲型流感病毒的rpa探针的5’端和3’端分别标记荧光素(fitc)和间臂spacer(c3)，序列32位置胸腺嘧啶替换为四氢呋喃，即为fitc-ttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggac-thf-gcagcgtagacgctttg-spacer(c3)。本实施例中所用甲型流感病毒的rpa下游引物mf425标记有生物素，即为biotin-ttgtatatgaggcccatgcaactggcaagtg-3’。该乙型流感病毒的rpa下游引物b-r除了可作为rpa扩增的引物外，还可以作为pcr的下游引物。可以将本发明乙型流感病毒的rpa探针和引物用于试剂盒或检测试纸，用来快速检测乙型流感病毒。当然，也可以将其他病毒的rpa探针和引物与本发明的乙型流感病毒的探针和引物组合，例如甲型流感病毒的rpa探针和引物，用来区分其他病毒与乙型流感病毒。同时检测乙型流感病毒和甲型流感病毒的方法用本发明的乙型流感病毒的rpa探针和引物来检测乙型流感病毒和甲型流感病毒的方法，包括以下步骤：1、制备核酸侧流层析垫；2、提取病毒rna；3、对rna逆转录后进行rpa扩增，rpa扩增探针和引物为上述乙型流感病毒探针及甲型流感病毒探针；4、取扩增产物，加入缓冲液，滴加于核酸免疫侧流层析试纸，肉眼观察结果。本实施例使用的所有溶剂及试剂均为市售成品，引物及探针为上海生工生物技术有限公司(上海)合成；病毒rna提取试剂盒购自天根生化科技有限公司(北京)；twistampnfokit购自twistdx公司(英国)；rpa干粉购自twistdx公司(英国)；pcr扩增试剂、逆转录酶amvreversetranscriptasexl和rnase抑制剂购自大连宝生物公司。准备侧流层析试纸的步骤：(1)核酸侧流层析试纸的制备与组装用于双链dna检测的核酸免疫侧流层析免疫试纸，按顺序在塑料背衬上粘贴样品垫、胶体金复合物垫、醋酸纤维素膜和吸水纸，各部分相互重叠2mm。利用柠檬酸钠还原氯金酸制备40nm的胶体金颗粒，并对胶体金颗粒进行链霉亲和素修饰，具体步骤如下：①在洁净的玻璃三角烧瓶中依次加入99ml超纯水和1ml氯金酸(1％)，加热至沸腾后，加入1ml柠檬酸三钠(1％)，持续搅拌，溶液变成红色，并保持不变，继续加热搅拌15min，冷却至室温，备用；②取1ml胶体金，加入1μl200mm硼酸钠溶液，调节ph至9.5；③取5μl链霉亲核素(1mg/ml)，加入495μl硼酸钠溶液(2mm)中，混合均匀；④将稀释后的链霉亲核素溶液，逐滴加入胶体金溶液中，混匀，全部加入后，将其置于垂直旋转混匀仪上，混匀2h；⑤取80μl浓度为20％的牛血清白蛋白溶液(溶解于2mm的硼酸钠溶液中)加入到上述胶体金溶液中，继续混匀30min；⑥将上述溶液2000rpm离心10min，转移上清液至新的离心管中，12000rpm离心10min，去掉上清液，加入200μl重悬液(15mmtrisph9.5、内含蔗糖2％-5％，peg20000.5％-2％，bsa0.5％、tween-200.05％)，震荡混匀，将其喷涂于金标垫上，室温过夜干燥。⑦将荧光素抗体(anti-fitc)、地高辛抗体(anti-dig)和生物素化bsa(b-bsa)，利用抗体稀释液(100mm碳酸氢钠、5％甲醇、2％蔗糖)稀释，而后2μl/cm的速度喷涂于醋酸纤维素膜上，37℃干燥1h。附图1中a图为双重rpa扩增示意图，flua为甲型流感病毒；flub为乙型流感病毒；通过设计合成的引物和探针，对两者的逆转录核酸序列进行扩增。b图为核酸免疫侧流层析的示意图，样品滴加在样品垫上，依次流经金标垫、两条检测线和质控线。图中fitc为荧光素标记，dig为地高辛标记，nfo为endonucleaseiv内切酶，biotin为生物素标记，thf为四氢呋喃取代，sa-au为链霉亲和素金，biotin-bsa为生物素化牛血清白蛋白，anti-dig为地高辛抗体，anti-fitc为荧光素抗体。扩增产物所带有的生物素标记与金标垫上的链霉亲和素金结合后继续向前流动，流经检测线时，扩增产物结合物所带半抗原标记与检测线上的抗体结合显现，最终流经质控线时，扩增产物结合物与质控线上的b-bsa结合显现。核酸侧流层析试纸抗体浓度及层析时间优化实验对本核酸侧流层析试纸进行性能分析，选取最佳层析时间及喷涂的抗体浓度。优化方法为合成分别带有半抗原(fitc或dig)和生物素标记的双链dna，稀释成不同浓度后用该试纸对其进行测试，不同试纸抗体浓度如下表：表1不同的试纸抗体浓度表试纸序号b-bsa(ng/strip)anti-dig(ng/strip)anti-fitc(ng/strip)1507512.5210015025320025050实验分为三组：阴性对照组(negativecontrol)：仅带有生物素标记的双链dna；dig检测组(dig-labeleddna)：带有生物素标记以及半抗原dig的双链dna；fitc检测组(fitc-labeleddna)：带有生物素标记以及半抗原fitc的双链dna；将三组dna分别滴在三份层析检测试纸上，观察结果，实验结果如图2，从左到右依次为阴性对照组、dig检测组合fitc检测组，试纸左侧为试纸上所涂抗体的名称，右侧数字为抗体或生物素化牛血清白蛋白的浓度。研究结果表明，在上述三组抗体浓度内都可以达到检测目的，但最佳抗体标记浓度分别为b-bsa：50ng/strip，anti-dig：250ng/strip，anti-fitc：50ng/strip。为了达到更好的检测结果，本发明还对核酸侧流层析的时间进行了优化。具体核酸侧流层析时间优化实验实施方式为：合成分别带有半抗原(fitc或dig)和生物素标记的双链dna，同样分为三组实验：阴性对照组、dig检测组和fitc检测组，将三组dna分别滴在三份侧流层析检测试纸上，记录每一组层析实验在5分钟、20分钟、35分钟时候的层析结果，结果如图3。从结果可以看出，在5分钟时候，已经可以判断层析结果了，到20分钟时候，结果已经非常明显，35分钟时候的结果较之20分钟时候并无很大的差异，因此层析时间可控制在5分钟以上，20分钟最佳。同时检测乙型流感病毒和甲型流感病毒的方法步骤3的rt-rpa扩增体系rt-rpa扩增体系(25μl)：取twistampnfokit中的缓冲液29.5μl，溶解一管rpa干粉，而后分装成两管，每管14.75μl。在0.2ml离心管中依次加入甲型和乙型rpa引物与探针，前述所述的缓冲液14.75μl，模板cdna为2μl，混匀后，加入mgac(280mm)1.25μl。将离心管置于一定温度下孵育一段时间后，混匀，而后一定温度下反应一段时间。取5μl加入70μlpbst中，利用核酸免疫侧流层析试纸(抗体浓度依次为b-bsa：50ng/strip，anti-dig：250ng/strip，anti-fitc：50ng/strip)进行分析，15min后记录检测结果。rt-rpa扩增体系反应温度、反应时间、引物和探针浓度优化实验上述扩增体系中加入的甲型流感病毒引物终浓度为100nm、甲型流感病毒探针seqidno.1终浓度为40nm、乙型流感病毒引物终浓度为100nm、乙型流感病毒探针终浓度为40nm。设定不同的孵育温度，依次为：20、35、37、39、41、45、50℃，反应时间为20min。取5μl扩增产物，加入70pbst溶液，核酸侧流层析试纸测定15min，记录结果如图4a。上述扩增体系中，依次加入终浓度为100nm的甲型流感病毒引物、40nm甲型流感病毒探针seqidno.1、100nm乙型流感病毒引物和40nm探针，反应温度为39℃，反应依次为：5、10、15、20、25min，取5μl扩增产物，加入70pbst溶液，核酸侧流层析试纸测定15min，记录结果如图4b。在上述rt-rpa扩增体系依次加入不同的终浓度的引物和探针，如表2所示，39℃孵育20min，取5μl扩增产物，加入70pbst溶液，核酸侧流层析试纸测定15min，记录结果如图4c。表2不同的探针和引物终浓度表中mf146与mr425分别为甲型流感病毒rpa上下游引物，seqidno.1为甲型流感病毒rpa探针，b-f与b-r分别为乙型流感病毒rpa上下游引物，seqidno.2为乙型流感病毒rpa探针。分别设置了a1-a4组和b1-b4组实验来检测，a1-a4组为检测甲型流感病毒的引物的最佳终浓度，b1-b4组实验为检测乙型流感病毒的引物的最佳终浓度。图4中a图为rpa体系温度优化实验图，b图为rpa体系时间优化实验图，c图为rpa体系浓度优化实验图。分析图4可知，扩增体系的温度在35—45℃之间均可，39℃温度最佳；扩增时间在5分钟以上均可，扩增20分钟即可非常清楚得到检测结果；各病毒上下游引物终浓度在50—200nm均可，最佳的是甲型流甲型流感病毒rpa上下游引物终浓度各为：100nm，乙型流感病毒rpa上下游引物终浓度各为：150nm。检测的特异性分析实验采用同时检测甲型和乙型流感病毒的rpa扩增的最佳体系分别扩增如下病毒，甲型流感病毒h1n1、甲型流感病毒h3n2、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒(a型和b型)、人肺病毒(mpv)、人冠状病毒(cov)以及阴性对照(水)，然后利用核酸免疫侧流层析试纸检测特异性，核酸免疫侧流层析试纸上抗体浓度、检测时间均采用最佳体系。实验结果如图5所示，从左到右依次为：阴性对照组(negativecontrol)；甲型流感病毒h1n1检测组(fluah1n1)、甲型流感病毒h3n2检测组(fluah3n2)、乙型流感病毒检测组(flub)、甲型亚型流感病毒和乙型流感病毒(fluah1n1+flub)、甲型亚型流感病毒和乙型流感病毒(fluah3n2+flub、呼吸道合胞病毒a型(rsva)、呼吸道合胞病毒b型(rsvb)、人肺病毒(mpv)、人冠状病毒(cov)。结果表明，双重rpa成功检测出h1n1、h3n2和flub，对rsva、rsvb、mpv和cov无反应性。检测的灵敏性分析实验首先制备足够量的病毒rna，制备方法包括四个步骤：(1)提取病毒核酸；(2)cdna合成；(3)pcr扩增；(4)单链rna的合成。具体操作方式如下：(1)提取病毒参考病毒rna提取试剂盒(天根生化，codeno.dp315-r)说明书，采用柱层析的方法提取咽拭子标本中的rna，具体如下：取1.0ml咽拭子标本，12000r/min离心20min，去除860μl上清液后，加入560μlcarrierrna工作液，涡旋震荡15s，而后室温放置15min，短暂离心后，加入560μl无水乙醇，震荡15s，转移至吸附柱(rnase-free吸附柱cr2)中，8000rpm1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中，分别加入溶液gd和rw进行清洗，最后加入60μl无rnase水洗脱。(2)cdna合成反转录(rt)反应体系(20μl)：在0.2μl的pcr管中，分别加入5μlrna、1.0μlrandomprimer(0.5μg/μl)、reversetranscription10×buffer2μl、dntpmixture(10mm)2μl、amvreversetranscriptasexl0.25μl、rnaseinhibitor0.25μl，补足无rnase水至20μl。反应条件：20℃10min，42℃30min。(3)pcr扩增pcr扩增体系(25μl)：2×pcrmix12.5μl，上游引物(10μm)和下游引物(10μm)各0.5μl，cdna2μl，补足无rnase水至25μl。分别采用引物对ampb/ampc和b-f2/b-r进行pcr扩增。反应条件：95℃5min；95℃30s,50℃30s,72℃30s；95℃30s,55℃30s,72℃30s；72℃10min。将pcr产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收，并进行测序。(4)单链rna的合成在0.2ml的pcr管中，依次加入10×transcriptionbuffer2μl，atp(50mm)2μl，gtp(50mm)2μl，ctp(50mm)2μl，utp(50mm)2μl，rnaseinhibitor(40u/μl)0.5μl，t7rnapolymerase(50u/μl)2μl，5μl纯化pcr产物，42℃反应2h。室温冷却后，加入rnasefreednasei(5u/μl)2μl，37℃2h。最后，纯化得到单链rna，利用微量分光光度计测定rna浓度。然后分别梯度稀释合成的甲型流感病毒和乙型流感病毒的单链rna，浓度依次为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μl，分别取5μl进行cdna合成，而后取2μlcdna进行双重rpa扩增和侧流层析试纸检测，并重复三次。此外，将甲型与乙型流感病毒单链rna等浓度混合，而后进行cdna合成、双重rpa扩增，rpa扩增体系为25μl，分别加入终浓度分别100nm和40nm的甲型流感病毒上下游引物和探针，150nm和40nm的乙型流感病毒上下游引物和探针。反应时间为39℃20min。取5μlrpa扩增产物，加入70μlpbs-t溶液混合后，用核酸免疫侧流层析试纸进行灵敏度检测分析，核酸免疫侧流层析试纸检测温度为室温，试纸上上喷涂的anti-fitc的浓度为50ng/strip，anti-dig的浓度为250ng/strip，b-bsa的浓度为50ng/strip，核酸侧流层析时间为20分钟。结果如图6，a图为单独检测甲型流感病毒灵敏性实验结果图，b图为单独检测乙型流感病毒灵敏性实验结果图，c图为同时检测甲型和乙型流感病毒灵敏性实验图。结果显示单独检测甲型与乙型流感病毒的最低检测限均为50拷贝/反应；同时检测甲型与乙型流感病毒的检测限分别为500和50拷贝/反应。sequencelisting<110>中国人民解放军东部战区总医院<120>一种用于检测乙型流感病毒的rpa引物、探针、试剂盒及应用<130>2019.01.30<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>30<212>dna<213>人工合成<400>1tctgctggaattgaagggtttgagccatac30<210>2<211>30<212>dna<213>人工合成<400>2tcaaacggaacttcccttctttctgagtgt30<210>3<211>48<212>dna<213>人工合成<400>3gttcctcaaatagcaactgtccgaaatacaattggaccgattaccctt48<210>4<211>29<212>dna<213>人工合成<400>4ggctctcatggaatggctaaagacaagac29<210>5<211>31<212>dna<213>人工合成<400>5ttgtatatgaggcccatgcaactggcaagtg31<210>6<211>49<212>dna<213>人工合成<400>6ttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttg49当前第1页12