发酵法制水溶性姜黄素的制作方法

本发明涉及发酵法制水溶性姜黄素，属于微生物生物及发酵技术领域。

背景技术：

姜黄素类化合物主要包括姜黄素、单脱甲基姜黄素和双脱甲基姜黄素，其中以姜黄素为主要成分，主要存在于植物姜黄、莪术和郁金的根或茎中，长期以来就作为一种常用的天然色素被广泛地应用在食品工业中。研究表明姜黄素可抑制众多肿瘤细胞系的生长，能影响肿瘤发生和发展的多个环节和步骤，近两年研究表明姜黄素具有提高记忆力、抗老年痴呆活性，对急性、亚急性和慢性炎症均具有抗炎作用，因此姜黄素亦具有广泛的医用价值。姜黄素的广泛应用受限于它的差的水溶性，不容易被人体吸收和利用。市面上大都通过乳化剂来调配增加它的水溶性，并不是真正意义上的溶于水。姜黄素在酸性和中性溶液中主要以酮式结构存在，而在碱性溶液中主要以烯醇式结构存在。

技术实现要素：

本发明第一个目的是提供一株一株玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)ozk17，分类命名为玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)，已于2018年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17026，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的第二个目的是提供含有所述玉米乳杆菌的微生物制剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂含有所述玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)活细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂为菌粉或细胞液。

在本发明的一种实施方式中，所述活细胞的浓度≥1×10⁸cfu/ml。

在本发明的一种实施方式中，提供所述玉米乳杆菌活细胞的制备方法如下：将所述玉米乳杆菌接种到培养基中，于37℃静置培养24h。

本发明的第三个目的是提供所述玉米乳杆菌的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是仪姜黄素为底物，以所述玉米乳杆菌细胞为催化剂制备水溶性姜黄素衍生物。

在本发明的一种实施方式中，所述姜黄素溶解于体积分数为1～10％的乙醇溶液中。

在本发明的一种实施方式中，所述玉米乳杆菌按照(1～9×10¹⁰)～(1～9×10¹¹)cfu/mg姜黄素的浓度参与催化反应。

在本发明的一种实施方式中，所述水溶性姜黄素衍生物包括姜黄素葡萄糖苷和/或姜黄素双葡萄糖苷。

本发明还要求保护所述玉米乳杆菌在制备含水溶性姜黄素衍生物的产品方面的应用。

有益效果：本发明的玉米乳杆菌能够产β-葡萄糖苷酶，能耐受10％的乙醇，并能够利用姜黄素生产姜黄素葡萄糖苷和姜黄素双葡萄糖苷，发酵4d后的转化率分别达32.72％～40.56％，3.69～5.48％，工艺简单，环境友好，安全稳定，成本低廉。

生物材料保藏

一株玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)，分类命名为：玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)，已于2018年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17026，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为lactobacilluszeaeozk17菌株进化树图。

图2为hplc分析图谱(a)姜黄素标准品hplc图谱；(b)转化后产物hplc图谱。

图3为质谱分析图谱(a)姜黄素葡萄糖苷分子的ms(一级质谱)图；(b)姜黄素葡萄糖苷对应峰的ms2(二级质谱)图；(c)姜黄素对应峰的ms2(二级质谱)图。

图4为质谱分析图谱；(a)姜黄素双葡萄糖苷分子的ms图；(b)姜黄素双葡萄糖苷分子的ms2图。

图5为姜黄素葡萄糖苷断裂方式。

图6为姜黄素双葡萄糖苷断裂方式。

具体实施方式

种子培养基：每100ml种子液，蛋白胨1g、牛肉膏1g、酵母粉0.5g、k2hpo40.2g、乙酸钠0.5g、mgso4.7h2o0.08g、mnso4.4h2o0.02g、葡萄糖2g、柠檬酸二铵0.2g、吐温800.5ml、琼脂2g(固体培养基)。

发酵培养基：每100ml发酵液，蛋白胨0.5g、酵母粉0.25g、k2hpo40.2g、乙酸钠0.5g、mgso4.7h2o0.08g、mnso4.4h2o0.02g、葡萄糖4g、柠檬酸二铵0.2g。以上培养基分装封口后于灭菌锅115℃下灭菌30min。

实施例1lactobacilluszeaeozk17的筛选

本发明的玉米乳杆菌lactobacilluszeaeozk17按如下步骤筛选获得：

(1)初筛：颜色圈平板配制→平板培养→菌种选择；

颜色圈平板配制方法如下：

在mrs固体培养基中加入终浓度为1g/l的栀子苷和2.5g/l的谷氨酸钠。

将待筛选的样品涂布在颜色圈平板上，27℃培养24h，菌落周围颜色变蓝的为产β-葡萄糖苷酶的菌株。

(2)复筛：发酵培养→微生物转化反应→液相色谱检测产物→lc-ms确认了糖苷化产物→获得目的菌株。

将初筛获得的菌株接种到种子液中，于37℃培养箱静置培养24h；再转接到含姜黄素的发酵培养基中，于37℃摇床60r/min发酵4d，测定糖苷化产物，筛选获得一株糖苷化产物含量相对较高的菌株。

(3)鉴定：

采用细胞形态学分析，菌株特征如下：mrs平板上37℃培养24h，菌落中等大小，凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落呈圆形。

采用16srdna进行种属鉴定，采用通用引物27f，1792r进行扩增，将扩增后的序列经上海生物工程股份有限公司测序，结果显示，序列如seqidno.1所示。

根据菌落形态并结合分子生物学鉴定，利用blast程序对所测菌种16srdna测序结果比对，并用mega7.0软件绘制系统进化树。用邻接法(neighbor-joining)进行发育树分析。由图1可知，该菌株为lactobacilluszeae，命名为玉米乳杆菌lactobacilluszeaeozk17。

实施例2发酵生产姜黄素

(1)种子液培养：将实施例1筛选的玉米乳杆菌ozk17接种于250ml三角瓶中，每瓶装100ml上述mrs液体培养基，37℃下静置培养24h。发酵液培养：配80ml上述mrs发酵培养基于250ml三角瓶中，于灭菌锅115℃下30min，接种菌浓为5.9×10¹⁰cfu·ml的玉米乳杆菌细胞液，接种量量为10ml，再加入10ml姜黄素浓度为1mg/ml的乙醇姜黄素溶液(将姜黄素溶解于乙醇溶液中)，于37℃摇床60r/min发酵4d。

(2)姜黄素及其衍生物的提取：将发酵4d的发酵液于离心机10000r/min下离心10min，取上清液。上清液用乙酸乙酯萃取三次，体积比为上清液:乙酸乙酯(v:v)＝2:1，萃取时间为30min，合并乙酸乙酯层于旋转蒸发仪45℃旋蒸至干，加入10ml甲醇(hplc)复溶。

(3)分析检测：高效液相色谱检测(hplc)：将步骤(1)发酵后的样品过0.22μm微孔滤膜，将实验组样品图谱与姜黄素标准品进行对比，观察是否出现新的物质峰。

液相条件为：zorboxsb-c18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；vwd检测器检测，检测波长：425nm；柱温：30℃；进样量：5μl；流速为：1ml/min；流动相：纯水(a)-乙腈(b)，洗脱梯度如表1：

表1hplc梯度洗脱条件：

实验组样品经hplc在姜黄素特征吸收波长425nm下检测如图2所示，图2(a)为姜黄素标准品hplc检测图谱，图2(b)中保留时间为9.696min和7.402min的出峰为未知产物1和2，未知产物的出峰比姜黄素早，其在高水相时洗脱出来，说明其具有比姜黄素更大的极性，初步推测其为比姜黄素水溶性更好的衍生物。

hplc-ms定性分析：对图2(b)中未知产物1的ms分子分析，由3图(a)可知，其ms¹出现m/z529的[m-h]^-和m/z565的[m+cl]^-的分子离子峰，也出现m/z367的[m-h]^-的姜黄素分子离子峰，初步判断为连上162da(六碳糖)产生的姜黄素葡萄糖苷。由图3(b)和(c)可知，未知峰ms²图出现的离子碎片m/z134、m/z149、m/z173、m/z175和m/z217均为姜黄素ms²离子碎片特征离子峰，其断裂方式如图5。综合以上检测结果推导，转化产物为姜黄素葡萄糖苷。

对图2(b)未知产物2的ms分子分析，由4图(a)可知，其ms¹出现m/z691的[m-h]^-，初步判断为连上两个162da(六碳糖)产生的姜黄素葡萄糖苷。由图4(b)可知，未知峰ms²图出现的离子碎片m/z175、m/z217、m/z367、均为姜黄素ms²离子碎片特征离子峰，碎片m/z409、m/z541为姜黄素葡萄糖苷ms²离子碎片特征离子峰，其断裂方式如图6。综合以上检测结果推导，转化产物为姜黄素双葡萄糖苷。

转化率的计算方法：

经计算，本实施例的方法所得姜黄素葡萄糖苷转化率为39％，姜黄素双葡萄糖苷转化率为4％(以峰面积计算)。

实施例3发酵生产姜黄素

具体实施方式同实施例2，区别在于，将菌体添加量调整为4.67×10¹¹cfu/mg姜黄素，发酵4d后，姜黄素葡萄糖苷转化率为32.72％，姜黄素双葡萄糖苷转化率为3.29％。

实施例4发酵生产姜黄素

具体实施方式同实施例2，区别在于，将菌体添加量调整为5.90×10¹¹cfu/mg姜黄素，发酵4d后，姜黄素葡萄糖苷转化率为39.25％，姜黄素双葡萄糖苷转化率为4.05％。

实施例5发酵生产姜黄素

具体实施方式同实施例2，区别在于，将菌体添加量调整为7.38×10¹¹cfu/mg姜黄素，发酵4d后，姜黄素葡萄糖苷转化率为40.56％，姜黄素双葡萄糖苷转化率为4.65％。

对比例1：

具体实施方式同实施例2，区别在于，以甲醇替换乙醇溶解姜黄素，结果显示，在相同条件下进行转化反应，姜黄素葡萄糖苷转化率为1.9％，未检测到姜黄素双葡萄糖苷。

对比例2：

具体实施方式同实施例2，区别在于，以丙酮替换乙醇溶解姜黄素，结果显示，在相同条件下进行转化反应，姜黄素葡萄糖苷转化率为2.8％，姜黄素双葡萄糖苷转化率为2.3％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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