一种抗微囊藻毒素-LR单克隆抗体的制备方法与流程

本发明属于免疫检测领域，具体地，涉及一种抗微囊藻毒素-lr单克隆抗体的制备方法。

背景技术：

我国是世界上藻灾最为严重的国家之一，藻毒素严重威胁居民饮水安全和食品安全。我国主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素(microcystin，mc)，微囊藻毒素是淡水蓝藻产生的一类生物活性物质，能够对人体多个器官产生危害，危害最严重的靶器官是肝脏，长时间低剂量接触mcs会导致肝损伤和诱发癌症。有研究表明，我国肝癌多发区与当地水中高含量的微囊毒素有关；mcs引发的急性肝中毒症状表现为肝细胞损伤、肝出血。目前已经分离出80多种mcs的异构体，其中microcystin-lr(mc-lr)是目前毒性最大、存在最广泛、研究最多的一种，也是我国最常见的微囊藻毒素种类。目前mc-lr被定为检测微囊藻毒素污染的指标。为了降低mcs对人和水生动物的毒性及潜在危害性。世界卫生组织(who)推荐水中微囊藻毒素的安全指导值mc-lr是1000ng·l^–1。

我国淡水微囊藻毒素污染严重，但迄今为止尚没有一种较合适于现场使用的藻毒素检测方法。传统的藻毒检测方法主要有色谱检测、生物检测、细胞检测，这些检测技术或是需要昂贵的仪器、或是需要较长的检测时间、或是准确率不够，不能满足现场快速检测要求。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题的至少一个，本发明提供一种抗微囊藻毒素-lr单克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：

1)将edc和nhs溶解于dmf中形成第一溶液；

2)将微囊藻毒素-lr溶于乙腈中形成第二溶液；

3)将步骤1)所述的第一溶液与步骤2)所述的第二溶液混合，置于低温活化，得到活化液；

4)将步骤3)所述的活化液滴加到bsa溶液中，室温反应后，超滤收集沉淀，利用pbs重悬，得到完全抗原；

5)利用步骤4)得到的完全抗原免疫小鼠，免疫成功后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合；

6)利用完全抗原通过间接elisa方法对杂交瘤细胞株进行筛选；

7)将筛选得到的杂交瘤细胞接种小鼠，从腹水中纯化抗体。

在本发明的一些实施方案中，所述第一溶液为将0.045mgedc和0.06mgnhs溶解于0.01mldmf中得到的。

在本发明的一些实施方案中，所述第二溶液为将0.15mg微囊藻毒素-lr溶于0.05ml乙腈中得到的。

在本发明的一些实施方案中，在步骤3中，所述第一溶液与所述的第二溶液混合后，进一步包括搅拌的过程。

在本发明的一些实施方案中，步骤4)中所述bsa溶液为0.4mgbsa溶于0.15ml、0.15mol/ml、ph值为9.3的碳酸盐缓冲液中得到的。

在本发明的一些实施方案中，步骤4)中将活化液滴加到bsa溶液中后，室温反应时间为4-10h。

在本发明的一些具体实施方案中，室温反应时间为5h。

在本发明的一些实施方案中，超滤过程利用超滤管5000r/min离心15min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述超滤管截留分子质量为30000u。

在本发明的又一些具体实施方案中，超滤共进行3次，每次沉淀用pbs重悬。

在本发明的又一些具体实施方案中，所述pbs的浓度为0.01mol/ml。

在本发明的一些实施方案中，在步骤5)中，进一步包括对免疫成功的小鼠进行加强免疫的过程。

在本发明的一些具体实施方案中，第三次基础免疫7天后，尾静脉采血间接elisa方法测效价，完全抗原为包被原，小鼠血清梯度稀释，空白balb/c小鼠血清做阴性对照。取效价高的加强免疫，尾静脉注射100μg完全抗原。

本发明的有益效果

利用本发明的方法制备的抗体特异性强、敏度高、不需要复杂仪器，便于制成试剂盒或试剂条，使用更方便，便于推广，经济有效，适用于产业化生产。

附图说明

图1示出了间接竞争elisa标准曲线。

图2示出了抗体亲和常数曲线。

图3示出了抗体交叉反应结果。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例1杂交瘤细胞株的制备

材料和方法：

1.材料

mc-lr标准品，购于大连众信检测技术有限公司。牛血清白蛋白(bsa)、n-羟基丁二酰亚胺(nhs)、n-乙基-n'-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(edc)、二甲基甲酰胺(dmf)等，购于sigma公司；辣根过氧化物酶(hrp)标记山羊抗鼠igg，购于博士德生物公司；乙腈，购于山东禹王实业有限公司；超滤管(截留分子质量30000u)，购于德国millipore公司；tmb底物显色液，购于starbio公司。

balb/c健康小鼠(8周龄和12周龄以上，分别用于免疫和腹水制备)购自中国科学院实验动物中心研究所。小鼠骨髓瘤细胞sp2/0由本实验室保存。

2.完全抗原制备

1)将0.045mgedc和0.06mgnhs溶解于0.01mldmf中。

2)将上述溶液加到含有0.15mgmc-lr的0.05ml乙腈溶液中，室温搅拌反应1h。

3)4℃活化反应过夜。

4)将活化液缓慢滴加到0.4mgbsa中(溶于0.15ml、0.15mol/ml、ph值为9.3的碳酸盐缓冲液中)，室温反应5h。

5)用超滤管(截留分子质量30000u)5000r/min离心15min，收集滤液，使用0.01mol/mlpbs重悬，反复超滤3次，最后使用pbs重悬至偶联物蛋白浓度为4mg/ml。

3.动物免疫试验

适量完全抗原与等体积完全福氏佐剂混合，完全孵化，取5只8周龄雌性balb/c小鼠，颈背部皮下3点，四肢腋(腘)皮下，以及腹腔注射，每只小鼠注射孵化后抗原500μl(相当于每只小鼠免疫抗原100μg)。14天后，适量完全抗原与等体积不完全福氏佐剂混合，完全孵化后皮下多点及腹腔注射抗原，按此法每14天免疫一次。第三次基础免疫7天后，尾静脉采血间接elisa方法测效价，完全抗原为包被原，小鼠血清梯度稀释，空白balb/c小鼠血清做阴性对照。取效价高的加强免疫，尾静脉注射100μg完全抗原，3d后取脾脏融合。

4.细胞融合与阳性杂交瘤细胞的筛选

无菌取免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的sp2/0骨髓瘤细胞以5︰1体积比混合，按常规方法进行融合，融合剂为50％的peg2000。离心收集融合细胞，用含hat的imdm培养基(含15％胎牛血清)重悬细胞。将新鲜的饲养细胞同融合细胞充分混匀后，加到96孔细胞培养板内，37℃，5％co2培养。待融合细胞生长到培养孔面积的1/3-1/2时，采用间接elisa方法分步筛选杂交瘤细胞，以1μg·ml^–1完全抗原包被酶标板孔，加入被测孔的培养上清液，筛选阳性孔(p/n>2.1)，然后对阳性孔的上清液作做特异性筛选。强阳性孔上清液做1/3，1/9，1/37稀释，弱阳性孔不稀释，完全抗原浓度10ng·ml^–1，判断50ng·ml^–1mc-lr对od值的影响。经2-3次检测抑制率均高的孔，用有限稀释法进行克隆化。经过三次亚克隆后全部纯化，建株液氮保存。

实施例2单抗的纯化与性能评价

取3只12周龄雄性balb/c小鼠，腹腔注射灭菌降植烷0.5ml，每只腹腔注射0.5ml细胞液。7d后腹腔接种对数生长期的杂交瘤细胞，每鼠1×10⁶个细胞，待小鼠腹部膨大，频临死亡时，采集腹水，离心取上清，分别用硫酸铵沉淀法和亲和层析柱纯化腹水，进行sds-page电泳，并用间接elisa测定效价。

1.抗体效价测定

将抗体浓度调整到1mg·ml^–1，再用pbs做倍比稀释，采取间接elisa方法测定其效价。倍比稀释的细胞上清液及腹水为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg为二抗。同时设阴性、空白和阳性对照

2.抗体灵敏度检测

将mc-lr标准品分别稀释为30、20、10、5、1、0μg·l^–1，分别取各浓度标准品溶液50μl和血清稀释液50μl加入酶标板孔内，竞争反应2h。其余步骤与间接elisa法相同，测定od值，计算达到50％抑制率时的mc-lr质量浓度值(ic50值)，确定单抗对mc-lr的亲和性。抑制率的计算公式如下：抑制率＝(1-od450sam/od450max)×100％，其中，od450sam表示竞争性孔的od值，od450max表示未加mc-lr抑制的孔的od值。

3.抗体亲和常数的测定

用间接elisa来测定抗体的功能性亲和常数k。将包被抗原按2倍稀释成2、1、0.5、0.25μg·ml^–14个浓度梯度，包被酶标板，每孔100μl；将抗体稀释成1︰2000，再作2倍梯度稀释，共12个梯度，每孔100μl。利用间接elisa测定各个包被浓度下的结合反应曲线，利用曲线计算抗体的亲和常数。亲和常数计算公式如下：ka＝(n–1)/2(n[ab']t-[ab]t)，其中，n＝[ag']t/[ag]t，[ag']t和[ag]t为不同包被抗原的浓度，[ab']t和[ab]t是对应不同包被抗原的浓度下，将抗体梯度稀释得到最大吸光度一半处的抗体浓度(mol·l^–1)。

4.抗体交叉反应率

实验方法同前述，用mc-lr的同系物microcystin-rr(mc-rr)、microcystin-yr(mc-yr)、microcystin-lw(mc-lw)以及河豚毒素代替mc-lr测定四种毒素的ic50，然后根据以下公式计算交叉反应率：cr＝(ic50，mc-lr)/(ic50，x)，其中x为四种毒素

5.单抗亚型分析

采用invitrogen公司小鼠单克隆抗体亚型快速鉴定试剂盒，按说明书方法操作。

结果：

1.免疫鼠多抗血清效价和特异性分析

1.1免疫鼠多抗血清效价

三次免疫后，用间接elisa方法对免疫小鼠产生的抗体进行了效价检测，5只小鼠效价均达到1：18000以上，可以进行融合实验。取效价最高的小鼠加强免疫，三天后融合。

1.2阳性杂交细胞的筛选及特异性分析

融合7天后，取上清液间接elisa检测效价及特异性。结果，融合率100％，得到强阳性孔64个，弱阳性孔112个。经特异性检测后，4个孔有明显抑制，编号分别为dk1、dk5、dk16、dk82。对4个孔进行亚克隆及复检，经4次亚克隆及复检后，dk5、dk82完全纯化，100％阳性。对dk5、dk82多次传代、冻存及复苏，杂交瘤细胞分泌抗体仍然稳定。

2.抗体性质分析与评估

2.1抗体效价测定

将dk5、dk82培养后注射小鼠生产抗体，纯化后间接elisa测定抗体效，测定方法同。将抗体浓度调整到1mg·ml^–1，再用pbs按1：10000，1：20000……做2倍稀释，检测结果两细胞株抗体效价均达1：8×10⁴。

2.2灵敏度检测

以吸光率b/b0(b是mc-lr不同标准浓度的od值，b0是mc-lr标准浓度的od值)为纵坐标，以mc-lr不同浓度×10的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，见图1，误差线为n＝3次平行实验的标准偏差，实验重复性良好，相对标准偏差(变异系数)均在10％以内，曲线呈现明显的反s型。曲线采用四参数的logistic模型拟合，软件采用origin7.0，由拟合参数可以分析：半抑制浓度ic50＝(0.81±0.05)μg·l^–1；检测限lod＝0.10-8.00μg·l^–1；定量检测区间：lqd为0.20-4.00μg·l^–1。

2.3亲和常数的测定

本发明采用间接elisa来测定抗体的功能性亲和常数k。结果如图2所示。横坐标为经过纯化的抗mc-lr单克隆抗体的稀释倍数，纵坐标为吸光度，各曲线表示不同浓度包被抗原。按上述公式计算，计算出每个浓度对应的亲和常数，其平均值即为抗体的亲和常数，根据计算，亲和常数为4.2×10⁸l·mol^–1。

2.4亚型分析

采用小鼠单克隆抗体亚型快速鉴定试剂盒分析，抗体亚型为igg3。

2.5交叉性反应

分别测试了抗体与微囊藻毒素-lr、微囊藻毒素-yr、微囊藻毒素-rr、微囊藻毒素-lw以及河豚毒素的交叉反应性，半抑制浓度结果列于表1，结果表明，所获得的单克隆抗体对第四位氨基酸为精氨酸的微囊藻毒素(如mc-yr和mc-rr)有较强的交叉反应性；并且与第四位氨基酸为非精氨酸的微囊藻毒素(如mc-lw)也有较弱的交叉反应，交叉反应率大于10％；与河豚毒素没有反应。

表1交叉反应

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。