一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法与流程

本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说，它涉及一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法。

背景技术：

膝关节软骨损伤是运动医学临床工作的主要研究领域之一，是体育科学研究的热点与重点。关节软骨损伤的早期可引起损伤关节的疼痛和关节功能的受限，晚期关节可能出现退行性病变，发生非炎性骨关节炎，将严重降低患者生活质量。关节软骨损伤后，软骨细胞主要靠关节滑液及细胞周围的基质供给营养，以无氧酵解供能，其自身的修复能力很有限，甚至依靠自身是无法再修复。

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，msc)的出现，为软骨损伤的修复治疗带来了希望。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，具有自我更新，高度增殖及多向分化潜能。在体内外特定的诱导条件下，msc可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织器官的损伤修复与治疗，具有广阔的临床应用前景。

mscs最初在骨髓中发现，由于对骨髓来源的mscs细胞采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制，获取大量骨髓细胞十分困难。此外骨髓来源的mscs细胞免疫原性较强，而且随着供者年龄的增大，其细胞数量及分化潜能出现明显下降趋势，病毒感染率较高，长期以来人们一直在致力于寻找一种替代骨髓来源的间充质干细胞。

脐带间充质干细胞，是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，主要分布在华通氏胶和脐带血管周围。研究发现，脐带组织来源的mscs极好地保持了间充质干细胞的生物学特性及多向分化的能力。此外与骨髓及脂肪来源的mscs相比，脐带组织在取材及免疫原性上表现出很强的优势，主要包括：a.脐带中的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力；b.免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病；c.干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染；d.潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低；e.采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤；6.来源广泛，采集方便，易于保存和运输，伦理争议较少。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，其能将人源脐带间充质干细胞分化为软骨细胞，在修复人体软骨组织、治疗骨损伤方面具有重要意义。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤；所述干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤包括采用无血清培养基重悬传代培养至第七代的人源脐带间充质干细胞制成p7代干细胞悬液，p7代干细胞悬液接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养，每隔3天半量更换含软骨分化诱导剂的无血清培养基，诱导14天后，即得到软骨细胞。

进一步地，所述含软骨分化诱导剂的无血清培养基包括dmem高糖培养液、血清替代物、青霉素、链霉素、tgf-β1、铁蛋白、抗坏血酸、地塞米松和丙酮酸钠；dmem高糖培养液和血清替代物的重量比为95:5，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10ng/ml的tgf-β1，5μg/ml转铁蛋白，50μg/ml抗坏血酸，10^-7mol/l地塞米松，6.25μg/ml丙酮酸钠。

进一步地，所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。

进一步地，所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的co2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的tryple-express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到p1代干细胞悬液。

进一步地，所述干细胞的传代培养步骤包括待pn代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的tryple-express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对pn代干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得pn代干细胞悬液，将pn代干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的co2培养箱中培养，得pn+1代干细胞。其中，n=1、2、3、4、5。

进一步地，还包括干细胞的冻存步骤和干细胞的复苏与培养步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待pm代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的tryple-express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对pm代干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将pm代干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存；所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的pm代干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待pm代干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得pm代干细胞悬液，将pm代干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的co2培养箱中培养得pm+1代干细胞。

进一步地，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、l-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、n-乙酰葡萄糖胺1份。

进一步地，所述无血清培养基为hystemcell人间充质干细胞无血清培养基。

进一步地，所述干细胞悬液的浓度为1×10⁷个/ml。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

第一、通过本发明一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，p7代干细胞可以向软骨细胞分化。且在修复人体软骨组织、治疗骨损伤方面具有重要意义。

第二、经过干细胞的冻存步骤以及干细胞的复苏与培养步骤后，对人源脐带间充质干细胞的增殖能力和分化能力无影响，人源脐带间充质干细胞仍然具有向软骨细胞分化的能力。

第三、采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤，对人源脐带间充质干细胞的冻存起到更好的冻存效果。复苏后的细胞不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法，而且人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。

附图说明

图1是实施例1所得到的p6代干细胞进行培养7天的生长曲线以及对实施例2所得到的p6代干细胞进行复苏后培养7天的生长曲线。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，顺次包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤。

脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。

干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的co2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的tryple-express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到p1代干细胞悬液，调整p1代干细胞悬液浓度为1×10⁷个/ml。

干细胞的传代培养步骤包括待pn代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的tryple-express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对pn代干细胞清洗，并在hystemcell人间充质干细胞无血清培养基中重悬得pn代干细胞悬液，调整pn代干细胞悬液浓度为1×10⁷个/ml，将pn代干细胞悬液接种于t-175细胞培养瓶，并将t-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的co2培养箱中培养，得pn+1代干细胞，其中，n=1、2、3、4、5、6。

干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤包括采用hystemcell人间充质干细胞无血清培养基重悬传代培养至第七代的人源脐带间充质干细胞制成p7代干细胞悬液，调整p7代干细胞悬液浓度为1×10⁷个/ml，p7代干细胞悬液接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养，每隔3天半量更换含软骨分化诱导剂的无血清培养基，诱导14天后，即得到软骨细胞。含软骨分化诱导剂的无血清培养基包括dmem高糖培养液、血清替代物、青霉素、链霉素、tgf-β1、铁蛋白、抗坏血酸、地塞米松和丙酮酸钠；dmem高糖培养液和血清替代物的重量比为95:5，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10ng/ml的tgf-β1，5μg/ml转铁蛋白，50μg/ml抗坏血酸，10^-7mol/l地塞米松，6.25μg/ml丙酮酸钠。

实施例2

一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，顺次包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤和干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤。

脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。

干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的co2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的tryple-express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到p1代干细胞悬液，调整p1代干细胞悬液浓度为1×10⁷个/ml。

干细胞的传代培养步骤包括待pn代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的tryple-express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对pn代干细胞清洗，并在hystemcell人间充质干细胞无血清培养基中重悬得pn代干细胞悬液，调整pn代干细胞悬液浓度为1×10⁷个/ml，将pn代干细胞悬液接种于t-175细胞培养瓶，并将t-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的co2培养箱中培养，得pn+1代干细胞；其中，n=1、2、3、4、5。

干细胞的冻存步骤包括待p6代干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的tryple-express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对p6代干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，调整p6代干细胞浓度为1×107个/ml，将p6代干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的hystemcell人间充质干细胞无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、l-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、n-乙酰葡萄糖胺1份。

干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的p6代干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待p6代干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在hystemcell人间充质干细胞无血清培养基中重悬得p6代干细胞悬液，将p6代干细胞悬液接种于t-175细胞培养瓶，并将t-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的co2培养箱中培养得p7代干细胞。

干细胞向软骨细胞分化的诱导步骤包括采用hystemcell人间充质干细胞无血清培养基重悬传代培养至第七代的人源脐带间充质干细胞制成p7代干细胞悬液，调整p7代干细胞悬液浓度为1×10⁷个/ml，p7代干细胞悬液接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养，每隔3天半量更换含软骨分化诱导剂的无血清培养基，诱导14天后，即得到软骨细胞。含软骨分化诱导剂的无血清培养基包括dmem高糖培养液、血清替代物、青霉素、链霉素、tgf-β1、铁蛋白、抗坏血酸、地塞米松和丙酮酸钠；dmem高糖培养液和血清替代物的重量比为95:5，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10ng/ml的tgf-β1，5μg/ml转铁蛋白，50μg/ml抗坏血酸，10^-7mol/l地塞米松，6.25μg/ml丙酮酸钠。

对实施例1和实施例2所得到软骨细胞，采用4%多聚甲醛室温固定15分钟后执行阿利新蓝染色鉴定，检测得到的细胞是否为软骨细胞。

阿利新蓝染色鉴定是吸去多聚甲醛，用pbs漂洗2次后，加入ph2.5的阿利新蓝染液染色30分钟，蒸馏水冲洗2分钟，在倒置相差显微镜下观察染色情况，如果显微镜下可见有细胞小球生成，且被阿利新蓝染液染为蓝色，即为细胞胞浆内硫酸化糖胺多糖表达阳性，表现出了软骨细胞的生物学特性。

结果表明，不管是实施例1得到的软骨细胞，还是实施例2得到的软骨细胞，均在显微镜下可见有细胞小球生成，且细胞胞浆内硫酸化糖胺多糖表达阳性(被阿利新蓝染液染为蓝色)，表现出了软骨细胞的生物学特性。

对实施例1所得到的p6代干细胞以及对实施例2进行复苏后得到的p6代干细胞的增殖情况进行对比。绘制实施例1所得到的p6代干细胞进行培养7天的生长曲线图以及对实施例2所得到的p6代干细胞进行复苏后培养7天的生长曲线图，结果如图1所示。本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤，对人源脐带间充质干细胞的冻存起到更好的冻存效果，复苏后的干细胞的增殖能力略差于未经冻存的干细胞的增殖能力。由此可知，相较于现有技术，复苏后的干细胞不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法。

对实施例1所得到的p6代干细胞以及对实施例2进行复苏后得到的p6代干细胞的表面标记表达率的结果对比。人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记有cd34-、cd44+、cd45-、cd90+。分别对实施例1所得到的p6代干细胞以及对实施例2进行复苏后得到的p6代干细胞，在培养3天后消化收集后制成干细胞悬液，加入带有免疫荧光的抗体进行孵育，进行人源脐带间充质干细胞表面标记物的流式检测，加入的特异性抗体分别为cd34(呈阴性表达)、cd45(呈阴性表达)、cd44(呈阳性表达)、cd90(呈阳性表达)。实施例1所得到的p6代干细胞在培养3天后，流式结果显示cd34-cd44+表达率为99.9%，cd45-cd90+表达率为99.9%；实施例2进行复苏后得到的p6代干细胞在培养3天后，流式结果显示cd34-cd44+表达率为99.5%，cd45-cd90+表达率为98.7%。由此可知，经过采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤后，人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。

由此可知，通过本发明一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法，p7代干细胞可以向软骨细胞分化。而且，经过干细胞的冻存步骤以及干细胞的复苏与培养步骤后，对人源脐带间充质干细胞的增殖能力和分化能力无影响，人源脐带间充质干细胞仍然具有向软骨细胞分化的能力。这是由于采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤，对人源脐带间充质干细胞的冻存起到更好的冻存效果。复苏后的细胞不仅在存活率上有明显的提高，细胞增殖能力也优于常规的冻存方法，而且人源脐带间充质干细胞的特异性表面标记也没有明显的下降，均有较高的表达率。

应该理解的是，本发明实施例所述制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。