检测microRNA表达水平的肝癌诊断试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物学和医学检验技术领域，具体地说，是一种检测microrna表达水平的肝癌诊断试剂盒及其应用。

背景技术：

原发性肝癌是我国发病率和死亡率都较高恶性肿瘤之一。最新的全球癌症统计数据显示，原发性肝癌的全球发病率为第6，而死亡率则位居第4位(bray,f.etal.(2018)ca:acancerjournalforclinicians)。在我国，其发病率在恶性肿瘤中排第3位，死亡率则高居第2位(陈万青,等.(2017)中国肿瘤26(1),1-7)。在原发性肝癌早期阶段，手术、肝移植及局部介入治疗可以极大提高病人的生存率(tunissiolli,n.m.etal.(2017)asianpacjcancerprev18,863-72)，但是也不得不面临5年复发率高达80％-90％(xia,f.etal.(2016)worldjgastroenterol22,5384-92)的难题。

目前临床用于诊断肝癌的血液学指标主要是甲胎蛋白afp，但是它的假阴性率高达40％(yao,d.f.etal.2007hepatobiliarypancreatdisint6,241-7)并且一些非肿瘤性疾病，如肝炎、肝硬化，其病人血液中的afp也可能会升高(he,s.etal.2015clinreshepatolgastroenterol39,426-34)。由于缺乏有效的检测、诊断指标，多数病人在确诊时，已到中晚期，错失早期治疗可能。中晚期肝癌的治疗，小分子靶向药物是目前肝癌治疗的主要研究方向，大量的人力和财力被投入其中，但被美国fda批准上市的当前也只有一线治疗药物索拉菲尼和二线治疗药物瑞戈替尼。作为标准治疗方案药物，虽然二者可以提高病人的生存期，但索拉菲尼也只有约3个月，瑞戈替尼是10.6个月(llovet,j.m.etal.(2008)nengljmed359,378-90；bruix,j.etal.(2017)lancet389,56-66)，并且高昂的药价及随着药物使用出现的众多不良反应，也是不少病患所要面临的重大问题。当前肝癌的治疗虽有了长足的进步，但因其存在某些不足而使病人获益受限。因此，探寻新的可用于肝癌早期诊断的指标，将有助于肝癌的早发现、早治疗。

在人类基因组序列中，只有不到2％是编码序列，其余全为非编码序列(internationalhumangenomesequencingconsortium.(2004)nature431,931-45)。非编码序列中已被发现的有小rna(mirna)、长链非编码rna(lncrnas)、环状rna(circrnas)等(weng,m.etal.(2017)translres181,108-20)，非编码rna的研究是当前的研究热点。microrna广泛存在于真核生物中，是约有23个核苷酸的组成的非编码小rna(bartel,d.p.(2009)cell136,215-33)。mirna进化过程中高度保守，主要参与转录后基因表达的调节，通过与其靶基因mrna的3’端的非编码区结合促使mrna的降解或翻译终止，从而参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等多种生物学过程(shukla,g.c.etal.2011molcellpharmacol3,83-92)。mirna在生命的进程、疾病的发生发展中都发挥了重要作用，其异常表达则会造成许多肿瘤及其它疾病的发生(rupaimoole,r.etal.(2017)natrevdrugdiscov16,203-22)。大量的研究已经证实mirna参与了肝癌的发生发展中的众多环节，包括细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移等过程。因此，mirna可以作为一种诊断肝癌的指标，具有潜在的应用价值。

但是关于检测microrna表达水平的肝癌诊断试剂盒及其应用目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种mir-125a-5p的检测试剂的用途。

本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供一种用于诊断原发性肝癌的试剂盒。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

mir-125a-5p的检测试剂在制备原发性肝癌的诊断试剂中的应用，所述mir-125a-5p的序列如seqid.1所示。

作为一个实施例，所述的肝癌为bel-7404、bel-7402、sk-hep1或mhcc-97h肝癌。

作为一个实施例，所述的肝癌为bel-7404、bel-7402、sk-hep1或mhcc-97h肝癌细胞株。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

作为本发明的一个优选实施方案，所述检测试剂中还包括扩增引物对。

作为本发明的一个优选实施方案，所述扩增引物对序列如seqid.2和seqid.3所示。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于诊断原发性肝癌的试剂盒，所述试剂盒包含mir-125a-5p的检测试剂。

作为本发明的一个优选实施方案，所述检测试剂包含：

a)mir-125a-5p扩增引物对；和/或

b)pcr扩增所需试剂；和/或

c)内参引物对。

作为本发明的一个优选实施方案，所述试剂盒包含：

a)如seqid.2和seqid.3所示的用于扩增mir-125a-5p的引物对；和/或

b)抽提和富集血清中microrna的试剂、对microrna进行反转录的试剂及对反转录产物进行特异性pcr扩增的试剂；和/或

c)如seqid.4和seqid.5所示的内参引物对。

作为本发明的一个优选实施方案，所述试剂盒包含：2.5u/μlpolya聚合酶、逆转录酶、5×逆转录缓冲液、去rna酶水、2×qpcr混合液、如seqid.2和seqid.3所示的用于扩增mir-125a-5p的引物对、如seqid.4和seqid.5所示的内参引物对、血清裂解液、70％乙醇、氯仿、吸附柱、漂洗液、无水乙醇。

作为本发明的一个优选实施方案，所述肝癌细胞株中的mir-125a-5p较正常肝细胞l02是低表达的。

作为本发明的一个优选实施方案，诊断肝癌的实验方法如下：

(1)标本准备；

(2)mirna基因芯片分析；

(3)细胞培养；

(4)rna提取，逆转录和实时聚合酶链反应(rt-qpcr)；

(5)分析正常肝细胞株与癌细胞株的血清中microrna表达量，得出结果。

所述mir-125a-5p序列、mir-125a-5p扩增引物对及内参引物对的序列均是5’—3’序列。

本发明优点在于：

1、本发明的临床可操性强且创伤性小，血清microrna稳定性好。

2、本发明的检测方法简便，检测过程简便、易于重复，由普通的技术员均可以完成，可行性强。

3、本发明通过检测高危人群的血清microrna表达水平，可及时诊断出原发性肝癌，并对其及时做出相应治疗方案，为患者争取了治疗时间，具有很好的临床应用价值。

4、本发明的microrna诊断肝癌试剂盒能够提供准确的评估结果，且能够及时反映肝癌患者的疾病状态，避免既往繁杂检测，节约时间人力成本，便于临床医生及时采取个性化的防治方案。

附图说明

附图1是8对相互配对的肝癌组织与癌旁组织所做的芯片图，结果筛选出具有差异的mirna——mir-125a-5p。

附图2是8对相互配对的肝癌组织与癌旁组织所做的qrt-pcr，结果表明mir-125a-5p在肝癌组织中是低表达的。

附图3是mir-125a-5p分别在肝癌细胞株bel-7404、bel-7402、sk-hep1、mhcc-97h及正常肝细胞l02中的表达量。数据表明：与正常肝细胞l02相比，mir-125a-5p在肝癌细胞株bel-7404、bel-7402、sk-hep1、mhcc-97h中是低表达的。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明实验方法包括：

1、前期收集人肝癌细胞株bel-7404，sk-hep1，bel-7402，mhcc-97h和正常肝细胞株l02，之后对收集的肝癌细胞株及正常肝细胞株血清中的mirna做基因芯片分析，分析结果发现具有差异的mirna——mir-125a-5p。

2、对肝癌细胞株及正常细胞株进行培养：用含10％胎牛血清(fbs，servicebio，g8001-500，中国)和1％青霉素-链霉素(keygen，kgy0023，中国)的高糖培养基(dmem，sigma，rnbg6034，usa)培养在5％co2的37℃培养箱中。然后进行rna提取，逆转录和实时聚合酶链反应(rt-qpcr)，最后依照△△ct法进行处理得出mir-125a-5p的表达量。

3、mir-125a-5p的序列见表1，设计了mir-125a-5p的扩增引物对(见表1)，并用u6作为内参，内参引物对见表1。分别在肝癌细胞株bel-7404，sk-hep1，bel-7402，mhcc-97h和正常肝细胞株l02中进行了实时荧光定量pcr扩增，使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，评价pcr产物的特异性，进而评价引物的质量。

表1

实施例1肝癌诊断试剂盒的制备

检测原发性肝癌患者的诊断试剂盒的制作工艺和操作流程主要是基于pcr技术。

通过定量pcr等技术筛选出原发性肝癌患者的microrna表达水平，作为预测原发性肝癌患者疾病诊断的指标。所述mir-125a-5p扩增引物对序列如seqid.2和seqid.3所示(见表1)，内参引物对如seqid.4和seqid.5所示(见表1)。

实施例2mirna基因芯片分析

一、实验方法

1.细胞培养：人肝癌细胞株bel-7404，sk-hep1，bel-7402，mhcc-97h和正常肝细胞l02获自americantypeculturecollection(atcc，md，usa)。按照每个孔5*105的细胞密度将处于对数生长期的肝癌细胞接种于6孔板中，所有这些细胞用含10％胎牛血清(fbs，servicebio，g8001-500，中国)和1％青霉素-链霉素(keygen，kgy0023，中国)的高糖培养基(dmem，sigma，rnbg6034，usa)培养在5％co2的37℃培养箱中。

2.mirna基因芯片分析

按照常规操作方法进行mirna基因芯片分析。

二、实验结果

基因芯片结果如图1，分析结果筛选出具有差异的mirna——mir-125a-5p。

实施例3

一、实验方法

1.细胞培养：人肝癌细胞株bel-7404，sk-hep1，bel-7402，mhcc-97h和正常肝细胞l02获自americantypeculturecollection(atcc，md，usa)。按照每个孔5*105的细胞密度将处于对数生长期的肝癌细胞接种于6孔板中，所有这些细胞用含10％胎牛血清(fbs，servicebio，g8001-500，中国)和1％青霉素-链霉素(keygen，kgy0023，中国)的高糖培养基(dmem，sigma，rnbg6034，usa)培养在5％co2的37℃培养箱中。

2.提取细胞总rna：将上一步得到的细胞用离心机以1000×rpm离心5分钟，细胞收集到1.5ml离心管中，每管加入1mltrizol(sigma，mkcb9720，usa)，用枪头轻轻吹打混匀，室温静置5min，每管加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀30s，待充分乳化后，用离心机4℃12000×g离心20min。将上清转移至新的1.5ml离心管中，向吸出的上清中加入等体积预冷的异丙醇，上下轻柔颠倒ep管，混匀后置于-20℃静置20min。用离心机4℃12000×g离心10min以获取rna。沉淀即为rna，弃上清，加入250μldepc水配制的冷70％冷乙醇溶液，清洗rna，混匀后用离心机4℃12000×g离心10min，弃去乙醇，室温风干沉淀，注意不要让目的rna降解，加入30μldepc水溶解rna，分光光度计测定rna浓度与a260/280值后置于-80℃保存备用。

3.逆转录合成cdna：使用rt试剂盒(takara，rr036a，japan)逆转录合成cdna，根据上述测定的rna浓度，取3000ng总rna，5×qrtsμper-mix2μl，剩余用无酶超纯水补至10μl，在pcr仪中逆转录合成cdna，逆转录条件：25℃10min，42℃30min，85℃5min，cdna分装后置于-20℃保存。

4.实时荧光定量pcr：分别取引物mir-125a-5p-f和mirnauniversal-r(10μm)各1μl(引物序列见表1)，2×sybrgreenqpcrmix10μl，待检cdna模板2μl，50×roxdye20.4μl，无酶去离子水5.6μl，使用premixextaq(takara，rr420a，japan)试剂盒进行反应，每个反应设置3个复孔，同时设置无模板对照。经优化qpcr的反应条件如下：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火及延伸45s，40个循环。设置在延伸阶段收集荧光信号，qμantstμdio软件分析得到样本中各基因的循环阈值(cq值)。qpcr反应结束后进行熔解曲线检测，95℃15s，60℃60s，95℃15s，1个循环。每个样本实验重复3次。根据循环数(ct)值得出mir-125a-5p的表达量。

5.用u6作为内参：所用引物由上海捷瑞生物有限公司合成。内参引物对序列见表1。

6.琼脂糖凝胶电泳

6.1配制适量的电泳缓冲液及制胶缓冲液(tbe)；

6.2配制2％的琼脂糖凝胶，称取2g的琼脂粉，加入制胶瓶中，加入100ml的tbe；

6.3盖松瓶盖，在微波炉中加热溶解琼脂糖，沸腾后，摇动瓶，反复三次，使其充分溶解；

6.4将溶解好的琼脂糖溶液倒入制胶板，凝胶厚度在8mm左右，用枪头赶走气泡；

6.5室温下使胶凝固，拔掉梳子，放入电泳槽使用；

6.6向pcr产物加入适量loadingbuffer及1/10的sybrgreenl，充分混匀后使用；

6.7上样，沿着胶孔边缘匀速加入样品，尽量避免破坏胶孔；

6.8向预留孔中加入dnamarkerd2000；

6.9盖好电泳槽的盖子，接通电源，电压80v～120v进行电泳；

6.10电泳结束后用凝胶成像观察并记录电泳结果。

7.统计学分析

所有数据均由spss21.0统计软件分析输出，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，组间差异采用方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。

二、实验结果

1.qrt-pcr实验结果见图2-图3，图2表明：mir-125a-5p在肝癌组织中是低表达的；图3结果表明：与正常肝细胞株l02相比，mir-125a-5p在肝癌细胞株bel-7404、bel-7402、sk-hep1、mhcc-97h中是低表达的。

2.琼脂糖凝胶电泳实验结果表明：目的产物特异性高，引物质量显著优于其他引物。

三、实验结论

上述实验结果表明：mir-125a-5p在肝癌细胞株中较正常细胞株表达量低，通过检测mir-125a-5p的表达水平可检测出原发性肝癌患者，从而能帮助该类患者及时进行治疗，具有很好的临床应用前景。

首先，本发明提供的检测高危人群的血清microrna表达水平的方法，可及时诊断出原发性肝癌并对其及时做出相应治疗方案，为患者争取了治疗时间，具有很好的临床应用价值。

再者，本发明开发的microrna诊断肝癌试剂盒能够提供准确的评估结果，且能够及时反映肝癌患者的疾病状态，避免既往繁杂检测，节约时间人力成本，便于临床医生及时采取个性化的防治方案。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

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