一种高效的土壤蛋白质提取方法与流程

本发明属于蛋白质提取技术领域，具体涉及一种高效的土壤蛋白质提取方法。

背景技术：

“土壤病”的形成与土壤生态系统的变化存在着密切的关系，特别是土壤内部的微生物变化。近年来，众多学者运用biolog、dgge、plfa、t-rflp、qrt-pcr等技术研究了土壤微生物变化与“土壤病”形成的关系，然而该技术是从分子角度间接性证明土壤微生物与“土壤病”之间的关系。近年来，随着宏蛋白质组学的发展，利用土壤宏蛋白质组学技术，可以研究环境对微生物物种及其代谢的影响，更直接性反应了土壤内部的变化。然而，由于土壤环境的复杂性，限制了土壤蛋白质的提取，限制了土壤蛋白质组学的研究。因此，发明一种有效提取土壤蛋白质的方法对于土壤宏蛋白质组学的研究具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高效的土壤蛋白质提取方法，采用该方法可高效提取土壤中的蛋白质，所获得蛋白质数量多，等电点与分子量分布广。

为了达成上述目的，本发明采用的主要技术方案如下：

一种高效的土壤蛋白质提取方法：1）取新鲜土壤，加入柠檬酸-蛋白提取液单独提取，过滤，分别收集沉淀a和滤液a；2）沉淀a中加入sds蛋白提取液单独提取，过滤，分别收集沉淀b和滤液b；3）沉淀b中加入柠檬酸-蛋白提取液和sds蛋白提取液，混合提取，过滤，收集滤液c；4）：合并滤液a、滤液b和滤液c，采用tris-平衡酚富集，甲醇-乙酸铵沉淀蛋白，洗涤，冻干，即可获得土壤蛋白质。

其具体步骤如下：

1）称取新鲜土壤2～3g并置于25ml的离心管中，加入柠檬酸钠-蛋白提取液4～6ml，室温下漩涡振荡60～90s，再置于液氮中3～5min，90℃水浴3～5min,，室温下漩涡振荡30～40min，4℃下10000～12000rpm/min离心25～30min，保留沉淀a，上清过0.45μm的滤膜，得到滤液a；

2）往沉淀a中加入sds蛋白提取液4～6ml，室温下漩涡振荡30～40min，4℃下10000～12000rpm/min，离心25～30min，保留沉淀b，取上清过0.45μm的滤膜，得到滤液b；

3）往沉淀b中加入柠檬酸-蛋白提取液4～6ml，加入sds-蛋白提取液4～6ml，室温下漩涡振荡60～70min，4℃下10000～12000rpm/min离心30～35min，取上清过0.45μm的滤膜得到滤液c；

4）合并滤液a、滤液b和滤液c，加入0.2～0.25倍体积的ph为8.0的tris-平衡酚，室温下漩涡振荡10～20min，其间每隔5min，冰上静置5min，然后4℃下10000～12000rpm/min离心20～25min，取tris-平衡酚层溶液于一新的离心管中，加入4～6倍体积的甲醇-乙酸铵溶液，置于-20℃沉淀12～18h，4℃下10000～12000rpm/min离心30～35min，保留沉淀，采用预冷的甲醇溶液8～10ml洗涤沉淀，4℃下10000～12000rpm/min，离心20～25min，保留沉淀，重复三次，采用预冷的丙酮溶液8～10ml洗涤沉淀，4℃下10000～12000rpm/min离心20～25min，保留沉淀，重复三次，真空干燥，即可获得土壤蛋白质。

所述柠檬酸-蛋白提取液是采用无菌蒸馏水配制，其中柠檬酸钠浓度为0.25m，ph8.0。

所述sds蛋白提取液是采用无菌蒸馏水配制，其中sds含量1.25%，tris-hcl浓度为0.1m，ph6.8，dtt浓度为20mm。

所述甲醇-乙酸铵溶液是采用甲醇溶液配制，其中乙酸铵浓度为0.1m。

本发明采用以上技术方案，以新鲜土壤为材料，先采用柠檬酸-蛋白提取液进行第一次提取，再采用sds蛋白提取液进行第二次提取，最后采用柠檬酸-蛋白提取液和sds蛋白提取液混合提取，提取后的滤液采用tris-平衡酚进行富集，再采用甲醇-乙酸铵进行沉淀，离心收集土壤蛋白。本发明的优点在于：本发明首次采用sds蛋白提取液和柠檬酸-蛋白提取液分别单独提取后，再混合提取，将土壤中不同等电点和不同分子量的蛋白质分开提取再混合，有效获得土壤中存在的全部蛋白质。经鉴定获得的土壤蛋白质点在2741个以上，蛋白质等电点分布在3～12，分子量分布在2～681kda，本发明能够有效全面提取土壤中的蛋白质，为土壤蛋白质组学的研究提供了重要的前期基础。

附图说明

图1为实施例1提取的土壤蛋白质2d-page电泳图谱；

图2为实施例2提取的土壤蛋白质2d-page电泳图谱；

图3为实施例3提取的土壤蛋白质2d-page电泳图谱。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

柠檬酸-蛋白提取液：采用无菌蒸馏水配制，其中柠檬酸钠为0.25m，ph8；

sds蛋白提取液：采用无菌蒸馏水配制，其中sds含量1.25%，tris-hcl为0.1m，ph6.8，dtt为20mm；

甲醇-乙酸铵溶液：采用甲醇溶液配制，其中乙酸铵含量为0.1m。

1）称取混匀后的新鲜土壤2g，置于25ml的离心管中，加入4ml的柠檬酸钠-蛋白提取液，室温下漩涡振荡60s，置于液氮中3min，90℃水浴3min，室温下漩涡振荡30min，4℃下12000rpm/min离心25min，保留沉淀a，取上清过0.45μm的滤膜，收集滤液a；

2）沉淀a中加入4ml的sds蛋白提取液，室温下漩涡振荡30min，4℃下12000rpm/min离心25min，保留沉淀b，取上清过0.45μm的滤膜，收集滤液b；

3）沉淀c加入4ml柠檬酸-蛋白提取液和4mlsds-蛋白提取液，室温下漩涡振荡60min，4℃下12000rpm/min离心30min，取上清过0.45μm的滤膜，收集滤液c；

4）合并滤液a、滤液b和滤液c，加入0.2倍体积的tris-平衡酚（ph8.0），室温下漩涡振荡10min，其间每隔5min，冰上静置5min，4℃下12000rpm/min离心20min，取tris-平衡酚层溶液于一新的离心管中，加入4倍体积的甲醇-乙酸铵溶液，置于-20℃沉淀12h，4℃下12000rpm/min离心30min，保留沉淀，采用预冷的甲醇溶液8ml洗涤沉淀，4℃下12000rpm/min离心20min，保留沉淀，重复三次，采用预冷的丙酮溶液8ml洗涤沉淀，4℃下12000rpm/min离心20min，保留沉淀，重复三次，真空干燥，即可获得土壤蛋白质。

本实施例获得的土壤蛋白质经2d-page电泳后，如图1所示，土壤蛋白质图谱中蛋白质点丰富，经lc-ms/ms鉴定后，共获得土壤蛋白质点2741个，等电点分布在3～12，分子量分布在2～650kda。

实施例2

柠檬酸-蛋白提取液：采用无菌蒸馏水配制，其中柠檬酸钠为0.25m，ph8；

sds蛋白提取液：采用无菌蒸馏水配制，其中sds含量1.25%，tris-hcl为0.1m，ph6.8，dtt为20mm；

甲醇-乙酸铵溶液：采用甲醇溶液配制，其中乙酸铵含量为0.1m。

1）称取混匀后的新鲜土壤2g并置于25ml的离心管中，加入6ml的柠檬酸钠-蛋白提取液，室温下漩涡振荡90s，置于液氮中5min，90℃水浴5min，室温下漩涡振荡40min，4℃下12000rpm/min离心30min，保留沉淀a，取上清过0.45μm的滤膜，收集滤液a；

2）沉淀a加入6ml的sds蛋白提取液，室温下漩涡振荡40min，4℃下12000rpm/min离心30min，保留沉淀b，取上清过0.45μm的滤膜，收集滤液b；

3）沉淀c加入6ml柠檬酸-蛋白提取液和6mlsds-蛋白提取液，室温下漩涡振荡70min，4℃下12000rpm/min离心35min，取上清过0.45μm的滤膜，收集滤液c；

4）合并滤液a、滤液b和滤液c，加入0.25倍体积的tris-平衡酚（ph8.0），室温下漩涡振荡20min，其间每隔5min，冰上静置5min，4℃下12000rpm/min离心25min，取tris-平衡酚层溶液于一新的离心管中，加入6倍体积的甲醇-乙酸铵溶液，置于-20℃沉淀18h，4℃下12000rpm/min离心35min，保留沉淀，采用预冷的甲醇溶液10ml洗涤沉淀，4℃下12000rpm/min离心25min，保留沉淀，重复三次，采用预冷丙酮溶液10ml洗涤沉淀，4℃下12000rpm/min离心25min，保留沉淀，重复三次，真空干燥，即可获得土壤蛋白质。

本实施例获得的土壤蛋白质经2d-page电泳后，如图2所示，土壤蛋白质图谱中蛋白质点丰富，经lc-ms/ms鉴定后，共获得土壤蛋白质点2853个，等电点分布在3～12，分子量分布在2～681kda。

实施例3

柠檬酸-蛋白提取液：采用无菌蒸馏水配制，其中柠檬酸钠为0.25m，ph8；

sds蛋白提取液：采用无菌蒸馏水配制，其中sds含量1.25%，tris-hcl为0.1m，ph6.8，dtt为20mm；

甲醇-乙酸铵溶液：采用甲醇溶液配制，其中乙酸铵含量为0.1m。

1）称取混匀后的新鲜土壤3g，置于25ml的离心管中，加入5ml的柠檬酸钠-蛋白提取液，室温下漩涡振荡90s，置于液氮中5min，90℃水浴5min，室温下漩涡振荡40min，4℃下12000rpm/min离心30min，保留沉淀a，取上清过0.45μm的滤膜，收集滤液a；

2）沉淀a加入6ml的sds蛋白提取液，室温下漩涡振荡40min，4℃下12000rpm/min离心30min，保留沉淀b，取上清过0.45μm的滤膜，收集滤液b；

3）沉淀b加入5ml柠檬酸-蛋白提取液和5mlsds-蛋白提取液，室温下漩涡振荡70min，4℃下12000rpm/min离心35min，取上清过0.45μm的滤膜，收集滤液c；

4）合并滤液a、滤液b和滤液c，加入0.25倍体积的tris-平衡酚（ph8.0），室温下漩涡振荡20min，其间每隔5min，冰上静置5min，4℃下12000rpm/min离心25min，取tris-平衡酚层溶液于一新的离心管中，加入6倍体积的甲醇-乙酸铵溶液，置于-20℃沉淀18h，4℃下12000rpm/min离心35min，保留沉淀，采用预冷的甲醇溶液10ml洗涤沉淀，4℃下12000rpm/min离心25min，保留沉淀，重复三次，采用预冷的丙酮溶液10ml洗涤沉淀，4℃下12000rpm/min离心25min，保留沉淀，重复三次，真空干燥，即可获得土壤蛋白质。

本实施例获得的土壤蛋白质经2d-page电泳后，如图3所示，土壤蛋白质图谱中蛋白质点丰富，经lc-ms/ms鉴定后，共获得土壤蛋白质点2804个，等电点分布在3～12，分子量分布在2～674kda。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。