本发明涉及天然药物，具体涉及从植物怒江冷杉(abiesnukiangensis)中分离得到的新化合物怒江冷杉三萜a和b、其制备方法及其在抗丙型肝炎病毒药物、保健食品中的应用。
背景技术：
冷杉属(abies)植物在全世界约有50种，主要分布于亚洲、欧洲、北美、中美及非洲北部的高山地带。中国的冷杉属植物有19种3变种，主要分布于东北、华北、西北和西南的高海拔地带。现代研究表明，该属植物的化学成分表现出了多样的生物活性，包括昆虫保幼活性、抗肿瘤、抗菌、抗溃疡、止咳及治疗中枢神经系统方面一些疾病的活性等。
怒江冷杉(abiesnukiangensis)，主产于我国云南西北部怒江、澜沧江流域海拔2500-3100。鉴于冷杉属植物化学成分的生物活性，本发明人对怒江冷杉进行了系统的化学研究，发现其中两种三萜类化合物具有良好的抗丙型肝炎病毒的活性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供新的具有抗丙型肝炎病毒活性的化合物，具体涉及新的怒江冷杉三萜a和怒江冷杉三萜b，其提取制备方法，及其在医药、保健食品和食品中的应用。
本发明提供(从怒江冷杉中提取分离得到)两种新的怒江冷杉三萜类化合物，分别命名为怒江冷杉三萜a和怒江冷杉三萜b，其化学结构式如下：
本发明所述化合物的物理性质和波谱数据如下所述：
本发明的新化合物怒江冷杉三萜a和怒江冷杉三萜b均为白色粉末状物质，高分辨质谱测得精密质量数分别为469.3320[m+h]+和471.3474[m+h]+，推算出怒江冷杉三萜a和怒江冷杉三萜b的分子式为c30h44o4和c30h46o4。这两种化合物的结构通过核磁共振波谱1h-nmr和13c-nmr及单晶衍射等方法确定。1h-nmr(cdcl3，400mhz)和13c-nmr(cdcl3，100mhz)核磁数据见表1。
表1怒江冷杉三萜a和怒江冷杉三萜b的核磁数据
本发明还提供所述怒江冷杉三萜类化合物的制备方法，该方法包括：
(1)提取：将怒江冷杉干燥枝叶粉碎，用选自70-100％乙醇水溶液、70-100％甲醇水溶液或80-100％丙酮水溶液的溶剂a回流提取，合并提取液，并减压浓缩得到流浸膏，所述流浸膏加水稀释后，用选自氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯的溶剂b萃取，萃取液减压浓缩得到萃取物；以及
(2)分离：将所得萃取物经过硅胶柱层析，按洗脱次序分别收集含有所述化合物的流分，各流分再经羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，最后经反相c18柱层析洗脱得到所述怒江冷杉三萜a和怒江冷杉三萜b。
在一实施方式中，所述溶剂a为70-100％乙醇水溶液、70-100％甲醇水溶液或80-95％丙酮水溶液。
在一实施方式中，70-100％乙醇水溶液包括但不限于70％乙醇水溶液，75％乙醇水溶液，80％乙醇水溶液，85％乙醇水溶液，90％乙醇水溶液，95％乙醇水溶液，97％乙醇水溶液，98％乙醇水溶液，99％乙醇水溶液，或100％乙醇水溶液。
在一实施方式中，70-100％甲醇水溶液包括但不限于70％甲醇水溶液，75％甲醇水溶液，80％甲醇水溶液，85％甲醇水溶液，90％甲醇水溶液，95％甲醇水溶液，97％甲醇水溶液，98％甲醇水溶液，99％甲醇水溶液，或100％甲醇水溶液。
在一实施方式中，80-100％丙酮水溶液包括但不限于80％丙酮水溶液，85％丙酮水溶液，90％丙酮水溶液，95％丙酮水溶液，97％丙酮水溶液，98％丙酮水溶液，99％丙酮水溶液，或100％丙酮水溶液。
在本发明中，术语“70-100％乙醇水溶液”是指70-100％乙醇水溶液中乙醇的含量为70-100％。术语“70％乙醇水溶液”是指70％乙醇水溶液中乙醇的含量为70％。术语“100％乙醇水溶液”是指100％乙醇水溶液中乙醇的含量为100％，即是指乙醇，可与“乙醇”互换使用。
在本发明中，术语“70-100％甲醇水溶液”是指70-100％甲醇水溶液中甲醇的含量为70-100％。术语“70％甲醇水溶液”是指70％甲醇水溶液中甲醇的含量为70％。术语“100％乙醇水溶液”是指100％乙醇水溶液中甲醇的含量为100％，即是指甲醇，可与“甲醇”互换使用。
在本发明中，术语“80-100％丙酮水溶液”是指80-100％丙酮水溶液中丙酮的含量为80-100％。术语“80％丙酮水溶液”是指80％丙酮水溶液中丙酮的含量为70％。术语“100％丙酮水溶液”是指100％丙酮水溶液中丙酮的含量为100％，即是指丙酮，可与“丙酮”互换使用。
在一实施方式中，使用所述溶剂a回流提取一或多次(优选1-5次，较优选1-3次)，每次1-3h，优选2-3h。
在一实施方式中，所述溶剂a的体积用量是所述怒江冷杉干燥枝叶重量的5-20倍。
在一实施方式中，所述流浸膏加水稀释时加入的水的用量是所述流浸膏量的1-3倍(v/w)。在一实施方式中，所述溶剂b的体积用量是经稀释的流浸膏溶液体积的0.5-2倍。
在一实施方式中，使用所述溶剂b进行萃取的次数是2-4次。
在一实施方式中，所述萃取物经所述硅胶柱层析时使用体积比100:0-10:1的氯仿/甲醇系统梯度洗脱，收集的含所述化合物的所述流分经羟丙基葡聚糖凝胶柱层析时使用体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂进行洗脱，以及经反相c18柱层析时使用体积比6:4-9:1的甲醇/水进行梯度洗脱。
在一实施方式中，所述怒江冷杉三萜a和怒江冷杉三萜b的提取分离方法包括以下步骤：
(1)提取：将怒江冷杉干燥枝叶粉碎，用优选5-20倍量(v/w)的选自70-100％乙醇水溶液、70-100％甲醇水溶液或80-100％丙酮水溶液的溶剂a回流提取(一或多次，优选1-5次，较优选1-3次，每次1-3h，优选2-3h)，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏(流浸膏相当于1ml含怒江冷杉0.8-1.2g)，流浸膏加水1-3倍量(v/v)稀释后，用0.5-2倍量(v/v)的选自氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯的溶剂b萃取(一或多次，优选2-5次，较优选2-4次，或3-5次)，萃取液经减压浓缩得到萃取物。
(2)分离：将上述萃取物应用硅胶柱层析，以体积比100:0-10:1的氯仿/甲醇系统梯度洗脱，(薄层层析检测)，按洗脱次序分别收集含有上述化合物的流分，各流分分别经羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂洗脱，最后经反相c18柱层析，以体积比6:4-9:1的甲醇/水进行梯度洗脱，(薄层层析检测)，得到怒江冷杉三萜a和怒江冷杉三萜b。
本发明还提供一种药物组合物，其包含作为活性成分的如上所述的怒江冷杉三萜a、怒江冷杉三萜b或二者的混合物，以及药用辅料。
本发明化合物可作为活性成分与药用辅料根据本领域常规方法制成药物组合物。
本发明化合物可进一步制备抗丙型肝炎病毒药物或制剂，包括口服药物和注射剂等剂型的多种抗hcv药物。
本发明还提供怒江冷杉三萜a、怒江冷杉三萜b或所述怒江冷杉三萜a联合所述怒江冷杉三萜b在制备抗丙型肝炎病毒(hcv)药物中的应用。
在本发明中，术语“v/w”表示体积与重量的比，术语“v/v”表示体积与体积的比。
本发明通过体外建立的细胞培养来源的丙型肝炎病毒，利用hcv易感染细胞人肝癌huh7细胞系，对怒江冷杉三萜a和b的抗hcv活性进行了体外实验。结果发现，怒江冷杉三萜a和b具有显著的抗hcv活性，可用于制备抗丙肝病毒的药物。本发明为寻找抗丙型肝炎病毒药物提供了新的来源。
本发明还提供所述怒江冷杉三萜a、所述怒江冷杉三萜b、或所述怒江冷杉三萜a联合所述怒江冷杉三萜b在制备保肝的食品或保肝的保健食品中的用途。
具体实施方式
在下列说明中，为了提供对本发明的彻底了解而提出许多具体细节。本发明可在不具有部分或所有这些具体细节的情况下实施。在其他情况下，为了不对本发明造成不必要的混淆，不详述众所周知的过程操作。虽然本发明将结合具体实施例来进行说明，但应当理解的是，这并非旨在将本发明限制于这些实施例。
实施例1
将怒江冷杉干燥枝叶5kg粉碎，以70％乙醇40l回流提取2次，每次2h，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏相当于1ml含怒江冷杉0.8g，流浸膏加水6l稀释后，以氯仿4l萃取2次，萃取液经减压浓缩得到氯仿萃取物。
将上述氯仿萃取物应用硅胶柱层析，以体积比100:0-10:1的氯仿/甲醇系统梯度洗脱，薄层层析检测，按洗脱次序分别收集流分，各流分经羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂洗脱，最后经反相c18柱层析，以体积比6:4-9:1的甲醇/水进行梯度洗脱，薄层层析检测，得到怒江冷杉三萜a21mg和怒江冷杉三萜b38mg。
实施例2
将怒江冷杉干燥枝叶6kg粉碎，以80％甲醇60l回流提取3次，每次3h，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏相当于1ml含怒江冷杉0.9g，流浸膏加水5l稀释后，以二氯甲烷4l萃取3次，萃取液经减压浓缩得到二氯甲烷萃取物。
将上述二氯甲烷萃取物应用硅胶柱层析，以体积比100:0-10:1的氯仿/甲醇系统梯度洗脱，薄层层析检测，按洗脱次序分别收集流分，各流分经羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂洗脱，最后经反相c18柱层析，以体积比6:4-9:1的甲醇/水进行梯度洗脱，薄层层析检测，得到怒江冷杉三萜a24mg和怒江冷杉三萜b36mg。
实施例3
将怒江冷杉干燥枝叶15kg粉碎，以100％甲醇90l回流提取4次，每次3h，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏相当于1ml含怒江冷杉1.0g，流浸膏加水8l稀释后，以二氯甲烷6l萃取2次，萃取液经减压浓缩得到二氯甲烷萃取物。
将上述二氯甲烷萃取物应用硅胶柱层析，以体积比100:0-10:1的氯仿/甲醇系统梯度洗脱，薄层层析检测，按洗脱次序分别收集流分，各流分经羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂洗脱，最后经反相c18柱层析，以体积比6:4-9:1的甲醇/水进行梯度洗脱，薄层层析检测，得到怒江冷杉三萜a36mg和怒江冷杉三萜b45mg。
实施例4
将怒江冷杉干燥枝叶15kg粉碎，以90％乙醇80l回流提取3次，每次2h，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏相当于1ml含怒江冷杉1.2g，流浸膏加水8l稀释后，以二氯甲烷8l萃取2次，萃取液经减压浓缩得到二氯甲烷萃取物。
将上述二氯甲烷萃取物应用硅胶柱层析，以体积比100:0-10:1的氯仿/甲醇系统梯度洗脱，薄层层析检测，按洗脱次序分别收集流分，各流分经羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂洗脱，最后经反相c18柱层析，以体积比6:4-9:1的甲醇/水进行梯度洗脱，薄层层析检测，得到怒江冷杉三萜a49mg和怒江冷杉三萜b51mg。
实施例5
将怒江冷杉干燥枝叶8kg粉碎，以90％丙酮60l回流提取3次，每次2h，合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，流浸膏相当于1ml含怒江冷杉1.1g，流浸膏加水8l稀释后，以乙酸乙酯6l萃取2次，萃取液经减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物。
将上述乙酸乙酯萃取物应用硅胶柱层析，以体积比100:0-10:1的氯仿/甲醇系统梯度洗脱，薄层层析检测，按洗脱次序分别收集流分，各流分经羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以体积比为1:1的氯仿/甲醇混合溶剂洗脱，最后经反相c18柱层析，以体积比6:4-9:1的甲醇/水进行梯度洗脱，薄层层析检测，得到怒江冷杉三萜a19mg和怒江冷杉三萜b23mg。
实施例6抗丙肝病毒实验
一、实验药物、试剂及材料
(1)受试化合物：怒江冷杉三萜a和怒江冷杉三萜b是根据本发明前述方法从怒江冷杉中提取制备得到。将怒江冷杉三萜a和怒江冷杉三萜b分别用dmso配制成浓度为10mm的样品初始溶液。
(2)细胞系huh7.5.1，人肝癌细胞株衍生细胞系huh7.5.1(可通过市售途径获得)
(3)细胞系huh7,人肝癌细胞系huh7。
(4)dmem细胞培养液，其含10％胎牛血清、0.03％谷氨酰胺、非必需氨基酸、氨苄青霉素和链霉素100u/ml，调ph至7.4。(可通过市售途径获得)
(5)细胞消化液，其含0.25％胰蛋白酶，用磷酸缓冲液配制(可通过市售途径获得)。
(6)j6/jfh-1嵌合hcv全长hcv基因组转录质粒：由海军军医大学生物医学防护实验室提供；第二军医大学学报，2018，39(12),1302-1308亦公开了该质粒，可由洛克菲勒大学charlesrice教授馈赠。
二、实验方法：
(一)细胞感染性丙型肝炎病毒(hcvcc)的制备
1.病毒扩增
取50μlj6/jfh-1嵌合hcv全长hcv基因组转录质粒感染接种于24孔板的huh7.5.1细胞，次日更换dmem培养液，随后根据细胞生长密度(采用细胞消化液和dmem细胞培养液)传代培养，观察细胞生长状态，待病毒快速增殖导致的细胞病变效应(cpe)出现后，收集第7—20天的培养上清，取适量hcvcc上清液用于病毒滴度测定，其余8000rpm离心5min弃细胞碎片后分装保存于-70℃备用。
2.病毒滴定
以空白huh7.5.1细胞(1×104cells/孔)铺设于96孔板，孵育12h后，弃培养上清，每孔加入100μl经10梯度稀释的hcvcc上清液，共孵育5h，换新鲜dmem全培养液继续培养72h，采用免疫荧光法检测hcv阳性细胞，一抗用1:100稀释的hcv抗体阳性病人血清，二抗为1:100稀释的fitc标记羊抗人igg。在荧光显微镜下观察发光细胞，并记录最后一个可观察到绿色荧光阳性细胞的孔内绿色荧光阳性细胞数及相应的稀释梯度，计算出focusformingunit/ml(ffu/ml)数值，以此代表hcvcc滴度。
(二)本发明化合物对hcvcc感染性的影响的检测
取处于对数生长期的人肝癌huh7细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml,取100μl接种96孔板，培养24h后药物组加入制备的hcvcc上清液及一系列稀释的受试化合物,使受试化合物终浓度分别为0.01,0.1,1,5,10,20,50μm，空白对照组加入等量的dmso及制备的hcvcc上清液，37℃培养4小时后去除化合物及hcvcc混液，换培养基继续培养；48h后进行免疫荧光检测，在荧光显微镜下读取各孔hcvcc阳性克隆数。
(三)结果
表2怒江冷杉三萜a和b对细胞培养来源的丙肝病毒(hcvcc)的抑制活性
注：“/”表示空白对照样品dmso对hcv无抑制作用。
表2结果表明，本发明的怒江冷杉三萜a和怒江冷杉三萜b具有显著的抗丙型肝炎病毒活性。因此，可用于制备抗丙型肝炎病毒的药物和保肝的食品或保健食品。
本发明通过体外建立的细胞培养来源的丙型肝炎病毒(hcvcc),利用hcv易感染细胞人肝癌huh7细胞系，对怒江冷杉三萜a和b的抗hcv活性进行了体外实验。结果发现，怒江冷杉三萜a和b具有显著的抗hcv活性，故可用于制备抗丙型肝炎病毒的药物。
本发明不受上面所显示和描述的实施例的限制，而是在权利要求的范围内可以改变。