中国石竹的原位杂交方法与流程

本发明属于园艺植物分子生物学
技术领域：
，具体涉及中国石竹的原位杂交方法，本发明主要用于石竹花蕾中目的基因表达的原位杂交的检测。
背景技术：
：原位杂交(insituhybridization)是指将特定标记的已知核酸序列作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸序列进行精确定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。该方法可以直观地反映目的基因在组织器官发育中的时空表达情况和表达的发育图式，并可用于分析目的基因在相应组织或器官形成中的作用。目前，相关植物的原位杂交取得良好进展。但是，在中国石竹(dianthuschinensis)中原位杂交中信号灵敏度不高，背景信号太强，且杂交效率偏低，杂交时间长，着色不清晰，原有的方法难以对中国石竹原位杂交中的基因表达进行良好的检测。目前还没有一种针对中国石竹花蕾原位杂交方法。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种对中国石竹花蕾的原位杂交方法。一种检测中国石竹花发育过程中目的基因的原位杂交方法，包括如下步骤：a、中国石竹花蕾的固定及包埋：将中国石竹的花蕾用eaf固定液(参见后面的试剂配制)进行固定，再用梯度乙醇溶液对固定样品脱水，获得脱水样品；将获得的脱水样品经过梯度二甲苯和乙醇混合液进行透明，之后再通过梯度二甲苯和石蜡混合液浸蜡，最后用纯石蜡对样品进行包埋；b、rna探针的制备：在目标基因的特异区域设计rna探针引物，其中的反向引物包含t7启动子，其序列如seqidno:1所述，然后进行体外扩增，转录和纯化，获得标记的rna探针；c、中国石竹花蕾的原位杂交：将脱水样品进行脱蜡，复水，消化处理；将处理后的样品进行预杂交、杂交；将杂交后的样品进行封闭洗脱和信号检测；上述步骤a中的梯度乙醇溶液由无水乙醇和水组成，溶剂无水乙醇的体积依次由30％增加到100％；上述步骤a中的中国石竹花蕾的固定和包埋包括以下步骤：a1、取中国石竹的花蕾，置于eaf固定液中30min，以0.08mpa抽真空30min；a2、对中国石竹器官和组织(例如花蕾)进行脱水，用乙醇溶液30％、50％、75％、85％、95％、100％对固定样品进行脱水,每次脱水40min，得脱水样品,4℃过夜；a3、对中国石竹植物器官和组织(例如花蕾)进行透明、透蜡和包埋处理，将获得的脱水样品，按二甲苯和乙醇体积比为0:1、1:3、1:1、3:1、1:0的梯度浓度进行透明，每次处理30min，之后再经过二甲苯和石蜡体积比为0:1、1:1、1:0的梯度溶液，每次处理1h,之后用纯石蜡溶液处理3次，每次静置1h,最后用纯石蜡对样品进行包埋；上述步骤b中的rna探针的制备包括如下步骤：b1、rna探针的引物设计,选取基因的特异区域设计候选探针引物，候选rna探针长度优选为150-350bp；b2、对rna探针进行扩增及纯化,在热循环仪上进行pcr反应扩增目的片段，并用dna纯化试剂盒进行纯化；b3、对rna探针进行转录及纯化，转录反应体系为：10×ntplabelingmixture2μl，5×transcriptionbuffer2μl，protectorrnaseinhibitor1μl，rnapolymeraset72μl，pcr产物1μg，补水至20μl；混匀，离心，于37℃孕育2h；加dnasei消化模板dna，于37℃孕育15min，用0.2medta终止反应；上述步骤c中的中国石竹花蕾的原位杂交包括以下步骤：c1、对样品进行脱蜡，复水；c2、对样品蛋白进行消化；c3、将消化后的样品再次固定；c4、预杂交和杂交；c5、将样品进行封闭和洗脱；c6、对样品进行信号检测；上述样品经过切片，脱蜡，复水处理之后进行蛋白消化；终止蛋白消化反应利用蛋白酶k混合液漂洗，再用甘氨酸溶液漂洗；所述蛋白酶k混合液为10μg/ml蛋白酶k、100mmtrisph7.5溶液、50mmedta；所述甘氨酸溶液为磷酸盐缓冲液即pbs稀释20g/ml甘氨酸水溶液至2mg/ml；将消化后的植物样品再次固定，即利用3.7％甲醛pbs溶液固定10min；对再固定的样品在预杂交液中进行预杂交，在杂交液中进行杂交；所述预杂交液为1×杂交盐，50％的去离子甲酰胺，2×denhart’s缓冲液和0.5mg/ml的trna混合液；所述杂交液为预杂交液和30％硫酸葡聚糖的混合物。对杂交后的样品进行封闭和洗脱；所述封闭反应需用1×blockingsolution进行封闭；所述洗脱反应，需用1×bsa0.3％tritonx-100进行洗脱。对封闭后的样品进行信号检测；进行信号检测需经过buffer2和1×bsa0.3％tritonx-100溶液漂洗，再经过buffer4显色1-2天。上述检测目的基因为dca7718，来自中国石竹即香石竹基因组网站(http://carnation.kazusa.or.jp/)。上述方法中所述的探针的核苷酸序列如seqidno:1所示。中国石竹遍布世界各地，香石竹作为世界四大鲜切花之一,在中国具有很高的经济价值及科研价值，中国石竹被广泛用于园林绿化。本发明提供的整体原位杂交方法可用于检测中国石竹中目的基因的表达情况。本发明的有益效果：本发明采用优化的固定方法和杂交方式，不但简化了操作步骤，可以两天完成固定包埋，提高了该固定方法的灵活性和可操作性，拓展了实用范围。本发明首次提供了中国石竹原位杂交步骤，使中国石竹的花蕾切片着色清晰、杂交信号特异性强、杂交背景低。本发明建立的实用、稳定的中国石竹花蕾发育的原位杂交技术，有利于对其进行基因表达模式的分析。附图说明图1：实施例1中国石竹花蕾样品的固定。图2：实施例1中rna探针的凝胶检测。图3：中国石竹花蕾的原位杂交结果。具体实施方式对序列表的说明seqidno:1是本发明实施例制备的rna探针序列。seqidno:2是本发明实施例扩增片段的正向引物序列。seqidno:3是本发明实施例扩增片段的反向引物序列。下面通过具体实施例对本发明的方法进行详细说明，但本发明的实施方式并不局限于此。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所采用溶液均为常规方法灭菌、失活降解酶的去离子水配置。本发明样本成像观测是利用江南永新nlcd500数码生物显微镜进行。其他仪器型号和货号的相关信息信息如下所述：digrnalabellingmix，购自roche公司，货号11277073910。anti-digoxigenin-apfabfragments，购自roche公司，货号11093274910。dna纯化试剂盒购自simgen公司，货号2101050。下列实施例中所用部分试剂配方如下：试剂配制：a.eaf固定液：50％无水乙醇、5％冰醋酸、3.7％甲醛溶液、加超纯水定容至100ml。b.1mtris-hcl(ph7.5)：trisbase60.55g，加水，加入浓盐酸，调ph至7.5，定容至500ml，灭菌后室温保存。c.0.5medta-2na(ph8.0)：edta-2na93.06g，加超纯水，再加naoh溶液，调ph至8.0，定容至500ml，灭菌后在室温下保存。d.10×pbs(ph7.4)：1.3mnacl、30mmnah2po4、、70mmna2hpo4。e.20mg/ml甘氨酸缓冲液：glycine2g；10×pbs10ml，加超纯水定容至100ml，按常规方法灭菌后在室温下保存。f.20×ssc:nacl175.3g、na3c6h5o7·2h2o88.2g，加超纯水定容至1000ml，用naoh调ph至7.0。g.50％硫酸葡聚糖：硫酸葡聚糖钠5g，depc水10ml，4℃下保存。h.10×hybridaztionsalts:1mtris-hcl(ph7.5)1ml，0.5medta(ph8.0)1ml，5mnacl6ml、nah2p0474.2mg，na2hpo465.7mg，加超纯水定容至10ml,，4℃下保存。i.buffer1：10mmtris-hcl(ph7.5),0.5mnacl,1mmedta。j.1×blockingsolution：100mmtris-hcl(ph7.5),150mmnacl、0.75％blockingreagent。k.1×牛血清白蛋白(bsa)0.3％tritonx-100：100mmtris-hcl(ph7.5)，150mmnacl、1％bsa，0.3％tritonx-100。l.tebuffer：10mmtris-hcl，1mmedta。m.预杂交液：1×hybridaztionsalts，50％去离子甲酰胺，2×denhart’ssolution，0.5mg/mltrna。n.杂交液:1×hybridaztionsalts，50％去离子甲酰胺，2×denhart’ssolution，30％硫酸葡聚糖，0.5mg/mltrna。o.buffer2：地高辛抗体ap按1:1250稀释于1×bsa0.3％tritonx-100中。p.buffer3：100mmtris-hcl(ph7.5)，100mmnacl，50mmmgcl2。q.buffer4：1.6mlnbt/bcipstocksolution，用buffer3定容至80ml。r.50×denhardt's：聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白(bsa)5g加水至500ml。实施例1一、中国石竹器官和组织的固定和包埋步骤a1：中国石竹花蕾的固定取0.3-0.5cm长的中国石竹花蕾,放置于10ml离心管中，分别用eaf固定液固定，贴标签(注明日期、时间、样品)30min，打开盖子，在0.08mpa下抽真空30min。参照表1配制梯度配制乙醇(酒精)溶液。表1梯度浓度乙醇溶液的配置无水乙醇超纯水30％乙醇溶液30ml定容至100ml50％乙醇溶液50ml定容至100ml75％乙醇溶液75ml定容至100ml85％乙醇溶液85ml定容至100ml95％乙醇溶液95ml定容至100ml100％乙醇100ml定容至100ml步骤a2：中国石竹花蕾的脱水从步骤a1得到的固定样品中，倒出固定液，依次用乙醇溶液(体积浓度分别为30％、50％、75％、85％95％、100％、100％)进行脱水，每次静置40min，每次静置完毕后，吸去上层液体，再加入8ml新的乙醇溶液，对固定样品进行脱水，获得脱水样品，置于4℃保存。参照表2配制二甲苯和乙醇混合液。表2二甲苯和乙醇混合液的配制无水乙醇二甲苯0:1二甲苯和乙醇混合液定容至100ml/1:3二甲苯和乙醇混合液75ml定容至100ml1:1二甲苯和乙醇混合液50ml定容至100ml3:1二甲苯和乙醇混合液25ml定容至100ml1:0二甲苯和乙醇混合液/定容至100ml步骤a3：中国石竹花蕾的透明、透蜡和包埋将前一步获得的脱水样品，倒出无水乙醇，依次加入梯度二甲苯和乙醇混合液，每次加入8ml，静置30min,每次静置完毕后，吸去上层液体，至二甲苯完全置换样品中的乙醇，此时样品完全透明。将透明后的样品，依次加入梯度石蜡和二甲苯混合液，65℃，每次静置1h，纯石蜡每次静置1h，用纯石蜡置换样品中的二甲苯，将纯石蜡与样品一起倒入方盒子中，静置24h,晾干，得到被石蜡包埋的样品。参照表3配制二甲苯和石蜡混合液。表3二甲苯和石蜡混合液的配制二、探针的制备步骤b1：rna探针引物的设计本实施方式中，针对不同目标基因区域，选取基因的特异区域设计候选探针引物，候选探针长度优选原则在150-350bp之间。设计的候选探针引物，在反向探针引物上添加t7启动子，一起扩增。例如在一个具体的实施例中，扩增片段的正、方向引物的dna序列如下所示：seqidno:2：5’-gccatgagattgaccgagtc-3’，seqidno:35’-tgtaatacgactcactatagggccttggaggttgggttgcatg-3’。步骤b2：rna探针的扩增及纯化具体的实施方式是将pcr反应体系分成多份，并分别在热循环仪上进行pcr，反应结束后合并部分或全部pcr产物进行后续处理。pcr反应可以设置30-40个循环，可根据具体的rna探针的长度等情况而定。将得到的pcr产物进行纯化处理，纯化处理采用dna纯化试剂盒(购自simgen公司)，产品编号为2101050。步骤b3：rna探针的转录及纯化rna探针的合成及荧光标记的制备，将pcr管置于冰上，依次加入以下物质：10×ntplabelingmixture2μl，5×transcriptionbuffer2μl，protectorrnaseinhibitor1μl，rnapolymeraset72μl，pcr产物1μg左右，补超纯水至20μl。轻混，稍离心，37℃孕育2h。加2μldnasei，37℃孕育15min。2μl,0.2medta终止反应。沉淀转录后的rna，添加0.1倍体积的3mnaoac，2.5倍体积的无水乙醇，沉淀过夜。离心取沉淀，加70％乙醇溶液洗脱两次，移去上清液，晾干，添加50μl去除rna酶的水中，-20℃保存。三、中国石竹花蕾的原位杂交步骤c1：样品的脱蜡，复水具体的实施方式是使用德国莱卡rm2265切片机，将蜡块切片，切片厚度为8μm，在粘附载玻片上滴一滴depc水，置于切片上，在37℃电热板上展片并干燥，将展好的片子在37℃烘箱中烘烤12h以上。取出玻片，用二甲苯洗2次，每次10min，再经100％、95％、70％、50％、30％梯度浓度的乙醇溶液，复水，每次处理1min，depc水洗两次，每次2min。步骤c2：样品的蛋白的消化实施方式是将带有样品的载玻片移至1×磷酸盐缓冲液(pbs)中，静置2min，然后将载玻片在0.2m的hcl中孵育15min，之后在depc水中静置3min，冲洗多余的hcl。随后将载玻片移至2×ssc，静置10min。depc水洗一次3min。37℃预热1μg/ml蛋白酶k缓冲液(100mmtris-hcl(ph7.5)、50mmedta(ph8.0))处理15min；静置完毕后移去液体，加入2mg/ml甘氨酸缓冲液，终止反应，漂洗2min。步骤c3：将消化后的样品进行再次固定；将消化后的样品放到1×pbs中，静置2min，再用3.7％甲醛pbs混合液固定10min，更换洗脱液为1×pbs，漂洗5min。depc水洗2次，每次1min，乙醇梯度浓度依次按30％、50％、70％、85％、95％各处理30s，用无水乙醇处理2次，每次处理1min，在超净台上吹干，4℃保存。步骤c4：预杂交和杂交将载玻片上的样品，平放于方形盒子中，每张载玻片加170μl的预杂交液；然后每张载玻片上盖parafilm封口膜，盖膜的过程中防止气泡的产生，42℃恒温环境中预杂交2h，注意保湿。移去覆盖的膜，将rna探针在80℃变性1min,溶于杂交液中，终浓度为100ng/ml，每张片子加150μl杂交液，盖膜，保湿，42℃杂交16h。步骤c5：将样品进行封闭和洗脱终止杂交，揭膜，用0.2×的ssc洗去含有探针的杂交液，分别加入洗脱液进化漂洗，洗脱顺序：0.2×ssc中于55℃漂洗两次，60min/次；buffer1中于37℃漂洗两次，5min/次；1×blockingsolution中于室温漂洗一次，置于摇床45min；1×bsa0.3％tritonx-100中于室温漂洗一次，置于摇床45min。步骤c5中blockingreagent需提1h配制，blockingreagent不易溶解，需用磁力搅拌器并加热到80℃。步骤c6：信号检测将步骤c6中处理后的样品置于避光的方盒子中，然后将3.2μl加到4mlbuffer2(地高辛抗体ap按1:1250稀释于(1％bsa,0.3％tritonx-100)溶液中)溶液中，每张添加片子200μl，覆膜，室温避光，反应1.5h；1×bsa0.3％tritonx-100溶液中漂洗四次，15min/次；buffer3中漂洗三次，10min/次；将buffer4倒入染缸中，密封，避光室温显色1-2天。20个小时后应不时镜检，观测显色程度，防止信号背景过高。检测后树脂封片，拍照。实施例2步骤c1：样品的脱蜡，复水：按照上述实施例1中所述方法，获得包埋的石竹花蕾样品用德国莱卡rm2265切片机，将蜡块切片，厚度9μm，在粘附载玻片上滴一滴depc水，切片置于其上，在37℃电热板上展片并干燥，展好的片子37℃烘箱烘烤12h以上。拿出玻片，经二甲苯洗2次，每次10min，再经100％、95％、70％、50％、30％乙醇水溶液，复水，每次处理2min，depc水洗两次，每次2min。步骤c2：样品的蛋白消化具体的本实施方式是将带有样品的载玻片移至1×pbs缓冲液中，静置2min，然后将载玻片在0.2m的hcl中孵育15min，之后在depc水中静置3min，冲洗多余的hcl。随后将载玻片移至2×ssc,静置10min。depc水洗一次3min。37℃预热1μg/ml蛋白酶k缓冲液(100mmtris-hcl(ph7.5)、50mmedta(ph8.0))处理15min；静置完毕后移去液体，加入2mg/ml甘氨酸缓冲液，终止反应，漂洗2min。步骤c3：将消化后的样品进行再次固定；将消化后的样品放到1×pbs中，静置2min，再用3.7％甲醛pbs混合液固定10min，更换洗脱液为1×pbs，漂洗5min。depc水洗2次，每次1min，乙醇梯度浓度依次按30％、50％、70％、85％、95％各处理1min，用无水乙醇处理2次，每次1min，超净台吹干。步骤c4：预杂交和杂交将载玻片上的样品，平放于方形盒子中，每张载玻片加170μl的预杂交液；然后每张载玻片上盖parafilm封口膜，盖膜的过程中防止气泡的产生，42℃恒温环境中预杂交1.5h，注意保湿。移去覆盖的膜，将探针在80℃变性2min,溶于杂交液中，终浓度为100ng/ml，每张片子加150μl杂交液，盖膜，保湿，42℃杂交16h。步骤c5：将样品进行封闭和洗脱终止杂交，揭膜，用0.2×的ssc洗去含有探针的杂交液，分别加入洗脱液进化漂洗，洗脱顺序：0.2×ssc中于55℃漂洗两次，60min/次；buffer1中于37℃漂洗两次，5min/次；1×blockingsolution中于室温漂洗一次，置于摇床45min；1×bsa0.3％tritonx-100中于室温漂洗一次，置于摇床45min。步骤c5中blockingreagent需提1h配制，blockingreagent不易溶解，需用磁力搅拌器并加热到60℃。步骤c6：信信号检测将步骤c6中处理后的样品置于避光的方盒子中，然后将3.2μl加到4mlbuffer2(地高辛抗体ap按1:1250稀释于1％bsa,0.3％tritonx-100溶液中，每张添加片子200μl，覆膜，室温避光，反应2h；1×bsa0.3％tritonx-100溶液中漂洗四次，15min/次；buffer3中漂洗三次，10min/次；将buffer4倒入染缸中，密封，避光室温显色1-2天。20个小时后应不时镜检，观测显色程度，防止信号背景过高。检测后树脂封片，拍照。实施例3步骤c1：样品的脱蜡，复水按照上述实施例1中所述方法，获得包埋的石竹花蕾用莱卡rm2265切片机，将蜡块切片，厚度10μm，在粘附载玻片上滴一滴depc水，切片置于其上，在37℃电热板上展片并干燥，展好的片子37℃烘箱烘烤12h以上。拿出玻片，经二甲苯洗2次，每次处理10min，再用梯度浓度为100％、95％、70％、50％、30％的乙醇溶液复水，每次处理1min，用depc水洗两次，每次2min。步骤c2：样品的蛋白消化具体的本实施方式是将带有样品的载玻片移至1×pbs缓冲液中，静置2min，然后将载玻片在0.2m的hcl中孵育15min，之后在depc水中静置3min，冲洗多余的hcl。随后将载玻片移至2×ssc,静置10min。用depc水洗一次3min。37℃预热1μg/ml蛋白酶k缓冲液(100mmtris-hcl(ph7.5)、50mmedta(ph8.0))处理15min；静置完毕后移去液体，加入2mg/ml甘氨酸缓冲液，终止反应，漂洗2min。步骤c3：将消化后的样品进行再次固定；将消化后的样品放到1×pbs中，静置2min，再用3.7％甲醛pbs混合液固定10min，更换洗脱液为1×pbs，漂洗3min。用depc水洗2次，每次2min，乙醇梯度浓度依次按30％、50％、70％、85％、95％各处理30s，用无水乙醇处理2次，每次1min，在超净工作台内吹干。步骤c4：预杂交和杂交将载玻片上的样品，平放于方形盒子中，每张载玻片加170μl的预杂交液。然后每张载玻片上盖parafilm封口膜，盖膜的过程中防止气泡的产生，在42℃恒温环境中预杂交2h，注意保湿。移去覆盖的膜，将探针在80℃变性1min,溶于杂交液中，使终浓度为150ng/ml，每张片子加150μl杂交液，盖膜，保湿，42℃杂交18h。步骤c5：将样品进行封闭和洗脱终止杂交，揭膜，用0.2×的ssc洗去含有探针的杂交液，分别加入洗脱液进化漂洗，洗脱方式如下：0.2×ssc中于55℃漂洗两次，60min/次；buffer1中于37℃漂洗两次，5min/次；1×blockingsolution中于室温漂洗一次，置于摇床45min；1×bsa0.3％tritonx-100中于室温漂洗一次，置于摇床60min。步骤c6：信号检测将步骤c6中处理后的样品置于避光的方盒子中，然后将3.2μl加到4mlbuffer2(地高辛抗体ap按1:1250稀释于(1％bsa,0.3％tritonx-100)溶液中)溶液中，每张添加片子200μl，覆膜，室温避光，反应2h；1×bsa0.3％tritonx-100溶液中漂洗四次，15min/次；buffer3中漂洗两次，15min/次；将buffer4倒入染缸中，密封，避光室温显色1-2天。20个小时后应不时镜检，观测显色程度，防止信号背景过高。检测后用树脂封片，并进行拍照。当然，上述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定对本发明的实施例范围。本发明的实施方式也并不仅限于上述举例，本
技术领域：
的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的若干变化与改进等，这些都应归属于本发明的专利涵盖范围内。序列表<110>华中农业大学<120>中国石竹的原位杂交方法<141>2019-02-19<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>345<212>dna<213>中国石竹(dianthuschinensis)<220><221>gene<222>(1)..(345)<400>1gccatgagattgaccgagtcaagaaagaaaatgagaacatgcagattgagctgaggcact60tgaagggagaggacatccaatgtttgccatatccagatttgatgaggcttgaagatgctc120ttgaaaatggtcttatcggtatccgtgaaaaacagatggagatctacaagatgcacaaaa180aaaatcataggatgcttgaggaggagaataatcagcttgtatacatgttgcacaagcaag240cagagatggaggcaggtgtatgcagcaacaacaacaactacgatcagcacccgattcatc300cgtcattcgggtttcgggttcaacccatgcaacccaacctccaag345<210>2<211>20<212>dna<213>中国石竹(dianthuschinensis)<220><221>primer_bind<222>(1)..(20)<400>2gccatgagattgaccgagtc20<210>3<211>43<212>dna<213>中国石竹(dianthuschinensis)<400>3tgtaatacgactcactatagggccttggaggttgggttgcatg43当前第1页12