一种细胞膜电击冷冻实验方法及装置与流程

本发明涉及医学实验器材领域，特别是一种细胞膜电击冷冻实验方法及装置。

背景技术：

纳秒脉冲电场(nspef)是一种非热、非电离、非辐射的物理方法，它可以利用强电场来消融肿瘤细胞，而且纳秒脉冲电场烧蚀具有输出功率高但不产生明显热积累的特点。现有研究证明纳秒脉冲电场可以影响细胞功能，但确切的分子机制尚不清楚，一些研究人员发现纳秒脉冲电场能将传统的电穿孔扩展形成纳米孔。进一步研究还发现纳秒脉冲电场会破坏细胞膜上的微结构域，对此已有研究提供了荧光染料或模拟标记的细胞膜渗透性增加的间接证据，但目前的超快记录相机也无法拍摄记录下纳秒脉冲电场在实时纳秒脉冲应用中的实际效果照片，因此截止目前没有可靠的直接形态学证据能够证明膜纳米孔的形成。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题和提出的技术任务是克服现有对纳秒脉冲电场（nspef）破坏细胞膜上的微结构域形成膜纳米孔缺乏有效的直接形态学证据，现有超快记录相机无法拍摄记录纳秒脉冲电场在实时纳秒脉冲应用中的实际效果照片等问题，本发明提供一种细胞膜电击冷冻实验方法及装置，所述细胞膜电击冷冻实验方法及装置可以捕获纳秒脉冲电场应用于细胞膜上的瞬时穿孔现象，并对发生瞬时穿孔的细胞膜形态变化做快速冷冻的固化保存，以提供直接可靠的形态学证据，为后续细胞膜动态膜漂浮和纳米孔穿孔研究提供便利。

本发明解决技术问题采用的技术方案：一种细胞膜电击冷冻实验方法，其特征是所述实验方法包括依序进行的以下步骤：

（1）制作琼脂糖凝胶液，冷却至35～40℃；

（2）向琼脂糖凝胶液中加入培养到对数生长期的细胞，然后摇匀，待琼脂糖溶液凝固为固体胶冻；

（3）固体胶冻以自由落体方式穿过一平行电场后掉入液氮中冷冻固化。

本发明将细胞放入琼脂糖凝胶液中制成固体胶冻，然后使固体胶冻做自由落体运动穿过平行电场受到闪速电击，以闪速冷冻方式在纳秒脉冲电击实施后掉入液氮中实现瞬态冷冻固化保存，在脉冲发生后的毫秒级别时间段内提供直接的形态学证据，以展示纳秒脉冲电击细胞后细胞膜的瞬时变化，方便研究膜图像和细胞介质特性；电击完成后固体胶冻瞬间掉入液氮，在冰晶形成之前立即固定纳秒脉冲处理的细胞，避免细胞膜的冰晶效应和损伤。

作为对上述技术方案的进一步完善和补充，本发明采用如下技术措施：所述固体胶冻从开始下落到完成电击所用时间为247ms，所述平行电场为纳秒脉冲电场，然后在2ms内进入液氮。所述固体胶冻从开始下落到完成电击所用时间为247ms，所述平行电场为纳秒脉冲电场，然后在2ms进入液氮。固体胶冻以闪速冷冻方式在纳秒脉冲电击实施后将细胞阻滞在247ms这个特定的时间点上，接着在2ms内掉入液氮中实现瞬态冷冻固化保存，在脉冲发生后的毫秒级别时间段内提供直接的形态学证据，以展示纳秒脉冲电击细胞后细胞膜的瞬时变化，方便研究膜图像和细胞介质特性；电击完成后固体胶冻在2ms内掉入液氮，能在冰晶形成之前立即固定纳秒脉冲处理的细胞，避免细胞膜的冰晶效应和损伤。

所述纳秒脉冲电场为矩形纳秒脉冲，纳秒脉冲的持续时间为300ns，场强为8kv/cm，快速脉冲上升缘时间为≤20ns。使用毫秒级的电脉冲对细胞膜电击，有效破坏细胞膜上的微结构域。

所述琼脂糖凝胶液为琼脂糖加纯水混合后经微波炉加热制成的0.8％琼脂糖凝胶液。使用0.8％琼脂糖凝胶液做电击冷冻实验的效果较好，方便研究膜图像和细胞介质。

一种细胞膜电击冷冻实验装置，包括液氮存储容器、底座、电击机构和自由落体机构以及可分离的细胞夹器，所述底座架在液氮存储容器上方，细胞夹器包括绝缘的环形圈垫和两块铜片，两块铜片可夹住垫圈围成闭合容腔；所述电击机构包括纳秒脉冲发生器和与其导线连接的正对设置的正、负极电板，所述正、负极电极板竖置底座上，底座在正、负极电板之间设空挡；所述自由落体机构包括设在底座上的导轨和设于其上可做自由落体运动的滑块，滑块位于空挡的上方并且其底部设置夹持细胞夹器的夹持结构，所述夹持结构可使细胞夹器以保持两面铜片平行正、负极电板的状态做自由落体，在细胞夹器随滑块做自由落体运动从正、负极电板之间穿过时，正、负极电板放电对细胞夹器电击，滑块下落到最低位时细胞夹器从夹持结构松脱穿过空挡落入液氮存储容器内。本发明可将含有细胞的琼脂糖凝胶固体胶冻自由下落，并在下落中对其施加纳秒脉冲电场的电击，然后迅速掉入液氮中冷冻固化，通过闪速电击结合闪速冷冻的组合，在脉冲发生后的毫秒级别时间段内提供直接的形态学证据，展示纳秒脉冲电击细胞后细胞膜的瞬时变化。工作时，胶冻可以放在环形圈垫中间然后用两个铜片夹住放入滑块底部夹持结构，然后滑块沿着导轨做自由落体运动，下落过程中细胞夹器的两面铜片保持平行正、负极电板的状态；在胶冻穿过正、负极电板之间区域时纳秒脉冲发生器工作，对胶冻施加脉冲电场电击；滑块下落到最低位时细胞夹器从夹持结构松脱穿过空挡落入液氮存储容器内事先装盛的液氮中，细胞夹器碰撞液氮液面后打开，两个铜片分离，胶冻脱离环形垫圈浸没于液氮中冷冻固化实现冰冻，定格纳秒脉冲电场引起的细胞膜瞬时穿孔现象。此外，所述纳秒脉冲发生器为现有技术，本发明所用为现有技术的blumlein型纳秒脉冲发生器。

所述导轨为设在底座上的两根竖置导向杆，所述滑块两端开孔套置两根导向杆上。导轨结构简单，采用两根竖置的导向杆即可，滑块通过其两端开孔套置在导向杆上，确保滑块沿着导向杆下滑做自由落体运动，保持滑块上夹持的细胞夹器的两面铜片平行于正、负极电板的状态。

所述夹持结构为滑块底部设置的向下开口并可与细胞夹器紧配合的夹槽，所述底座上在正、负极电板之间设置和滑块相配的碰撞座，滑块下落到最低位时撞击碰撞座以使细胞夹器从夹槽松脱下落。由于夹槽与细胞夹器紧配合，当滑块下落到最低位时，撞击碰撞座产生震动，使得原本紧配合的细胞夹器从夹槽松脱，下落掉入液氮存储容器。

所述空挡为底座上贯通设置的条形孔，所述正、负极电板分立条形孔长度方向的两侧，并沿条形孔的长度方向延伸，所述碰撞座上设有和条形孔相配的通孔，滑块顶面和碰撞座底面上分设相配合的碰撞面，滑块下落到最低位时滑块撞到碰撞座使细胞夹器脱落，并自上而下穿过通孔和条形孔落入液氮存储容器内。底座直接开设贯通的条形开孔形成适合细胞夹器落下穿过的空挡；正、负极电板分立条形孔长度方向两侧并沿其长度方向延伸，形成和条形孔长度相匹配的平行电场区域，方便对穿过的细胞夹器和设于其内细胞胶冻放电；细胞夹器下落时可依次穿过碰撞座上的通孔与底座上的条形孔，再落入液氮中；滑块和碰撞座通过对应接触部位设置的碰撞面配合，有足够面积碰撞产生合适震动，保证细胞夹器松脱掉落。

所述碰撞座和滑块上的碰撞面为大小匹配的平面，所述夹槽由滑块底面上固定的两块正对平行的夹板组成，所述两块夹板向下凸出于滑块底面。碰撞面为分设在碰撞座和滑块上大小匹配的平面，两处平面结构简单、加工方便，当滑块和碰撞座上的两个平面贴合接触时，滑块下落到达最低位置；两块夹板向下凸出滑块底面，在滑块和碰撞座撞击时，凸出的两块夹板可以有活动空间作位移，以震动掉落细胞夹器。

本发明提供一种细胞膜电击冷冻实验方法及装置，所述细胞膜电击冷冻实验方法及装置可以捕获纳秒脉冲电场应用于细胞膜上的瞬时穿孔现象，并对发生瞬时穿孔的细胞膜形态变化做快速冷冻的固化保存，以提供直接可靠的形态学证据，为后续细胞膜动态膜漂浮和纳米孔穿孔研究提供便利。

附图说明

图1：本发明整体结构示意图。

图2：图1的a-a向剖视图。

图3：图1的b-b向剖视图。

图4：图1所述装置工作原理图一（滑块在最高位）。

图5：图1所述装置工作原理图二（滑块在最低位）。

图中：1.液氮存储器、2.底座、3.圈垫、4.铜片、5.导线、6.正极电板、7.负极电板、8.滑块、9.导向杆、10.夹槽、11.碰撞座、12.条形孔、13.通孔、14.夹板。

具体实施方式

下面结合附图说明和具体实施方式对本发明做进一步的说明。

如图1～5所示，一种细胞膜电击冷冻实验装置，包括液氮存储容器1、底座2、电击机构和自由落体机构以及可分离的细胞夹器，所述底座2架在液氮存储容器1上方，细胞夹器包括绝缘的环形圈垫3和两块铜片4，两块铜片4可夹住垫圈3围成闭合容腔；所述电击机构包括纳秒脉冲发生器和与其导线5连接的正对设置的正极电板6、负极电板7，所述正、负极电极板竖置底座2上，底座2在正极电板6、负极电板7之间设空挡；所述自由落体机构包括设在底座2上的导轨和设于其上可做自由落体运动的滑块8，所述导轨为设在底座2上的两根竖置导向杆9，所述滑块8两端开孔套置两根导向杆9上，滑块8位于空挡的上方并且其底部设置夹持细胞夹器的夹持结构，通过所述夹持结构可使细胞夹器以保持两面铜片4平行正极电板6、负极电板7的状态做自由落体，在细胞夹器随滑块8做自由落体运动从正极电板6、负极电板7之间穿过时，纳秒脉冲发生器通过正极电板6、负极电板7放电对细胞夹器电击，滑块8下落到最低位时细胞夹器从夹持结构松脱穿过空挡落入液氮存储容器1内事先装盛的液氮中；所述夹持结构为滑块8底部设置的向下开口并可与细胞夹器紧配合的夹槽10，该夹槽10由滑块8底面上固定的两块正对平行的夹板14组成，两块夹板14向下凸出于滑块8底面；底座2上在正极电板6、负极电板7之间设置和滑块8相配的碰撞座11，滑块8下落到最低位时撞击碰撞座11以使细胞夹器从夹槽10松脱下落；所述空挡为底座2上贯通设置的条形孔12，所述正极电板6、负极电板7分立条形孔12长度方向的两侧，并沿条形孔12的长度方向延伸，碰撞座11上设有和条形孔12相配的通孔13，滑块8顶面和碰撞座11底面上分设相配合的碰撞面，碰撞座11和滑块8上的碰撞面为大小匹配的平面；滑块8下落到最低位时滑块8撞到碰撞座11使细胞夹器脱落，并自上而下穿过通孔13和条形孔12落入液氮存储容器1内。

工作时，胶冻放在环形圈垫中间然后用两个铜片夹住放入滑块底部夹持结构，然后滑块沿着导轨做自由落体运动，本实施例中滑块下落预设高度h为0.3m，通过物理公式h=1/2gt²就能算出自由落体0.247s，纳秒脉冲发生器放电，正、负电极板之间形成平行电场，电击细胞夹器，下落过程中细胞夹器的两面铜片保持平行正、负极电板的状态；滑块下落到最低位时细胞夹器从夹持结构松脱穿过空挡落入液氮存储容器内事先装盛的液氮中，正、负极电板下边缘与液氮的液面高差为10㎜，细胞夹器碰撞液氮液面后打开，两个铜片分离，胶冻脱离环形垫圈浸没于液氮中冷冻固化实现冰冻，定格捕捉纳秒脉冲电场引起的细胞膜瞬时穿孔变化，固体胶冻中的细胞会分散到液氮中。作为对比，还可以将前述液氮存储容器替换成培养皿，前述电击处理后的细胞掉入培养皿中，以体外培养纳秒脉冲处理后的细胞，分析细胞周期、凋亡、存活和生长情况，与前述电击后冷冻的细胞进行比对。

一种细胞膜电击冷冻实验方法，所述实验方法包括依序进行的以下步骤：

（1）制作琼脂糖凝胶液，冷却至35～40℃；所述琼脂糖凝胶液为琼脂糖加纯水混合后经微波炉加热制成的0.8％琼脂糖凝胶液；本实施例中称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml纯水,放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,制得0.8％琼脂糖凝胶液，然后在室温放置用手触摸冷却至37℃；

（2）向琼脂糖凝胶液中加入培养到对数生长期的细胞，然后摇匀，待琼脂糖溶液凝固为固体胶冻，然后就可以将该固体胶冻填塞进细胞夹器的两个铜片之间的圈垫中间，然后放入滑块底部的两个夹板形成的夹缝中；

（3）固体胶冻以自由落体方式穿过一平行电场后掉入液氮中冷冻固化，固体胶冻从开始下落到完成电击所用时间为247ms，所述平行电场为纳秒脉冲电场，然后在2ms内进入液氮；所述纳秒脉冲电场为矩形纳秒脉冲，纳秒脉冲的持续时间为300ns，场强为8kv/cm，快速脉冲上升缘时间为≤20ns，前述这一自由落体过程中滑块沿着导向杆下落直到最低位撞击碰撞座，细胞夹器脱离滑块掉入液氮中，所述脉冲形状可以通过示波器记录及监视。