一种表达鸡ST3GAL1基因的MDCK稳转细胞株的构建方法与流程

本发明涉及一种基因转细胞株的构建方法，属于细胞生物
技术领域：
。
背景技术：
：鸡st3gal1基因在mdck细胞中的表达能够增强细胞唾液酸ɑ-2,3受体的丰度，从而增强了与禽流感病毒的结合能力，大大提高了病毒生产量和疫苗生产效率。但是目前对于鸡st3gal1基因在mdck细胞中稳定的表达所用的载体中，多用真核表达载体，转染效率不高，效果差。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能保证稳定传代的表达鸡st3gal1基因的mdck稳转细胞株的构建方法。实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种表达鸡st3gal1基因的mdck稳转细胞株的构建方法，包括以下步骤：1)构建慢病毒载体：使用慢病毒骨架载体与加标签的st3gal1基因序列进行连接，得到慢病毒表达载体；转化感受态，提取阳性质粒；2)慢病毒包装：将慢病毒载体、空转载体和辅助质粒共转染293t细胞；离心聚上清液，用微膜过滤，滤液再离心弃上清液，溶解，得到浓缩慢病毒；3)mdck细胞前处理：将mdck母本悬浮细胞加至培养基后贴壁培养，稳定传代后得到贴壁细胞，接种至孔板内，加完全培养基进行培养，确认细胞在30-50％汇合度，消化计数并更换培养液；溶解步骤2)的浓缩慢病毒进行感染；4)抗性筛选：在培养基内加入梯度浓度的嘌呤霉素进行预实验，选择在三天内能够完全杀死细胞的浓度作为最终浓度，用含嘌呤霉素的培养基持续药筛后，收集抗性细胞；5)驯化：使用fbs的dmem培养基培养传代稳定后，加入无血清培养基进行驯化，再次传代稳定，得到表达鸡st3gal1基因的mdck稳转细胞株。进一步地，步骤1)中，慢病毒骨架载体为plv-puro，标签为3xflag。进一步地，步骤2)中，转染前，293t细胞先经过以下预处理方式：将293t细胞按1-2×107的密度接种到t175细胞中，转染前更换完全培养液。进一步地，步骤3)中，贴壁细胞接种至孔板内的密度为2.5-3.5×105个，每孔加入2ml完全培养基，传代前将细胞置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养。进一步地，步骤3)中，以lipo2000作为转染试剂，以moi为30进行转染。进一步地，步骤3)中，转染过程中，加入最终浓度为5μg/ml的polybrene。进一步地，步骤4)中，嘌呤霉素的梯度浓度在0.5-10μg/ml的范围内。进一步地，步骤5)中，dmem培养基含有5％的fbs。相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供的表达鸡st3gal1基因的mdck稳转细胞株的构建方法，是通过使用母本悬浮细胞加入dmem生长培养基后细胞贴壁培养，稳定传代后选择具有更高的转染效率的慢病毒载体进行转染，稳转成功后，随着细胞传至第二十代鸡st3gal1基因仍能高效稳定的表达，稳定表达的贴壁细胞又驯化成悬浮细胞进行接毒实验，相较于母本悬浮细胞生产禽流感病毒疫苗具有更大优势。附图说明图1为载体骨架plv-puro结构示意图；图2为表达载体结构示意图；图3为空转质粒载体结构示意图；图4为表达载体apali酶切位点；图5为表达载体pvui酶切位点；图6为表达载体xmni酶切位点；图7为表达载体的酶切电泳条带；图8为空转质粒载体酶切电泳条带；图9为阴性对照组细胞药筛前后电子显微镜下对比视野；图10为表达组细胞药筛2周后的显微镜及荧光显微镜视野；图11为对照组的细胞药筛2周后的显微镜及荧光显微镜视野；图12为目的基因的溶解曲线；图13为未加凝集素的对照mdck细胞；图14为未加凝集素的mdck-ad-st3gal1细胞；图15为对照mdck细胞与maa结合；图16为mdck-ad-st3gal1细胞与maa结合；图17为对照mdck细胞与sna结合；图18为mdck-ad-st3gal1细胞与sna结合；图19为图13-15中的曲线的叠加图；图20为图16-18中的曲线叠加图。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：本发明提供一种表达鸡st3gal1基因的mdck稳转细胞株的构建方法。实施例1：慢病毒表达载体的构建根据参考文献，登陆ncbi,通过查询获得所需要的鸡st3gal1基因的序列，序列号为nm_205217.1；st3gal1基因序列加入3xflag标签序列送给测序公司进行基因合成，即合成目的片段3xflag_st3gal1；合成的载体进行跑胶回收纯化，载体骨架plv-puro结构如图1所示，使用bamhi/asci双酶切并跑胶回收9321bp的片段，使用gibsonassemblycloningkit(neb)，将骨架双酶切和pcr回收产物进行无缝连接反应，构建慢病毒毒载体，即plv-ef1ɑ-3xflag/st3gal1-egfp/t2a/puro，结构如图2所示；将无缝连接反应的产物转化stbl3感受态细菌，涂布氨苄抗性的lb平板，37℃倒置培养16小时，将菌落pcr阳性的菌落进行小摇，保菌并提取质粒，得到阳性质粒命名为plv-ef1ɑ-3xflag/st3gal1-cmv-egfp/t2a/puro。以空转质粒plv-cmv-egfp/t2a/puro为对照组，载体图谱如图3所示，对阳性质粒plv-ef1ɑ-3xflag/st3gal1-cmv-egfp/t2a/puro进行酶切，阳性质粒含有apali、pvui和xmni酶切的位置，各酶切位点的位置如图4、5和图6所示；图7为表达载体的酶切电泳条带，其中，apali酶切理论长度732、1246、3993和4461bp，泳道1为使用apali酶切结果，酶切条带大小依次为4.5k/4.0k/1.2k/0.7k；pvui酶切理论长度1045、1788、2843和4756bp，泳道2为使用pvui酶切结果、酶切条带大小依次为4.8k/2.8k/1.8k/1.0k；xmni酶切理论长度994、1636、2518和5284bp，泳道3为使用xmni酶切结果，酶切条带大小为5.3k/2.5k/1.6k/1.0k，与理论数值相同；阳性质粒的测序结果如seqidno.1所示，序列中含有st3gal1基因序列，位于3221bp至4249bp间。对照组空转质粒的酶切电泳条带图如图8所示，由apali酶切的理论长度1246bp、2889和3985，泳道1为使用apali酶切结果，酶切条带大小依次为4.0k/2.9k/1.2k；由pvui酶切的理论长度为1045bp、1788bp和5287bp，泳道2为使用pvui酶切结果、酶切条带大小依次为5.3k/1.8k/1.0k；由drdi和nhei双酶切的理论长度1882bp、2309bp和3929bp，泳道3为使用drdi/nhei双酶切结果，酶切条带大小为3.9k/2.3k/1.9k，与理论数值相同，空转质粒的测序结果如seqidno.2所示。说明，实施例1的病毒载体质粒构建成功。实施例2：慢病毒包装1)293t细胞前处理；在转染前一天，接种1.3x107的293t细胞到t175中；转染当天的细胞达到约90％融合度时，更换20ml新鲜的293t完全培养液；2)使用lipo2000作为转染试剂，将辅助质粒分别和实施例1得到的慢病毒表达质粒、对照组空转质粒共转染293t细胞；4小时后，更换30ml新鲜的293t完全培养液，置培养箱中继续培养；48小时后，收集培养上清到50ml离心管中，500g离心5分钟去除细胞沉淀，回收上清；上清用0.45μm的针头滤器过滤，收集滤液；滤液用50000g高速离心2小时，弃上清；3)溶解：用1mlhbss充分溶解病毒沉淀，即为浓缩慢病毒。实施例3：慢病毒转染mdck细胞1)mdck细胞的处理：首先将母本悬浮细胞(mdck-sus)加入dmem培养基后细胞贴壁培养，稳定传代后获得贴壁细胞(mdck-ad)；2)mdck细胞培养：将贴壁细胞接种至6孔板内，接种细胞量每孔约为2.5-3.5×105个，每孔加入2ml完全培养基，传代前细胞应处于良好生理状态，将细胞置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养18-24h；转染当日取出细胞进行观察，转染前细胞密度至汇合度为30％-50％、状态良好；3)消化平衡：用胰酶消化其中一孔细胞并进行计数，每孔细胞数约为4×105个；吸去原培养基，更换为1ml新鲜完全培养基，转导前放入孵箱进行平衡；4)病毒融解：将实施例2得到的浓缩慢病毒放至冰浴或4℃使其融解，取出后需置入冰盒内使其保证低温；5)转染：病毒融解后，以moi为30进行感染，作为表达组；对贴壁细胞(mdck-ad)进行感染作为对照组；吸打混匀，充分摇匀后，每孔加入最终浓度应为5μg/ml的polybrene以提高转染效率；放入培养箱进行培养6-12小时后观察细胞状态，并更换为新鲜的完全培养基；转染48h后拍照，于荧光显微镜下观察转染效果。对比例1：慢病毒转染mdck细胞1)mdck细胞培养：将母本贴壁细胞(mdck-ad2)接种至6孔板内，接种细胞量每孔约为2.5-3.5×105个，每孔加入2ml完全培养基，传代前细胞应处于良好生理状态，将细胞置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养18-24h；转染当日取出细胞进行观察，转染前细胞密度至汇合度为30％-50％、状态良好；2)消化平衡：用胰酶消化其中一孔细胞并进行计数，每孔细胞数约为4×105个；吸去原培养基，更换为1ml新鲜完全培养基，转导前放入孵箱进行平衡；3)病毒融解：将实施例2得到的浓缩慢病毒放至冰浴或4℃使其融解，取出后需置入冰盒内使其保证低温；4)转染：病毒融解后，以moi为30进行感染，作为表达组；对贴壁细胞(mdck-ad)进行感染作为对照组；吸打混匀，充分摇匀后，每孔加入最终浓度应为5μg/ml的polybrene以提高转染效率；放入培养箱进行培养6-12小时后观察细胞状态，并更换为新鲜的完全培养基；转染48h后拍照，于荧光显微镜下观察转染效果。检测实施例检测实施例1：嘌呤霉素抗性筛选分别在培养基中加入0.8μg/ml、1.6μg/ml、3.2μg/ml、6.4μg/ml、8.0μg/ml、等浓度的嘌呤霉素进行预实验，选择在三天内能够完全杀死细胞的浓度作为最终浓度，正常细胞药筛前后电子显微镜下对比视野如图9所示；根据结果最终确定为6.4μg/ml，在加入含6.4μg/ml嘌呤霉素的培养基中持续药筛两周，收集抗性细胞，命名为(mdck-ad-st3gal1)，备用；实施例3的表达组细胞药筛2周后电子显微镜下及荧光显微镜下观察视野如图10所示；实施例3的对照组的细胞药筛2周后电子显微镜下及荧光显微镜下观察视野如图11所示。检测实施例2：qpcr法基因验证设计st3gal1和gapdh特异性引物序列：st3gal1-f:ggcaaccttcgtcagtctcast3gal1-r:gtggtgggtagtcttgctccgapdh-f:cacagtcaaggctgagaacggapdh-r:caccagcatcaccccattt；以gapdh基因为内参，利用sybrgreeni染料法对目的基因在实施例3的表达组和对照组中的表达情况进行相对定量分析，每个样品做三个平行，相对定量法采用2-δδct法；目的基因的表达参数如下表所示，溶解曲线如图12所示。表1目的基因的表达变化由上表可知，表达组中，st3gal1的表达量相对于较高，而在对照组中未检测到st3gal1相关基因的表达。从图上可知，左图是表达组和对照组扩增目的基因st3gal1的溶解曲线图，上方表达组曲线形成一个单峰说明设计的引物特异性好，下方是对照组曲线，未检测到基因；右图代表的是gapdh内参基因溶解曲线(每组3个平行)。检测实施例3：流式法检测表面受体唾液酸ɑ-2,3丰度分别收集实施例3的表达组、对照组的对数生长期的细胞1×107个，1000r，5min离心，加入pbs液2ml重悬，离心，重复两次；封闭细胞表面非特异性结合位点-用封闭液均匀重悬细胞，于冰上封闭1h；洗涤，1000r，5min离心，加入pbs液2ml重悬，离心。重复两次；加入一抗，分别用dig-sna、dig-maa及空白对照(不加一抗)，各加入200ul重悬细胞，于冰上孵育1h后重复洗涤步骤；加入二抗1000r，5min离心后，再用200μl罗丹明标记抗地高辛二抗(anti-digoxigenin-rhodamine，roche)均匀重悬细胞沉淀；清洗二抗--1000r，5min离心后，用pbs清洗三次；上机检测-用1mlpbs重悬细胞后，上机检测。实施例3的表达组、阴性对照组mdck细胞对不同连接特异性凝集素的反应性如图13-20所示：其中，图13为未加凝集素的阴性对照mdck细胞；图14为未加凝集素的mdck-ad-st3gal1细胞；图15为阴性对照mdck细胞与maa结合；图16为mdck-ad-st3gal1细胞与maa结合；图17为阴性对照mdck细胞与sna结合；图18为mdck-ad-st3gal1细胞与sna结合；图19为图13-15中的曲线的叠加图；图20为图16-18中的曲线叠加图。由图可知，本实验采用地高辛标记的两种凝集素黑接骨木果凝集素sna(sambucusnigra)、高丽槐黄柏甙凝集素maa(maackiaamurensisagglutinin)作为一抗，罗丹明标记抗地高辛二抗(anti-digoxigenin-rhodamine，roche)检测唾液酸α-2,6、唾液酸α-2,3受体的表达量，其中sna特异性识别唾液酸α-2,6，maa特异性识别唾液酸α-2,3。实验中st3gali目的基因的表达与荧光强度成正相关，相对荧光强度单位用“道数”表示(x轴)。本实验通过流式法检测实验组mdck-adh-st3gal1细胞和阴性对照组mdck细胞中的唾液酸α-2,6、唾液酸α-2,3受体的丰度，如表2和图13-20，检测唾液酸α-2,6丰度中，仅有0.11％对照组mdck细胞和0.26％实验组mdck-adh-st3gal1细胞荧光道数发生变化，而且变化很小，并没有表现出明显差异；而检测唾液酸α-2,3丰度中，有61.40％对照组mdck细胞荧光道数区由103-104变成了104-105，荧光强度为(61,451.76)，而有83.89％实验组mdck-adh-st3gal1细胞荧光道数区由103-104变成了105-106，荧光强度为(278,308.95)，实验组mdck-adh-st3gal1细胞唾液酸α-2,3受体含量显著高于阴性对照组mdck细胞。图中，各样品的参数如下表所示：表2实验组和对照组荧光标记细胞百分比和荧光强度值检测实施例4：对禽流感病毒增殖能力将实施例3的表达组细胞、对照组细胞和对对比例1的细胞用pbs清洗3次，分别按2％比例接种h9禽流感病毒，37℃吸附两小时。然后加入含5％fbs的dmem培养基；每隔12小时用倒置显微镜观察细胞病变情况，待80％的细胞出现圆缩、脱落时收毒；-20℃分别反复冻融三次，收取上清液，一管用作红细胞凝集试验检测ha滴度，一管用作检测鸡胚半数感染量eid50。表达组的ha滴度值为29haunits/50ml，eid50为(10-7/0.1ml)；对照组的ha滴度值为(25haunits/50ml)；eid50为10-4.417/0.1ml；对比例1的ha滴度值为(25haunits/50ml)；eid50为10-4.5/0.1ml。检测实施例5：驯化后对禽流感病毒增殖能力将实施例3的表达组细胞、对照组细胞扩大培养至225cm2中，然后待其长成致密单层细胞后，用pbs清洗三次；加入胰酶消化5min中，然后将细胞收集至无菌离心管中；1000r/3min离心三次，加入无血清悬浮培养基，调整细胞密度为1×106cells/ml，转移至摇瓶中悬浮培养，传至第15代，前4代每四天传一代，后11代每两天传一代；将驯化后的表达组悬浮细胞和对照组细胞进行接毒实验；每12小时收集上清液，收集至第96h；检测ha，鸡胚半数感染量eid50。表3细胞ha滴度值0h12h24h36h48h60h72h84h96h表达组0812131615131312对照组00891212131110表4eid50数值36h48h72h表达组9.8339.59对照组98.58由表3和表4可知，构建后的细胞增强了对h9亚禽流感病毒的增殖能力。对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。sequencelisting<110>华南农业大学肇庆大华农生物科技有限公司<120>一种过表达鸡st3gal1基因的mdck稳转细胞株的构建方法<130>1<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>10432<212>dna<213>人工合成<400>1aatgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaaca60tgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacga120tcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaatt180gccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacataaacgggtctctctg240gttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcc300tcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctgg360taactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccg420aacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggctt480gctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttg540actagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggaga600attagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaatta660aaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgtta720gaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacagga780tcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaagg840atagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagt900aagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgaggga960caattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagc1020acccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagc1080tttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgct1140gacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgag1200ggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctcca1260ggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttgggg1320ttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataa1380atctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaa1440ttacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatga1500acaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaa1560ttggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaat1620agtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtt1680tcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaagg1740tggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcgcta1800gcttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacata1860atagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaatttt1920actagtgattatcggattgataatcgaattccacgtggctccggtgcccgtcagtgggca1980gagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggt2040gcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctt2100tttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttcttttt2160cgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggc2220ctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagtacgtg2280attcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaa2340ggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtg2400cgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaa2460aatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggc2520caagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcg2580tcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgg2640gggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggtctcgcgccgccgtgtatcgcc2700ccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccg2760cttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcg2820ggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttca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