猪不同组织稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用与流程

本公开涉及生物工程技术领域，具体涉及猪不同组织稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用。

背景技术：

猪(susscrofa)是肉类生产中一种重要的经济家畜。巴马小型猪是国内主要的小型猪品种之一，由于其遗传稳定性好、繁殖性能好、体重轻、体表白毛覆盖面积大、多个组织器官和生化指标与人类相似等特点，也成为研究人类疾病的理想动物模型。因此，在提高肉品质和人类疾病相关研究上，利用实时荧光定量pcr对巴马小型猪中的目标基因进行定量分析，准确的基因表达模式对基因功能分析具有重要意义。

其中实时荧光定量pcr(rt-qpcr)是检测细胞、组织mrna表达的重要方法之一。该技术以其高灵敏度、特异性和准确性在研究中得到广泛应用。但是，很多因素，如：rna的质量，纯度，不同样本量，酶的活性，pcr扩增效率都会影响rt-qpcr检测基因表达的结果。因此，为了减少定量检测结果的偏差，通常会选择特定的内参基因对目标基因的校正和归一化。理想的内参基因需在各种情况下保持稳定表达。在rt-qpcr结果分析时选择合适的内参基因可以提高基因表达检测的准确性和可重复性。理想的内参基因是在各个实验条件下，能在各个组织或者细胞中均能恒定表达的基因。而大量研究分析表明，大量潜在的内参基因的稳定性也是均有相对性的，在不同的细胞类型情况下，相同的内参基因的表达并不是恒定不变的。因此，在不同品种、组织和细胞类型以及不同实验条件下，选择合适且稳定的内参基因至关重要。

技术实现要素：

本公开的一个目的是提供了猪不同组织稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用，为猪不同组织内参基因的选择提供依据。

为实现上述目的，本公开的技术方案如下：

猪不同组织稳定表达的内参基因为：rps18、rpl4、ppia和tbp。

所述内参基因rps18的核苷酸序列为seqidno:1。

所述内参基因rpl4的核苷酸序列为seqidno:2。

所述内参基因ppia的核苷酸序列为seqidno:3。

所述内参基因tbp的核苷酸序列为seqidno:4。

猪不同组织稳定表达的内参基因的筛选方法，其步骤包括：

(1)根据候选内参基因的核苷酸序列设计合成引物；

(2)采集猪不同组织，提取rna，以rna为模板反转录合成cdna；

(3)以步骤(2)中所合成的cdna为模板，使用步骤(1)中合成的引物进行qpcr扩增，得到ct值，根据公式q＝2^－δδct计算相对表达量；

(4)将步骤(3)中所得数据，利用genorm和normfinder两种程序，进行内参基因稳定性的分析。

猪不同组织稳定表达的内参基因rps18、rpl4、ppia和tbp在研究猪不同组织基因表达水平上的应用。

本公开的有益效果是：提供了猪不同组织稳定表达的内参基因，所述内参基因为rps18、rpl4、ppia和tbp，这四组内参基因在猪不同组织中具有表达稳定性优异的特点，为在研究猪不同组织基因表达内水平上提供选择依据。

附图说明

图1为实施例1中9个候选内参基因的ct值结果图。

图2为实施例2genorm分析候选基因表达稳定性结果图。

图3为实施例2genorm分析候选基因的配对差异值v结果图。

具体实施方式

以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。

实施例1猪不同组织内参基因的rt-qpcr

1.猪不同组织内参基因的选择及引物的设计

本公开根据猪不同组织，选择9个候选基因，分别为top2b、actb、rps18、ppia、18s、tbp、hmbs、b2m和rpl4。基于ncbi已经公开的相关基因序列，设计合成了9对特异性引物，序列如表1：

表1引物序列表

2.猪不同组织总rna的提取与cdna的合成

采集3头出生后15天的巴马小型猪身上7种不同的猪组织(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、肌肉、皮下脂肪)。在提取总rna之前，所有样品立即在液氮中快速冷冻并在-80℃下保存。

使用trizol试剂(invitrogen，carlsbad，ca，usa)提取总rna。用evolution60分光光度计(thermoscientific)测定rna的浓度和质量。选择a260/a280比值为1.8–2.1，a260/a230比值大于2.0的rna样本进行试验。通过分析1.5％琼脂凝胶上28s/18s核糖体rna的比率来确定rna的完整性。只用三条清晰带分解的rna样本用于反转和rt-qpcr分析。

使用revertaidfirststrandcdna合成试剂盒(thermoscientific)进行cdna合成。将2μg总rna和1μl随机引物在65℃孵育5分钟。接下来，在总体积为20μl的条件下进行以下反应：12μl第一反应混合物、4μl5×rt缓冲液、2μl10nmdntp、1μl逆转录酶(200u/μl)抑制剂和1μl核糖核酸酶抑制剂(20u/μl)。反转录反应在25℃进行5分钟，42℃进行1小时，5分钟在70℃进行。反转好的cdna保存在-20℃。

3.候选内参基因的qpcr

每个rt-qpcr反应体系为20μl：10μlsybrgreenselect主混合物、7μl无菌水、0.5μl特异性引物和2μl模板cdna，每一个rt-qpcr反应三次生物学重复。在7500实时pcr系统(appliedbiosystems,fostercity,ca,usa)上进行pcr扩增，条件为：95℃持续5分钟，95℃持续15秒，60℃持续45秒。反应过后得到各候选内参基因的ct值，结果如图1，其中b2m的cq平均值15.23最低，而hmbs的cq平均值最高为23.94。所有候选参考基因在所有组织中都有大量表达，但在不同组织中的表达水平有很大的差异。因此，有必要对基因表达的稳定性进行评估，确定合适的参考基因及数目，以便在不同组织中进行精确的基因表达谱分析。

实施例2猪不同组织内参基因表达稳定性分析

对上述实施例1中得到的扩增结果利用相对表达量q＝2^－δδct(δct＝样本ct值－最小ct值)法计算目的基因的相对表达水平，分别导入genorm和normfinder进行计算。genorm程序通过计算出每个内参基因稳定性的m值来筛选出稳定性较好的内参，判定标准为m值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差，该软件还可以计算引入一个新的内参基因后标准化因子的配对变异v值，并根据vn/vn+1值来判定所选最合适内参数量。而normfinder同样可以计算内参基因表达稳定值，判定标准为稳定值最小的为最合适的内参基因。

1.用genorm分析候选内参基因表达稳定性

用genorm程序计算9个候选参考基因的表达稳定值(m值)，m值越低，该内参基因越稳定。结果如图2显示：rps18和rpl4是9个候选参考基因中表达最稳定的基因；紧随其后的是tbp、top2b、b2m、hmbs、actb、18s。

genorm程序分析得到的vn/vn+1值如图3在0.087到0.203之间。v4/v5值为0.114，低于0.15。这些结果表明，4个内参rps18、rpl4、ppia和tbp是巴马小型猪组织间基因表达最为稳定的。

2.normfinder分析候选内参基因表达稳定性

normfinder的分析结果如表2显示：ppia的sv值最低(sv＝0.071)，表明ppia的表达最稳定；紧接着的是tbp，rps18和rpl4。所以在normfinder程序分析下4个内参rps18、rpl4、ppia和tbp是巴马小型猪组织间基因表达最为稳定的，这一结果与genorm分析得到的结果一致。

表2normfinder计算基因表达稳定性结果

综上分析，可以确定rps18、rpl4、ppia和tbp内参基因为出生后15天巴马小型猪组织基因表达分析时最稳定的内参基因。

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<110>佛山科学技术学院

<120>猪不同组织稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用

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