一种促进拟茎点霉产生大量分生孢子的方法与流程

本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种促进拟茎点霉产生大量分生孢子的方法。

背景技术：

拟茎点霉属(phomopsis)属半知菌亚门、腔孢纲、球壳孢目、球壳孢科，其种类多、分布广，有900多个种，大多分布在亚热带、热带。可寄生于70多种不同科的草本和木本植物，引起大量作物的严重病害，同时，该属中部分种也是植物内生真菌，活性次级代谢产物非常丰富，可用于抗菌、抗肿瘤、抗炎等，这些代谢产物有着广泛的应用前景。拟茎点霉属一般产生甲乙两型分生孢子，其中甲型(初生孢子)：单孢、直和通常含两个油球，常为椭圆状；乙型(次生孢子)：单胞、线形、不含油球、直和一端常为钩状。但不少在寄主植物上未见乙型分生孢子，或在某些条件下不产生乙型或甲型分生孢子。这给鉴定及分类带来一定的难度。由于真菌纯培养条件下的形态特征是真菌分类鉴定的重要手段，因此，研究拟茎点霉的产孢条件优化至关重要。

关于拟茎点霉属的产孢优化条件，国内外已有一些研究发现。louisemorin(1990)在研究旋花拟茎点霉时发现，该菌在大麦粒培养基可形成大量分生孢子[morinl.1990.productionofconidiabyphomopsisconvolvulus.canadianjournalofmicrobiology36(2)：86-91]。罗利娟研究8种拟茎点霉纯培养下的产孢条件，发现pda培养基上菌丝生长较快，但形成载孢体较慢。同时此研究也发现光照时间过长会导致载孢体被淹没于菌丝中。

目前，近几年关于拟茎点霉属真菌的产孢优化研究较少。其中产孢条件冗长，培养基组成较复杂，耗时较长，很难同时提高产孢速率及产孢数量，对实验的开展造成一定困难。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种促进拟茎点霉产生大量分生孢子的方法，以期实现由传统pda培养即可实现获得大量分生孢子。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种促进拟茎点霉产生大量分生孢子的方法，步骤如下：

1)采用pda培养基在固体平板上活化拟茎点霉菌种，获得到菌丝体；

2)采用打孔法取步骤1)的菌丝体接种于装有pda培养基的培养皿中，置于黑暗培养箱培养；

3)待拟茎点霉菌丝长满整个培养基，成白色，絮状后，转移至黑光灯下或黑暗培养条件下，继续培养，产生大量分生孢子，总分生孢子产量不小于1.0×10¹¹个/皿。

步骤1)中，将保存于4℃冰箱内拟茎点霉取出，用取菌环挑取0.5cm直径菌块，移入固体平板pda中进行活化，置于25℃黑暗培养箱培养5天，菌丝体铺满整个pda培养基，菌落成白色，絮状。

步骤2)中，采用打孔法，取直径为0.5cm的菌块接种于pda培养基中，置于25℃黑暗培养箱培养5天。

步骤2)中，培养皿为直径为9厘米的塑料皿，培养基的厚度为0.4cm。

步骤3)中，待拟茎点霉菌丝长满整个培养基，成白色，絮状后，转移至黑光灯下，20℃，培养6天。

步骤3)中，在已经产孢子的培养基中加入无菌水3ml浸满整个菌丝体，用无菌枪头将整个菌丝体从培养基中刮下来，通过无菌水溶解，分离出来，重复两至三遍，确保整个培养基菌丝体完全分离出培养基，制备粗孢子液，将滤膜折叠成一侧3层，另一侧1层模式，放入漏斗中，将粗孢子液进行过滤，提取过滤后的孢子液，稀释至合适倍数，用血球计数板计数孢子数。

血球板计数法记录孢子数：取一块洁净干燥的血球计数板，盖上干净的盖玻片，将孢子液震荡均匀后用移液枪吸取10μl菌悬液从血球计数板两槽处滴加菌悬液，待菌悬液浸满计数室，静置5min后镜检计数，在40倍放大倍数下计数，统计分生孢子数量，取平均值。

步骤3)中，黑光处理后于培养皿可见明显的孢子堆，平均孢子堆数量达到10⁹个/皿，每个孢子堆所含孢子数平均达到5.6×10⁹个。

步骤3)中，总分生孢子产量达1.5×10¹¹个/皿，其中甲型孢子数：1.4×10¹¹个/皿，乙型孢子数：1.1×10¹⁰个/皿。

有益效果：与现有技术相比，本发明的促进拟茎点霉产生大量分生孢子的方法，以塑料培养皿结合黑光处理条件，使得培养皿可见明显的孢子堆，平均孢子堆数量达到10⁹个/皿，每个孢子堆所含孢子数平均达到5.613×10⁹个，总分生孢子产量达1.502×10¹¹个/皿，其中甲型孢子数(圆球)：1.39×10¹¹个/皿，乙型孢子数(杆状)：1.12×10¹⁰个/皿。产生了大量乙型孢子，可生长速率远远大于以往拟茎点霉的产孢子方法，且实现了基于传统的pda培养方式获得大量分生孢子，具有很好的实用性和先进性。

附图说明

图1是黑光处理后于培养皿可见明显的孢子堆图；左图为黑光条件培养6天，右图为黑暗条件培养6天；

图2是不同培养基厚度培养结果图；左图为0.4cm培养6天，右图为0.6cm培养6天；

图3是不同材料培养皿培养结果图；左图为玻璃材质培养10天，右图为塑料材质培养10天；

图4是不同光照条件培养结果图；左图为日光培养10天，中间图为黑暗培养10天，右图为黑光(近紫外光)培养10天；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例中所使用的pda培养基，配方为：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000ml，ph值自然。

以下实施例中所使用的拟茎点霉菌种，为[王勇，吴小芹.苏北杨树溃疡病类型及其病原的致病力[j].南京林业大学学报(自然科学版)，2008，32(5)]中公开的拟茎点霉(phomopsismacrospore)，社会公众可以获得。

实施例1

一种促进拟茎点霉产生大量分生孢子的方法，包括将拟茎点霉菌种活化、固体培养基上得到菌丝体和分生孢子血球计数等步骤，具体过程如下：

1)拟茎点霉菌种活化：将保存于4℃冰箱内拟茎点霉取出，将保存于4℃冰箱内拟茎点霉(phomopsismacrospore)取出，用取菌环挑取0.5cm直径菌块，移入固体平板pda中进行活化，置于25℃黑暗培养箱培养5天，待其菌丝体铺满整个pda培养基，菌落成白色，絮状。则进行下一步实验。

2)将上一步在固体培养基上获得到菌丝体，采用打孔法，取直径为0.5cm的菌块接种于装有pda培养基的培养皿中(培养皿是直径为9厘米的塑料皿，pda培养基的厚度0.4cm)，置于25℃黑暗培养箱培养5天。

3)待拟茎点霉菌丝长满整个培养基，成白色，絮状后，转移至黑光灯下，20℃，培养6天。

4)总孢子液的提取：在已经产孢子的培养基中加入无菌水3ml浸满整个菌丝体，用无菌枪头将整个菌丝体从培养基中刮下来，通过无菌水溶解，分离出来，重复两至三遍，确保整个培养基菌丝体完全分离出培养基，制备粗孢子液，将滤膜折叠成一侧3层，另一侧1层模式，放入漏斗中，将粗孢子液进行过滤，提取过滤后的孢子液。稀释至合适倍数，用血球计数板计数孢子数。

5)血球板计数法记录孢子数：取一块洁净干燥的血球计数板，盖上干净的盖玻片，将孢子液震荡均匀后用移液枪吸取10μl菌悬液从血球计数板两槽处滴加菌悬液，待菌悬液浸满计数室，静置5min后镜检计数。在40倍放大倍数下计数，统计分生孢子数量，取平均值。

黑光处理后于培养皿可见明显的孢子堆(图1)，平均孢子堆数量达到10⁹个/皿。每个孢子堆所含孢子数平均达到5.613×10⁹个。总分生孢子产量达1.502×10¹¹个/皿，其中甲型孢子数(圆球)：1.39×10¹¹个/皿，乙型孢子数(杆状)：1.12×10¹⁰个/皿。

实施例2

一种促进拟茎点霉产生大量分生孢子的方法，具体步骤如下：

1)拟茎点霉菌种活化：将保存于4℃冰箱内拟茎点霉取出，用取菌环挑取0.5cm直径菌块，移入固体平板pda中进行活化，置于25℃黑暗培养箱培养5天，待其菌丝体铺满整个pda培养基，菌落成白色，絮状。

2)将上一步在固体培养基上获得到菌丝体，采用打孔法，取直径为0.5cm的菌块接种于装有pda培养基的培养皿中，置于25℃黑暗培养箱培养5天；其中，培养皿为直径为9厘米的塑料皿，培养基的厚度为0.4和0.6cm。

3)待拟茎点霉菌丝长满整个培养基，成白色，絮状后，置于25℃黑暗培养箱培养6天。

4)总孢子液的提取：在上述培养基中加入无菌水3ml浸满整个菌丝体，用无菌枪头将整个菌丝体从培养基中刮下来，通过无菌水溶解，分离出来，重复两至三遍，确保整个培养基菌丝体完全分离出培养基，制备粗孢子液，将滤膜折叠成一侧3层，另一侧1层模式，放入漏斗中，将粗孢子液进行过滤，提取过滤后的孢子液。稀释至合适倍数，用血球计数板计数孢子数。

5)血球板计数法记录孢子数：取一块洁净干燥的血球计数板，盖上干净的盖玻片，将孢子液震荡均匀后用移液枪吸取10μl菌悬液从血球计数板两槽处滴加菌悬液，待菌悬液浸满计数室，静置5min后镜检计数。在40倍放大倍数下计数，统计分生孢子数量，取平均值。

0.4cm处理后培养皿见(图2)，总分生孢子产量达3.53×10¹⁰个/皿，其中甲型孢子数：3.53×10¹⁰个/皿，乙型孢子数为：0个/皿。

0.6cm处理后培养皿见的(图2)，总分生孢子产量达1.75×10¹⁰个/皿，其中甲型孢子数：1.75×10¹⁰个/皿，乙型孢子数为：0个/皿。

实施例3

一种促进拟茎点霉产生大量分生孢子的方法，具体步骤如下：

1)拟茎点霉菌种活化：将保存于4℃冰箱内拟茎点霉取出，用取菌环挑取0.5cm直径菌块，移入固体平板pda中进行活化，置于25℃黑暗培养箱培养5天，待其菌丝体铺满整个pda培养基，菌落成白色，絮状。

2)将上一步在固体培养基上获得到菌丝体，采用打孔法，取直径为0.5cm的菌块接种于装有pda培养基的培养皿中，置于25℃黑暗培养箱培养5天；其中，培养皿为直径为9厘米的塑料皿或玻璃皿，pda培养基厚度0.4cm。

3)待拟茎点霉菌丝长满整个培养基，成白色，絮状后，置于25℃黑暗培养箱培养10天。

4)总孢子液的提取：在上述培养基中加入无菌水3ml浸满整个菌丝体，用无菌枪头将整个菌丝体从培养基中刮下来，通过无菌水溶解，分离出来，重复两至三遍，确保整个培养基菌丝体完全分离出培养基，制备粗孢子液，将滤膜折叠成一侧3层，另一侧1层模式，放入漏斗中，将粗孢子液进行过滤，提取过滤后的孢子液。稀释至合适倍数，用血球计数板计数孢子数。

5)血球板计数法记录孢子数：取一块洁净干燥的血球计数板，盖上干净的盖玻片，将孢子液震荡均匀后用移液枪吸取10μl菌悬液从血球计数板两槽处滴加菌悬液，待菌悬液浸满计数室，静置5min后镜检计数。在40倍放大倍数下计数，统计分生孢子数量，取平均值。

塑料培养皿中可见明显的孢子堆(图3)，总分生孢子产量达2.75×10¹⁰个/皿，其中甲型孢子数：2.50×10¹⁰个/皿，乙型孢子数为2.5×10⁹个/皿。

玻璃处理后于培养皿见(图3)总分生孢子产量达6.60×10⁹个/皿，其中甲型孢子数为6.60×10⁹，乙型孢子数：0个。

实施例4

一种促进拟茎点霉产生大量分生孢子的方法，具体步骤同实施例2，其中，步骤2)中的培养皿为塑料培养皿。步骤3)中，分别转移至黑光灯下照射24h/天，黑暗条件下，及白光灯下照射24h/天，培养10天。

黑光处理后培养皿可见(图4)总分生孢子产量达7.33×10¹¹个/皿，其中甲型孢子数：5.62×10¹¹个/皿，乙型孢子数为：1.71×10¹¹个/皿。

黑暗处理后培养皿可见(图4)，总分生孢子产量达4.977×10¹⁰个/皿，其中甲型孢子数(圆球)：4.73×10¹⁰个/皿，乙型孢子数为(杆状)2.475×10⁹个/皿。

光照处理后培养皿可见(图4)，总分生孢子产量达9.41×10⁹个/皿，其中甲型孢子数：8.08×10¹⁰个/皿，乙型孢子数为：1.33×10¹⁰个/皿。