一种产电溶藻海洋细菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物应用技术领域及新能源领域，具体的说是一种产电溶藻海洋细菌及其应用。

背景技术：

自上世纪来，化石燃料的开采促进了全球经济的发展，但是化石燃料不可再生，同时化石燃料的燃烧带来了一系列的环境问题。开发获取清洁新能源是应对这一问题的关键。21世纪以来，微生物燃料电池技术成为微生物学、化学和新能源领域的研究热点，微生物燃料电池技术具有原料来源广泛，运行成本低，不产生有害气体等诸多优点，被认为是一种具有良好开发前景的绿色可再生能源利用技术。获取产电微生物是利用微生物燃料电池技术获得生物电能的基本要求，溶藻产电微生物可利用微藻作为电子供体，通过电子传递链将电子传递给最终电子受体，在获取自身生长能量的同时产生电能。获取产电微生物将有助于微生物燃料电池技术的开发利用。

水体富营养化日益严重，蓝藻水华频繁暴发，已经引起了一系列经济和社会问题，阻碍了社会的和谐发展。治理蓝藻水华是一项十分严峻的社会难题，通过生物的方法治理蓝藻水华一直是蓝藻水华治理的重要方式。目前已经报道溶藻细菌，但是对于微藻作为电子供体获得生物电能的产电细菌研究较少。产电细菌以微藻作为电子供体，释放电子进行产电，是实现藻类生物质资源化的一种新方法，溶藻产电细菌的获取分离和应用具有重要的学术价值和应用前景。

全球能源短缺使绿色新能源成为关注的焦点，湖泊富营养化的加剧，造成环境污染，产电溶藻细菌以微藻作为电子供体构建微生物燃料电池，实现能源利用的可持续发展技术，是当微生物技术研究的一个重要发展方向，具有明显的应用价值和环保效益。

技术实现要素：

本发明公开了一种从黄海近海水域中分离获得的产电溶藻海洋细菌假单胞菌(pseudomonassp.)及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种产电溶藻海洋细菌，该菌为假单胞菌(pseudomonassp.)hs01，菌株已于2019年1月4日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏编号：cgmccno.17109,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

所述假单胞菌(pseudomonassp.)hs01单细胞，革兰阴性杆菌，菌体大小(1.2～5.6)μl×宽(0.3～1.2)μl。

假单胞菌(pseudomonassp.)hs01已于2019年1月4日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏编号：cgmccno.17109,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

所述假单胞菌(pseudomonassp.)hs01，分离于黄海近海水域，经过4-8个梯度稀释后，涂无菌平板培养基(培养基组分：柠檬酸钠3.0gl^-1，氯化钠0.53gl^-1，磷酸二氢钾2.0gl^-1，七水硫酸镁1.0gl^-1，无水氯化钙0.01gl^-1，六水氯化铁0.05gl^-1和琼脂糖20gl^-1)，置于20-37℃恒温箱中培养，18小时后，经4-8次挑取单菌落后，重新利用单菌落涂平板纯化获得。

所述假单胞菌(pseudomonassp.)hs01，该细菌属于变形菌门，γ-变形菌纲(gammaproteobacteria),假单胞菌目(pseudomonadales)，假单胞菌科(pseudomonadaceae)，假单胞菌属(pseudomonas)。单细胞，革兰阴性杆菌，菌体大小(1.2～5.6)μl×宽(0.3～1.2)μl，杆状或者线状，成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，无芽胞，无荚膜。可在多种如蓝藻藻粉、蓝藻或柠檬酸钠等作为电子供体的培养基中20-37℃下生长。

一种产电溶藻海洋细菌的应用，所述假单胞菌(pseudomonassp.)hs01在治理富营养化水体中藻华暴发的应用。

所述藻为蓝藻或绿藻；其中，蓝藻为微囊藻属、念珠藻、颤藻属或鱼腥藻属；绿藻为：小球藻属、栅藻属、集星藻或盘星藻。

上述微囊藻属，如：铜绿微囊藻、鱼害微囊藻、水华微囊藻、片状微囊藻、浮生微囊藻；

颤藻属，如：巨颤藻；

鱼腥藻属，如：水华鱼腥藻；

小球藻属如普通小球藻、海水小球藻；

栅藻属，如：四尾栅藻、二形栅藻。

一种产电溶藻海洋细菌的应用，所述菌株作为产电溶藻菌在微生物燃料电池中将生物能转换为电能中的应用。

所述菌株为假单胞菌(pseudomonassp.)hs01、该菌株的培养液、该菌株的培养液浓缩物、该菌株的培养液的菌悬液、或该菌株的培养液过滤的滤液。

所述菌株在将生物能转换为电能时电子供体为柠檬酸钠、蓝藻、柠檬酸钠、蓝藻、蓝藻冻干粉、酵母提取物、牛肉高蛋白胨、柠檬酸、乙酸、乙醇或丙三醇等。

所述菌株具有溶藻性质，可利用多种有机物质作为电子供体，或与蓝藻共培养时，在高效溶藻的同时，可向胞外释放电子，产生电流。

所述菌株产电能力可利用单室微生物燃料电池和双室微生物燃料电池进行检测。单室微生物燃料电池阳极的碳布电极，阴极为空气阴极，双室微生物燃料电池阳极和阴极均为碳布电极，采用阳离子交换膜分离阴极和阳极。

采用菌株进行生物能转化时，可在以碳布作为电极，40-60mm铁氰化钾溶液作为阴极的双室微生物燃料电池内检测到电流密度为10mam^-2～30mam^-2的生物电能。

同时该菌株的培养液、该菌株的培养液浓缩物、该菌株的培养液的菌悬液、或该菌株的培养液过滤的滤液，均能实现将生物能转换为电能。

以或该菌株的培养液过滤的滤液为例在三极双室微生物燃料电池中可检测到氧化还原峰，并且在微生物燃料电池中可以检测到短暂的电流曲线，电流可达1mam^-2～10mam^-2。

本发明所具有的优点：

本发明产电溶藻海洋细菌是一株在山东省烟台市月亮湾水域分离培养获得的海洋细菌，该菌能够在多种电子供体的培养基生长，容易培养，所述菌株可应用于微生物燃料电池获得生物电能的研究，工艺简单，易操作，具有较好的电化学特性。经微生物燃料电池技术及藻菌共培养实验，发现该菌可以蓝藻藻粉、蓝藻活体细胞或柠檬酸钠等作为电子供体时，通过微生物燃料电池电化学装置测定海洋细菌具有较好的产电能力，有较好的溶藻产电能力，该海洋细菌其高效的溶藻特性在富营养化蓝藻水华治理方面具有较好的应用潜力；该细菌具有较高的产电效率，在利用电化学技术将生物能转换为电能的方面具有较好的应用潜力。

附图说明

图1为本发明实施例提的假单胞菌(pseudomonassp.hs01)处理铜绿微囊藻的溶藻效果；图中从左至右依次为对照组：不含有菌株hs01的铜绿微囊藻；实验组1：1x10⁷cellsml^-1；实验组2：1x10⁸cellsml^-1；实验组3：1x10⁹cellsml^-1。

图2为施例提的假单胞菌(pseudomonassp.hs01)处理铜绿微囊藻的溶藻效率。

图3为本发明实施例提的假单胞菌(pseudomonassp.hs01)在双室微生物燃料电池中的产电能力的效果图。

图4为本发明实施例提的假单胞菌(pseudomonassp.hs01)的胞外分泌物在双室微生物燃料电池中的产电活性的效果图。

图5为本发明实施例提的循环伏安法测定假单胞菌(pseudomonassp.hs01)在双室微生物燃料电池中的氧化还原峰。

图6为本发明实施例提的假单胞菌(pseudomonassp.hs01)在双室微生物燃料电池中阳极碳布电极上的扫描电镜照片。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

实施例1:海洋细菌hs01的分离纯化和鉴定

1.2018年8月利用球盖式采水器，在山东省烟台市月亮湾水域，采集水样保存至无菌的锥形瓶中，将锥形瓶放置于加满冰块的保温箱中，24小时内转移至无菌实验室，进行菌落的富集培养。

2.将上述采集水样经过10^-1，10^-2，10^-3，10^-4四个梯度稀释，稀释后将溶液分别涂布于无菌平板培养基，置于37℃富集培养，培养24小时后获得单菌落；所述培养基为蓝藻藻粉3.0g·l^-1，氯化钠0.53g·l^-1，磷酸二氢钾2.0g·l^-1，七水硫酸镁1.0g·l^-1，无水氯化钙0.01g·l^-1，六水氯化铁0.05g·l^-1，琼脂20g·l^-1和1l水；培养基配制后置于高温灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20min；

3.挑选单菌落，在固体柠檬酸钠培养基上进行划线培养，重复6次该操作，获得菌株。菌株形态鉴定：单细胞，革兰阴性杆菌，菌体大小(1.2～5.6)μl×宽(0.3～1.2)μl，杆状或者线状，成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，无芽胞，无荚膜。随后在平板上挑取单菌株重悬于10ml无菌培养基培养24小时；所述培养基为柠檬酸钠1.0g·l^-1,氯化钠0.53g·l^-1，磷酸二氢钾2.0g·l^-1，七水硫酸镁1.0g·l^-1，无水氯化钙0.01g·l^-1，六水氯化铁0.05g·l^-1，琼脂20g·l^-1和1l水，培养基配制后置于高温灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件下为121℃，20min；

3.将上一步骤中获得菌液，5000g离心15min，利用1ml枪头去除上清液利用基因提取试剂盒提取细菌的总dna，经过琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化，扩增其16srrna序列，利用一代测序技术，测得该细菌的16srrna序列为：

cgggggctacacatgcagtcgagcggatgaagggagcttgctccctgatttagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgttccgaaaggaacgctaataccgcgtacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggctgctggttaataccctgcagttttgacgttaccaacagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcgttaagttggatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcgagctagagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttggaatccttgagattttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgctgagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactcagacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacctcgggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagctagtctaaccttcggggggacggttaccacggagtgattcatgactggggtgaagtcgtacaaaaggtaacca。

利用以上序列在ncbi数据库中进行序列比对确定细菌的种类。最终确定细菌菌株hs01隶属于假单胞菌(pseudomonas)。

所述假单胞菌(pseudomonassp.)hs01已于2019年1月4日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏编号：cgmccno.17109,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

实施例2：海洋细菌菌株hs01对铜绿微囊藻的溶藻试验

1.将上述获得菌株hs01接种于100ml无菌培养基(培养基组分：蓝藻藻粉3.0g·l^-1，柠檬酸钠1.0g·l^-1,氯化钠0.53g·l^-1，磷酸二氢钾2.0g·l^-1，七水硫酸镁1.0g·l^-1，无水氯化钙0.01g·l^-1，六水氯化铁0.05g·l^-1，琼脂20g·l^-1和1l水，培养基配制后置于高温灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20min)中,将其培养至对数期；

2.将铜绿微囊藻microcystisaeruginosafachb905培养至250ml的无菌培养液的锥形瓶内，将铜绿微囊藻培养至对数期；微藻培养条件：28±1℃的恒温光照培养箱中，培养周期为12h：12h，光照强度54μmol(m^-2·s^-1)。铜绿微囊藻的培养基组分：nano3150g，k2hpo44g，mgso4.7h2o7.5g，cacl2.7h2o3.6g，na2co32g，柠檬酸0.6g,柠檬酸铁0.6g,微量元素溶液a51ml(微量元素溶液a5组分为蒸馏水1000ml，h3bo42.86g，mncl22.4g，h2o1.81g，znso40.222g，na2moo40.39g，cuso4·5h2o0.079g，co(no3)2·6h2o49.4g，培养基配制后置于高温灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20min。

3.取将上述培养至对数期菌株hs01接入上述培养至对数生长期的铜绿微囊藻培养液内，获得含不同浓度的菌株hs01的铜绿微囊藻培养液，每组三个重复(含不同浓度的菌株hs01的培养液为实验组1：1x10⁷cellsml^-1；实验组2：1x10⁸cellsml^-1；实验组3：1x10⁹cellsml^-1)，同时以不含有菌株hs01的铜绿微囊藻实验组作为对照组，分别放入28±1℃的恒温光照培养箱中，培养周期为12h：12h，光照强度54μmol(m^-2·s^-1)左右。

4.培养7天后通过血球计数板进行计数，观测藻类的生长情况(参见图1)，溶藻效果(参见图1)；由图1和图2可见不含有菌株hs01的纯微囊藻实验组颜色呈现绿色，微囊藻生长良好，而添加了细菌的hs01的细菌实验组，培养液出现了黄色，微囊藻生长状态较差，对铜绿微囊藻的藻细胞数在光学显微镜下利用血球计数板计数，表明铜绿微囊藻的细胞数据显著下降，溶藻率在80％-95％之间。

实施例3：利用双室微生物燃料电池检测菌株hs01的产电活性

1.将上述获得菌株hs01接种于200ml无菌培养基(培养基组分蓝藻藻粉3.0g·l^-1氯化钠0.53g·l^-1，磷酸二氢钾2.0g·l^-1，七水硫酸镁1.0g·l^-1，无水氯化钙0.01g·l^-1，六水氯化铁0.05g·l^-1，琼脂20g·l^-1和1l水，培养基配制后置于高温灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20min)中棉塞封口放置于20-37℃恒温培养箱中培养至对数期，备用；而后取5ml培养至对数生长期的菌液通过0.22μm过滤膜过滤，待用；

2.构建的微生物燃料电池分别为单室微生物燃料电池和双室微生物燃料电池，其中单室微生物燃料电池，阳极为碳布电极，阴极的空气阴极，双室微生物燃料电池采用阳离子交换膜间隔，阴极和阳极均使用碳布电极，本实施例采用双室的微生物燃料电池进行产电活性的测试；将双室微生物燃料电池组装后(不组装阳离子交换膜，阳离子交换膜浸泡在75％的乙醇溶液内保持无菌)置于高压灭菌锅内，121℃，20min高温灭菌后，放置于无菌室。后续实验操作在无菌操作室内进行。

3.依据构建的双室微生物燃料电池，将上述对数期的海洋细菌40-120ml接种于阳极室，阴极室溶液为含有60-100mm的k3fe(cn)6缓冲液，k3fe(cn)6溶液利用0.1moll^-1的na2hpo4和nah2po4缓冲液。ph为6.5-7.8，28±1℃恒温条件下使用；

利用数据采集器，采集微生物燃料电压的电池电压，另外利用钛丝及1000ω电极连接阴极和阳极，实时监测海洋细菌的产电效率。所述利用数据采集系统(model2700,keithleyinstruments,usa)采集电压，excellinx软件记录每分钟的输出电压，根据欧姆定律计算电流密度[c＝u/(rs),c(mam^-2)为电流密度，其中u为输出电压(mv)，r是外电阻(ω)，s是阳极石墨电极表面积(m²)](参见图3)；图3表明假单胞菌(pseudomonassp.hs01)具有明显的产电活性，细菌在双室微生物燃料电池随培养时间的延长，电流密度增高，产电的最高值能达到26.5mam^-2；

4.将上述步骤1.过滤后收集的滤液(无细菌)按照步骤3.重新接入一新的微生物燃料电池的阳极室进行培养，数据采集后(参见图4)，有较小的电流产生，说明细菌培养液中存在可产生氧化还原反应的电子穿梭体。

5.将上述步骤1.过滤后收集的滤液(无细菌)及步骤1.培养至对数生长期的细菌培养液分别加入至双室微生物燃料电池稳定运行后，开路状态下加入参比电极(ag/agcl)，以阳极为工作电极，阴极为对电极，构建三电极体系。用660e电化学工作站(上海辰华)利用循环伏安法以20mvs^-1的扫描速度在-0.4～0.7v的范围内进行扫描分析(参见图5)。由图3可见含有细菌的微生物燃料电池及其无细胞的培养液内的微生物燃料电池均出现了较为明显的氧化还原峰；

6.取步骤5.阳极室的碳布电极，依次通过50％，70％，80％，90％和100％的乙醇溶液中进行脱水10min处理，之后用叔丁醇干燥法清洗三次，每次10min，将干燥后的阳极室的碳布电极用到点胶将碳布样品固定在样品台上，用离子溅射仪溅射镀上一层金属膜，制备好的样品置于扫描电子显微镜(s-4800，日本日立)进行观察(参见图6)。由图6可见假单胞菌(pseudomonassp.)在碳布上的形态菌株hs01紧紧粘附在碳布上，部分hs01利用菌丝与碳布纤维连接在一起，说明这种方式可以缩短菌液与碳布之间的距离，加快菌体与碳布之间的电子传递速率。

序列表

<110>中国科学院烟台海岸带研究所

<120>一种产电溶藻海洋细菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1463

<212>dna

<213>假单胞菌(pseudomonassp.hs01)

<400>1

cgggggctacacatgcagtcgagcggatgaagggagcttgctccctgatttagcggcgga60

cgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgttccgaaaggaacgc120

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cagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcac1320

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cagaagtagctagtctaaccttcggggggacggttaccacggagtgattcatgactgggg1440

tgaagtcgtacaaaaggtaacca1463