一种柑橘半穿刺线虫特异性PCR检测方法及应用与流程

本发明属植物线虫分子检测技术领域，涉及一种柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法及其应用。

背景技术：

柑橘半穿刺线虫(tylenchulussemipenetranscobb)是对我国柑橘(citrusreticulata)危害最严重的植物寄生性线虫之一，侵染柑橘后可导致树势缓慢性衰退，发生柑橘慢衰病(citrusslowdeclinedisease)，植株表现出叶片黄化、落花落果、生长停滞等症状，与盐分胁迫、缺素等引起的黄化症非常相似，常常导致农户采取不当的防治措施，从而加重经济损失。据统计，柑橘半穿刺线虫每年对柑橘产量造成10～30％的损失[verdejo-lucass,mckenrymv.managementofthecitrusnematode,tylenchulussemipenetrans[j].journalofnematology,2004,36(4):424-432]。我国的湖南、湖北、重庆、四川、广西、福建等15个省(市、自治区)发生其危害(尹淦镠,殷友琴.柑桔根线虫的为害症状及其形态描述[j].[中国柑桔,1980,(1):31-32+53；冯如珍.两种柑桔线虫病的调查初报[j].植物病理学报,1990，(2):48；刘维志.植物线虫志[m].北京:中国农业出版社,2004:547-549；段玉玺.植物线虫学[m].北京:科学出版社,2011:189)]，其中四川省简阳县柑橘园内的病株率达99.29％，绝收的果树占总株数的12.86％[王代武.在四川发现的两种柑桔线虫[j].中国柑桔,1983,(4):23-24)]；湖南省永州地区柑橘产区发生严重，病株率高达82.1％[宋志强,成飞雪,程菊娥,等.湖南省永州地区柑橘慢衰病与黄龙病病原鉴定及分布调查[j].植物保护,2016,42(4):189-193]。近几年，柑橘慢衰病在中国发生范围逐渐扩大，已成为制约我国柑橘产业发展的重要瓶颈。因此，开发特异性检测方法，准确监测柑橘慢衰病发生分布情况，对于制定柑橘半穿刺线虫综合防治策略具有重要意义。

目前，可通过形态学方法对柑橘半穿刺线虫进行鉴定，但此种鉴定方法需要操作人员具有较高的专业要求和丰富的线虫形态学鉴定经验，一般操作人员难以用此法进行鉴定。王扬等[王扬,喻盛甫,李娅琼,等.柑桔半穿刺线虫与短体线虫rdna的its-rflp研究[j].莱阳农学院学报,2004,(02):151-153)]开发的rflp(restrictionfragmentlengthpolymorphism)方法需要进行酶切，耗时较长。刘国坤等[liugk,chenj,xiaos,etal.developmentofspecies-specificpcrprimersandsensitivedetectionofthetylenchulussemipenetransinchina[j].journalofintegrativeagriculture,2011,10(2):252-258]开法出一种鉴定柑橘半穿刺线虫的pcr检测方法，但此方法灵敏度较低，检测灵敏度为1条二龄幼虫。宋志强等[songzq,chengje,chengfx,etal.developmentandevaluationofloop-mediatedisothermalamplificationassayforrapiddetectionoftylenchulussemipenetransusingdnaextractedfromsoil[j].plantpathologyjournal,2017,33(2):184-192]开发的lamp(loop-mediatedisothermalamplification)方法虽然可以直接从土壤中提取dna进行检测，但由于土壤中线虫分布不均，导致检测结果稳定性较差。

技术实现要素：

为了提高柑橘半穿刺线虫特异性检测的灵敏度和稳定性，本申请基于柑橘半穿刺线虫的内转录间隔区(internaltranscribedspacer,its)设计了一对特异性pcr检测引物，并对其进行了特异性、灵敏度和稳定性检测，将为柑橘半穿刺线虫的检测和监测提供方法。实验表明本发明的柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法及应用，能为制定柑橘半穿刺线虫的快速分子检测、早期诊断和辅助鉴定等提供技术服务。

一种柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法，其中pcr体系中包括一对特异性引物ts1-f和ts1-r，其核苷酸序列为：

ts1-f:5’-taatgagttccagattcg-3’，

ts1-r:5’-atactttagtgctcagaata-3’。

pcr反应体系为10×extaqbuffer2.5μl；dntps2μl(2.5mmol/l)；引物ts1-f和ts1-r各0.3μl(10μmol/l)；extaqdna聚合酶0.3μl(5u/μl)；dna模板1μl，用灭菌ddh2o补足25μl。

pcr反应条件为94℃预变性5min；94℃30s，45℃45s，72℃60s，35个循环；72℃后延伸10min；4℃保存。

一种柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法在柑橘半穿刺线虫快速分子检测中的应用。

所述应用为柑橘半穿刺线虫的田间样品检测和发生分布的监测预警。

本发明以curran等[curranj,driverf,jwob,etal.phylogenyofmetarhizium:analysisofribosomaldnasequencedata[j].mycologicalresearch,1994,98(5):547-552]设计的线虫通用引物tw81和ab28从柑橘半穿刺线虫中扩增得到的dna片段为基础，设计了特异性引物用于柑橘半穿刺线虫的快速分子检测。

(1)本发明开发的柑橘半穿刺线虫特异性检测方法能从柑橘半穿刺线虫dna中扩增出约150bp的目的片段，不能从甜菜孢囊线虫、大豆孢囊线虫、小麦孢囊线虫、南方根结线虫、咖啡短体线虫种群中扩增出特异性片段，说明本发明的引物具有较强的扩增特异性。

(2)不同稀释浓度的柑橘半穿刺线虫dna用于本发明开发的检测方法的灵敏度检测，确定了本发明检测的灵敏度为40^-1条线虫或100pg/μl的柑橘半穿刺线虫dna，说明本发明的引物具有很高的检测灵敏度。

(3)随机抽取的19个种群柑橘半穿刺线虫dna用于本发明的稳定性检测，结果显示19份样品均能扩增出约150bp目的片段，说明本发明的引物具有较好的稳定性。

本发明以线虫通用引物tw81和ab28扩增出的柑橘半穿刺线虫的dna片段为基础，设计出特异性pcr扩增引物ts1-f和ts1-r，实现了对柑橘半穿刺线虫的检测和诊断。本发明方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点，降低了对检测样本的误判。同时本发明方法将可以应用于柑橘半穿刺线虫的田间样品检测和发生分布的监测预警等，具有较好的应用价值。

附图说明

图1：柑橘半穿刺线虫its区序列及柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测引物ts1-f和ts1-r的设计

图2：柑橘半穿刺线虫its序列的同源性聚类分析

图3：pcr检测引物ts1-f和ts1-r的特异性扩增结果

m:dl2000dnamarker，ck:空白对照，1:柑橘半穿刺线虫，2:甜菜孢囊线虫，3:大豆孢囊线虫，4:小麦孢囊线虫，5:南方根结线虫，6:咖啡短体线虫

图4：特异性pcr检测引物对单条柑橘半穿刺线虫dna的灵敏度检测

m:dl2000dnamarker，ck:空白对照，1～6:1、10^-1、20^-1、40^-1、80^-1、160^-1条线虫。

图5：特异性pcr检测引物对多条柑橘半穿刺线虫基因组dna的灵敏度检测

m:dl2000dnamarker，ck:空白对照，1～6:10⁵、10⁴、10³，10²、10、1pg/μl。

图6：特异性pcr检测引物对不同种群柑橘半穿刺线虫dna的稳定性检测

m:dl2000dnamarker，1～9:yz-1、yz-5、yz-11、yz-12、yz-15、fj-4、sc-2、sc-5、sc-7柑橘半穿刺线虫dna(100pg/μl)，10～19:yz-2、yz-3、yz-9、yz-10、fj-2、fj-5、fj-6、sc-1、sc-4、sc-9柑橘半穿刺线虫dna(40^-1条线虫dna)；ck:空白对照，。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

所述试剂均为市购，主要试剂：extaqdna聚合酶、dna凝胶回收试剂盒、dnamarker、dntps和pmd19-tvector购自takara公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例1:柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法建立

1.1线虫dna的提取

将单条线虫挑入装有10μlddh2o、7μl10×pcrbuffer、3μl蛋白酶k(2mg/ml)的pcr管中，置于-80℃中冷冻2h，将样品在液氮和42℃水浴锅中交替来回冻融4～5次，65℃反应90min，85℃反应10min后直接作为pcr扩增的模板。

1.2柑橘半穿刺线虫特异性引物设计

根据根据线虫通用引物tw81和ab28扩增出柑橘半穿刺线虫的dna片段，经克隆、测序后得到its区序列，分别命名为yz-2(图1)、yz-15和sc-1，与ncbi网站上已发表的柑橘半穿刺线虫、根结线虫、孢囊线虫、咖啡短体线虫等的its序列进行blast比对及聚类分析，其中与四川柑橘半穿刺线虫种群(gu433393)的同源性最高，相似性达98％(图2)。利用已克隆的柑橘半穿刺线虫its序列与primer3.0软件，设计一对特异性的pcr扩增引物，分别命名为ts1-f和ts1-r，其核苷酸序列为：

ts1-f:5’-taatgagttccagattcg-3’，

ts1-r:5’-atactttagtgctcagaata-3’。

1.3柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法建立

采用本发明设计的特异性引物ts1-f和ts1-r，以柑橘半穿刺线虫的基因组dna为模板，进行pcr扩增，pcr反应体系为10×extaqbuffer2.5μl；dntps2μl(2.5mmol/l)；引物ts1-f和ts1-r各0.3μl(10μmol/l)；extaqdna聚合酶0.3μl(5u/μl)；dna模板1μl，用灭菌ddh2o补足25μl。采用灭菌ddh2o为模板加入pcr体系中作阴性对照。pcr反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，45℃退火45s，72℃延升60s，35个循环；72℃后延伸10min；4℃保存。

实施例2：柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法的特异性、灵敏度和稳定性检测

2.1柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法的特异性检测

利用ts1-f/ts1-r引物对柑橘半穿刺线虫、甜菜孢囊线虫、大豆孢囊线虫、小麦孢囊线虫、南方根结线虫、咖啡短体线虫的单条线虫dna进行1.3所述的pcr扩增，结果显示，只有柑橘半穿刺线虫能扩增出约150bp的目的片段，而不能从甜菜孢囊线虫、大豆孢囊线虫、小麦孢囊线虫、南方根结线虫、咖啡短体线虫种群中扩增出特异性片段(图3)，说明ts1-f/ts1-r引物具有较高的特异性。

2.2柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法的灵敏度检测

提取单条柑橘半穿刺线虫的dna，对其进行稀释得到1、10^-1、20^-1、40^-1、80^-1、160^-1条柑橘半穿刺线虫的dna；采用酚-氯仿抽提法柑橘半穿刺线虫的基因组dna，采用nanodrop2000测定其基因组dna浓度，将其稀释成10⁵、10⁴、10³，10²、10、1pg/μl的柑橘半穿刺线虫dna。各取上述1μldna作模板，用本发明建立的柑橘半穿刺线虫特异性pcr体系进行检测，以检测特异性引物的灵敏度。结果表明，dna浓度为1、10^-1、20^-1、40^-1条线虫时，能特异性扩增出150bp左右的条带，dna浓度为80^-1、160^-1条线虫时，不能扩增出特异性条带(图4)；dna浓度为10⁵、10⁴、10³，10²pg/μl时，能特异性扩增出150bp左右的条带，dna浓度为10pg/μl、1pg/μl时，不能扩增出特异性条带(图5)。由此说明ts1-f/ts1-r引物具有较高的特异性。

2.3柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法的稳定性检测

随机选取9份样品yz-1、yz-5、yz-11、yz-12、yz-15、fj-4、sc-2、sc-5、sc-7(表1)中分离的柑橘半穿刺线虫，提取多条柑橘半穿刺线虫dna并将dna浓度稀释至100pg/μl，用ts1-f/ts1-r引物进行pcr扩增，结果显示，9个种群的dna均能扩增出约150bp的目的片段。随机选取10份样品yz-2、yz-3、yz-9、yz-10、fj-2、fj-5、fj-6、sc-1、sc-4、sc-9(表1)中分离出的40^-1条柑橘半穿刺线虫dna，用ts1-f/ts1-r引物进行pcr扩增，结果显示，10份dna均能扩增出约150bp的目的片段。说明ts1-f/ts1-r引物扩增具有较高的稳定性(图6)。

表1：柑橘半穿刺线虫样品采集信息

实施例1和实施例2的结果说明，本发明建立的一种柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法具有较强的特异性、很高的灵敏度和良好的稳定性，检测灵敏度为40^-1条线虫或100pg/μl的柑橘半穿刺线虫dna，说明本发明建立的一种柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测体系准确可靠。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>一种柑橘半穿刺线虫特异性pcr检测方法及应用

<141>2019-03-11

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

taatgagttccagattcg18

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atactttagtgctcagaata20