本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法。
背景技术：
：脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用ph、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，主要的发酵微生物有黑曲霉，假丝酵母等等，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源。然而，现有的脂肪酶的微生物发酵和提取纯化技术尚不成熟，其产品存在纯度低，杂蛋白多、如果要得到纯度高的产品，却带来工艺复杂成本高等问题。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法，以利用抗原抗体特异结合提取纯化脂肪酶，可以有效去除杂质，所得脂肪酶纯度高、质量好、收率高，在脂肪酶浓度较低时也可以对其进行提纯，且生产成本低。为实现上述目的，本发明提供了一种采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法，包括步骤：s1：采用产脂肪酶的假单胞菌为发酵菌种进行发酵，得到发酵液；s2：将发酵液离心，收集上清液，得到脂肪酶粗酶液；s3：将脂肪酶粗酶液上固定化马抗体柱，之后用清洗液洗柱，再采用的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的脂肪酶；s4：在纯化后的脂肪酶中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀；之后离心，收集沉淀；将沉淀透析后冻干干燥，得到脂肪酶。需要说明的是，收集脂肪酶沉淀后，优选用ph值为7.2的0.1m的磷酸缓冲液进行透析，再冻干。s1具体包括步骤：将产脂肪酶的假单胞菌的单一菌落置于摇瓶培养液中，在20-30℃、200-300rpm条件下培养16-20h，然后按10％的接种量转入发酵培养液中，在20-29℃、200-300rpm条件下培养60-70h，得到所述发酵液。优选地，s1中，每升摇瓶培养液中包括：酵母提取物5g、蛋白胨5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0。优选地，s1中，每升发酵培养液中包括：酵母提取物10g、蛋白胨5g、nacl0.5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0。s2中，离心是采用高速冷冻离心机，在4℃、10000-11000g条件下离心14-16min。s3中，固定化马抗体柱的制备方法包括步骤：将马每两周免疫一次，共进行10-16周的免疫，每次2ml，剂量分别为3-21mg脂肪酶加等量的弗氏完全佐剂，多点皮下免疫，elisa检测抗体滴度大于1：10000后收集抗血清；将抗血清离心除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用proteina或proteing亲和层析柱纯化出多克隆抗体；将多克隆抗体与活化的sepharose2b或sepharose4b连接，得到固定化马抗体柱。优选地，s3中，马的重量为210-370公斤，马的年龄为2-12岁，马的品种为蒙古马。s3中，清洗液为ph值为7.2的0.1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液；洗脱液为0.1m磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的ph值为3。s3中，还包括采用ph值为8的1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液清洗柱至中性的步骤。优选地，可以采用该缓冲液调节洗脱液至ph值为7.0。需用说明的是，这可以使亲和柱重复利用，并且保持脂肪酶活性。s4中，离心是在4℃、3000-5000g条件下离心5-10min。本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法，利用抗原抗体特异结合提取纯化脂肪酶，可以有效去除杂质，特异性强，所得脂肪酶纯度高、质量好、收率高、活性高，在脂肪酶浓度较低时也可以对其进行提纯，效率高；通过抗体滴度监测，选用高滴度的多抗用于制作亲和柱，有效保证脂肪酶的收率和纯度；(2)本发明提供的采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法，生产工艺简单，生产成本低；容易得到多克隆抗体，免疫亲和层析柱可反复使用，可有效减少废水排放和环境污染，是一种高效的脂肪酶提取方法。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。本发明采用的假单胞菌为假单胞菌atcc21808。本发明提供一种采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法，包括步骤：s1：将产脂肪酶的假单胞菌atcc21808的单一菌落置于装有25ml摇瓶培养液的250ml摇瓶中，在20-30℃、200-300rpm条件下培养16-20h，然后按10％的接种量转入发酵培养液中，在20-29℃、200-300rpm条件下培养60-70h，得到发酵液；其中，每升摇瓶培养液中包括：酵母提取物5g、蛋白胨5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；每升发酵培养液中包括：酵母提取物10g、蛋白胨5g、nacl0.5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；s2：将发酵液离心，收集上清液，得到脂肪酶粗酶液；其中，离心是采用高速冷冻离心机，在4℃、10000-11000g条件下离心14-16min；s3：将脂肪酶粗酶液上固定化马抗体柱，上柱期间，检测流出液的脂肪酶活性，直到有脂肪酶活性流出，停止上液；之后用ph值为7.2的0.1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱，再采用ph值为3的0.1m磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的脂肪酶；并且待酶流出后，立即用ph值为8的1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱至中性，也用该溶液调洗脱液至ph值至7；其中，固定化马抗体柱的制备方法包括步骤：选4匹重量在210-370公斤年龄2-12岁的蒙古马，每两周免疫一次，共进行10-16周的免疫，每次2ml，剂量分别为3-21mg脂肪酶加等量的弗氏完全佐剂，多点皮下免疫，elisa检测抗体滴度大于1：10000后收集抗血清；将抗血清离心除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用proteina或proteing亲和层析柱纯化出多克隆抗体；将多克隆抗体与活化的sepharose2b或sepharose4b连接，得到固定化马抗体柱；s4：在纯化后的脂肪酶中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀；之后离心，收集沉淀；将沉淀透析后冻干干燥，得到脂肪酶；其中，离心是在4℃、3000-5000g条件下离心5-10min。下面结合具体实施例对本发明提供的采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法作进一步说明。实施例1本实施例提供一种采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法，包括步骤：s1：将产脂肪酶的假单胞菌atcc21808的单一菌落置于装有25ml摇瓶培养液的250ml摇瓶中，在28℃、200rpm条件下培养20h，然后按10％的接种量转入发酵培养液中，在28℃、200rpm条件下培养68h，得到发酵液；其中，每升摇瓶培养液中包括：酵母提取物5g、蛋白胨5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；每升发酵培养液中包括：酵母提取物10g、蛋白胨5g、nacl0.5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；s2：将发酵液离心，收集上清液，得到脂肪酶粗酶液；其中，离心是采用高速冷冻离心机，在4℃、10800g条件下离心15min；s3：将脂肪酶粗酶液上固定化马抗体柱，上柱期间，检测流出液的脂肪酶活性，直到有脂肪酶活性流出，停止上液；之后用ph值为7.2的0.1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱，再采用ph值为3的0.1m磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的脂肪酶；并且待酶流出后，立即用ph值为8的1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱至中性，也用该溶液调洗脱液至ph值至7；其中，固定化马抗体柱的制备方法包括步骤：选4匹蒙古马(重量和对应的年龄分别为：重量为240公斤且年龄为3岁、重量为290公斤且年龄为5岁、重量为320公斤且年龄为7岁、重量为360公斤且年龄为10岁)，每两周免疫一次，共进行12周的免疫，每次2ml，剂量分别为15mg脂肪酶加等量的弗氏完全佐剂，多点皮下免疫，elisa检测抗体滴度大于1：10000后收集抗血清；将抗血清离心除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用proteina或proteing亲和层析柱纯化出多克隆抗体；将多克隆抗体与活化的sepharose2b连接，得到固定化马抗体柱；s4：在纯化后的脂肪酶中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀；之后离心，收集沉淀；将沉淀透析后冻干干燥，得到脂肪酶，酶活经测定达15-25万单位/克；其中，离心是在4℃、000g条件下离心8min。实施例2本实施例提供一种采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法，包括步骤：s1：将产脂肪酶的假单胞菌atcc21808的单一菌落置于装有25ml摇瓶培养液的250ml摇瓶中，在28℃、200rpm条件下培养16h，然后按10％的接种量转入发酵培养液中，在28℃、200rpm条件下培养60h，得到发酵液；其中，每升摇瓶培养液中包括：酵母提取物5g、蛋白胨5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；每升发酵培养液中包括：酵母提取物10g、蛋白胨5g、nacl0.5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；s2：将发酵液离心，收集上清液，得到脂肪酶粗酶液；其中，离心是采用高速冷冻离心机，在4℃、10000g条件下离心14min；s3：将脂肪酶粗酶液上固定化马抗体柱，上柱期间，检测流出液的脂肪酶活性，直到有脂肪酶活性流出，停止上液；之后用ph值为7.2的0.1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱，再采用ph值为3的0.1m磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的脂肪酶；并且待酶流出后，立即用ph值为8的1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱至中性，也用该溶液调洗脱液至ph值至7；其中，固定化马抗体柱的制备方法包括步骤：选4匹蒙古马(重量和对应的年龄分别为：重量为220公斤且年龄为2岁、重量为270公斤且年龄为4岁、重量为330公斤且年龄为8岁、重量为345公斤且年龄为9岁)，每两周免疫一次，共进行10周的免疫，每次2ml，剂量分别为3mg脂肪酶加等量的弗氏完全佐剂，多点皮下免疫，elisa检测抗体滴度大于1：10000后收集抗血清；将抗血清离心除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用proteina或proteing亲和层析柱纯化出多克隆抗体；将多克隆抗体与活化的sepharose2b连接，得到固定化马抗体柱；s4：在纯化后的脂肪酶中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀；之后离心，收集沉淀；将沉淀透析后冻干干燥，得到脂肪酶，酶活经测定达15-25万单位/克；其中，离心是在4℃、3000g条件下离心5min。实施例3本实施例提供一种采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法，包括步骤：s1：将产脂肪酶的假单胞菌atcc21808的单一菌落置于装有25ml摇瓶培养液的250ml摇瓶中，在30℃、300rpm条件下培养18h，然后按10％的接种量转入发酵培养液中，在29℃、300rpm条件下培养70h，得到发酵液；其中，每升摇瓶培养液中包括：酵母提取物5g、蛋白胨5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；每升发酵培养液中包括：酵母提取物10g、蛋白胨5g、nacl0.5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；s2：将发酵液离心，收集上清液，得到脂肪酶粗酶液；其中，离心是采用高速冷冻离心机，在4℃、11000g条件下离心16min；s3：将脂肪酶粗酶液上固定化马抗体柱，上柱期间，检测流出液的脂肪酶活性，直到有脂肪酶活性流出，停止上液；之后用ph值为7.2的0.1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱，再采用ph值为3的0.1m磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的脂肪酶；并且待酶流出后，立即用ph值为8的1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱至中性，也用该溶液调洗脱液至ph值至7；其中，固定化马抗体柱的制备方法包括步骤：选4匹蒙古马(重量和对应的年龄分别为：重量为232公斤且年龄为3岁、重量为268公斤且年龄为6岁、重量为341公斤且年龄为9岁、重量为366公斤且年龄为11岁)每两周免疫一次，共进行10周的免疫，每次2ml，剂量分别为21mg脂肪酶加等量的弗氏完全佐剂，多点皮下免疫，elisa检测抗体滴度大于1：10000后收集抗血清；将抗血清离心除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用proteina或proteing亲和层析柱纯化出多克隆抗体；将多克隆抗体与活化的sepharose4b连接，得到固定化马抗体柱；s4：在纯化后的脂肪酶中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀；之后离心，收集沉淀；将沉淀透析后冻干干燥，得到脂肪酶，酶活经测定达15-25万单位/克；其中，离心是在4℃、5000g条件下离心10min。对比例1本对比例提供一种采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法，包括步骤：s1：将产脂肪酶的假单胞菌atcc21808的单一菌落置于装有25ml摇瓶培养液的250ml摇瓶中，在28℃、200rpm条件下培养20h，然后按10％的接种量转入发酵培养液中，在28℃、200rpm条件下培养68h，得到发酵液；其中，每升摇瓶培养液中包括：酵母提取物5g、蛋白胨5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；每升发酵培养液中包括：酵母提取物10g、蛋白胨5g、nacl0.5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；s2：将发酵液离心，收集上清液，得到脂肪酶粗酶液；其中，离心是采用高速冷冻离心机，在4℃、10800g条件下离心15min；s3：将脂肪酶粗酶液上固定化马抗体柱，上柱期间，检测流出液的脂肪酶活性，直到有脂肪酶活性流出，停止上液；之后用ph值为4.8的0.1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱，再采用ph值为4的0.1m磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的脂肪酶；并且待酶流出后，立即用ph值为8的1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱至中性，也用该溶液调洗脱液至ph至7；其中，固定化马抗体柱的制备方法包括步骤：选4匹蒙古马(重量和对应的年龄分别为：重量为240公斤且年龄为3岁、重量为290公斤且年龄为5岁、重量为320公斤且年龄为7岁、重量为360公斤且年龄为10岁)，每两周免疫一次，共进行8周的免疫，每次2ml，剂量分别为15mg脂肪酶加等量的弗氏完全佐剂，多点皮下免疫，elisa检测抗体滴度大于1：10000后收集抗血清；将抗血清离心除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用proteina亲和层析柱纯化出多克隆抗体；将多克隆抗体与活化的sepharose2b连接，得到固定化马抗体柱；s4：在纯化后的脂肪酶中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀；之后离心，收集沉淀；将沉淀透析后冻干干燥，得到脂肪酶；其中，离心是在4℃、4000g条件下离心8min。对比例2本对比例提供一种采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法，包括步骤：s1：将产脂肪酶的假单胞菌atcc21808的单一菌落置于装有25ml摇瓶培养液的250ml摇瓶中，在28℃、200rpm条件下培养20h，然后按10％的接种量转入发酵培养液中，在28℃、200rpm条件下培养68h，得到发酵液；其中，每升摇瓶培养液中包括：酵母提取物5g、蛋白胨5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；每升发酵培养液中包括：酵母提取物10g、蛋白胨5g、nacl0.5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；s2：将发酵液离心，收集上清液，得到脂肪酶粗酶液；其中，离心是采用高速冷冻离心机，在4℃、10800g条件下离心15min；s3：将脂肪酶粗酶液上固定化马抗体柱，上柱期间，检测流出液的脂肪酶活性，直到有脂肪酶活性流出，停止上液；之后用ph值为7.2的0.1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱，再采用ph值为3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的脂肪酶；并且待酶流出后，立即用ph值为8的1m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱至中性，也用该溶液调洗脱液至ph至7；其中，固定化马抗体柱的制备方法包括步骤：选4匹蒙古马(重量和对应的年龄分别为：重量为240公斤且年龄为3岁、重量为290公斤且年龄为5岁、重量为320公斤且年龄为7岁、重量为360公斤且年龄为10岁)，每两周免疫一次，共进行6周的免疫，每次2ml，剂量分别为15mg脂肪酶加等量的弗氏完全佐剂，多点皮下免疫，elisa检测抗体滴度大于1：10000后收集抗血清；将抗血清离心除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用proteina亲和层析柱纯化出多克隆抗体；将多克隆抗体与活化的sepharose2b连接，得到固定化马抗体柱；s4：在纯化后的脂肪酶中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀；之后离心，收集沉淀；将沉淀透析后冻干干燥，得到脂肪酶；其中，离心是在4℃、4000g条件下离心8min。对比例3本对比例提供一种提取纯化脂肪酶的方法，包括步骤：s1：将产脂肪酶的假单胞菌atcc21808的单一菌落置于装有25ml摇瓶培养液的250ml摇瓶中，在28℃、200rpm条件下培养20h，然后按10％的接种量转入发酵培养液中，在28℃、200rpm条件下培养68h，得到发酵液；其中，每升摇瓶培养液中包括：酵母提取物5g、蛋白胨5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；每升发酵培养液中包括：酵母提取物10g、蛋白胨5g、nacl0.5g、植物油10g，余量为水；ph值为7.0；s2：将发酵液离心，收集上清液，得到脂肪酶粗酶液；其中，离心是采用高速冷冻离心机，在4℃、10800g条件下离心15min；s3：用sephadexg-100凝胶颗粒填充层析柱，以ph值为7的0.1m的中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将得到的脂肪酶粗酶液上样到层析柱上，以中性磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集活性峰所对应的洗脱液，将所得的洗脱液进行超滤浓缩，得到凝胶过滤粗酶液；将脂肪酶抑制剂作为配体通过共价键偶联到sepharose4b上，用sepharose4b填充亲和层析柱，以中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将粗酶液上样到层析柱上，以去离子水冲洗层析柱，再以0.1mph4的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的脂肪酶；s4：在纯化后的脂肪酶中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀；之后离心，收集沉淀；将沉淀干燥，得到脂肪酶；其中，离心是在4℃、6000g条件下离心10min。采用本发明实施例1至实施例3的方法提取纯化脂肪酶，得到的脂肪酶的纯度、收率、活性如下表1所示，并以采用对比例1至对比例3的方法提取纯化得到的脂肪酶作为对照。表1中，将实施例1的数据设为1，其他组别的数据为各组的数据与实施例1对应数据的比值。表1不同方法提取纯化的脂肪酶组别脂肪酶纯度脂肪酶收率脂肪酶活性实施例1111实施例298.6％99.2％99.6％实施例399.0％99.4％99.3％对比例192.5％80.5％90.3％对比例293.3％85.3％90.5％对比例360.7％62.8％70.7％除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。当前第1页12