一种多肽QK-17及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种多肽qk-17及其应用。

背景技术：

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，仅次于心血管疾病，每年死于癌症的患者约占总死亡人数的1/4，且中国占相当庞人的病例数。药物治疗是当今治疗肿瘤的主要手段之一，但目前的抗肿瘤药物不良反应较大。对此，寻找新型高效低毒的抗肿瘤药物一直是国内外医药研发的热点。随着免疫和分子生物学的发展，以及生物技术与多肽合成技术的成熟，人们发现多肽类药物不仅毒性低、活性高、易于吸收，还可以通过提高机体免疫功能抑制肿瘤的生长和转移，增强抗肿瘤作用，因此，越来越多的多肽药物被开发并成用于临床。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种多肽qk-17及其应用。具体技术方案如下：

第一方面，本发明首先提供了一种多肽qk-17或其药学上可接受的盐，所述多肽qk-17的氨基酸序列是与seqidno:1相比具有14/17以上序列一致性的氨基酸序列。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述多肽qk-17的氨基酸序列是与seqidno:1相比具有15/17以上或16/17以上序列一致性的氨基酸序列。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述多肽qk-17的氨基酸序列qknikknkgvkgwlwwk(seqidno:1)。

在本发明第一方面的一些实施方式中，所述盐为醋酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、草酸盐或酒石酸盐。

第二方面，本发明还提供了前述的多肽qk-17或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的用途。

在本发明第二方面的一些实施方式中，所述肿瘤为前列腺癌或乳腺癌。

在本发明第二方面的一些实施方式中，所述的多肽qk-17或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.006-2mg/kg体重。

在本发明第二方面的一些实施方式中，所述的多肽qk-17或其药学上可接受的盐经胃肠外施用。

第三方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括前述的多肽qk-17或其药学上可接受的盐，以及药学上接受的载体。

在本发明第三方面的一些实施方式中，所述载体选自水或胶体溶液；优选地，所述胶体溶液为透明质酸凝胶。

优选地，所述药物组合物是通过注射给药；更优选地，所述注射给药包括玻璃体注射、皮下注射或静脉注射。

经实验验证，本发明实施例提供的多肽qk-17具有抗肿瘤作用，而且多肽qk-17长17个氨基酸，具有易于合成、成本低廉。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a、图1b、图1c及图1d分别为多肽qk-17对lncap、pc3、mda-mb-231及4t1-luc这4种肿瘤细胞增殖能力的影响，当p<0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义，显著差异水平设定为**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，与对照组相比；顺铂为阳性药；

图2a、图2b、图2c及图2d分别为经多肽qk-17处理后，lncap、pc3、mda-mb-231及4t1-luc这4种肿瘤细胞的生长曲线；

图3a为多肽qk-17对mda-mb-231细胞凋亡的影响；图3b为多肽qk-17作用后对mda-mb-231细胞凋亡的统计学分析；当p<0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义，显著差异水平设定为*p<0.05，****p<0.0001，与对照组相比；顺铂为阳性药。

图4a为多肽qk-17对mda-mb-231细胞周期的影响；图4b为多肽qk-17作用24h后对mda-mb-231细胞周期影响的统计学分析；当p<0.05时认为有显著性水平差异，具有统计学意义，显著差异水平设定为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与对照组相比；顺铂为阳性药；

图5a、图5b及图5c分别表示为多肽qk-17作用后的肿瘤小鼠的肿瘤体积、肿瘤小鼠体重及肿瘤小鼠的存活率，阿霉素为阳性药。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明下述各实施例所用的多肽均为多肽qk-17，其氨基酸序列为qknikknkgvkgwlwwk(seqidno:1)。多肽qk-17可以采用常规固相工艺合成；本发明对其合成方法不进行限定。在本发明中，多肽qk-17合成于上海淘普生物科技有限公司，纯度大于98％，储存于-20℃，现用现配。

本发明下述各实施例所用的主要试剂如下表1所示

表1

本发明下述各实施例所用的细胞株及其培养方法如下：

前列腺癌lncap、pc3细胞株，乳腺癌mda-mb-231、4t1-luc细胞株均来自atcc由本实验室传代保存。lncap培养于1640(无酚红)培养基，pc3培养于1640培养基，mda-mb-231、4t1-luc培养于dmem培养基，含10％灭活胎牛血清，含1％青霉素及链霉素，37℃，5％co2孵育。

实施例1qk-17对肿瘤细胞增殖能力的影响

将lncap、pc3、mda-mb-231、4t1-luc细胞分别以每孔1500-3500个细胞接种于96孔板中，每组设3个复孔，pc3、mda-mb-231、4t1-luc孵育24h，lncap孵育48h；待细胞贴壁后分别加入不同摩尔浓度的多肽，培养24h、48h、72h，然后每孔加入10μlcck-8试剂，继续孵育2-4h，然后用酶标仪(生产商：tecan公司；型号：spark)测量每孔细胞在450nm波长下的od值，按公式1计算细胞活力，其中48h的计算结果分别如图1a、图1b、图1c及图1d所示；获得细胞生长曲线，如图2a-图2d所示。其中，lncap、pc3细胞对应的多肽的浓度分别为10^-3mol/l，6×10^-4mol/l，4×10^-4mol/l，2×10^-4mol/l；mda-mb-231、4t1-luc细胞对应的多肽的浓度分别为10^-3mol/l，6×10^-4mol/l，4×10^-4mol/l，2×10^-4mol/l，10^-4mol/l；顺铂的浓度为10μm；对照组不含药物。公式1如下所示：

细胞活力％＝[od(给药)-od(空白)]/[od(对照)-od(空白)]×100

od(给药)：具有细胞、cck8溶液和药物(多肽或顺铂)溶液的孔的吸光度；

od(空白)：具有培养基和cck溶液而没有细胞的孔的吸光度；

od(对照)：具有细胞、cck溶液而没有药物(多肽或顺铂)溶液的孔的吸光度。

从图1a-图1d中可以看出多肽qk-17对前列腺细胞系lncap、pc3，乳腺癌细胞系mda-mb-231、4t1-luc的细胞增殖能力有明显的抑制作用，且具有剂量依赖性，随着浓度的增大，细胞活力值降低。由从图2a-图2d中细胞的生长曲线发现，在相同浓度下，在不同的时间点，qk-17的抑制作用不同。随着时间的延长，其抑制作用几乎均增强，说明qk-17的抗肿瘤作用具有时间依赖性。

实施例2流式细胞仪检测细胞凋亡

将mda-mb-231细胞分别以每孔2×10⁵个细胞接种于六孔板中，孵育24h待细胞贴壁后加入2ml220μm的多肽(给药组)、10μm的顺铂(阳性药)、培养基(对照组)，培养48h后收获细胞。用1×bindingbuffer重悬细胞，37℃孵育10min，1000rpm离心5min，再用1×bindingbuffer制备成单细胞悬液，转移至ep管中，每管100μl。每个ep管加入5μlfitc-annexinv，室温避光孵育30分钟。加入5μlpropidiumiodide，室温避光孵育5分钟，上流式细胞仪检测细胞凋亡；结果如图3a-图3b所示。

在annexinv-fitc/pi双染法中，q1象限代表机械性损伤细胞，q2象限代表晚期凋亡细胞，q3象限代表早期凋亡细胞，q4象限代表阴性正常细胞。通过计算q2、q3象限可以研究细胞凋亡。从图3a和图3b中可以看出，经多肽qk-17处理后，细胞的凋亡率高于对照组，p<0.05，有统计学意义，说明qk-17可以诱导mda-mb-231发生细胞凋亡。

实施例3流式细胞仪检测细胞周期

将mda-mb-231细胞分别以每孔3×10⁵个细胞接种于六孔板中，孵育24h待细胞贴壁后分别加入2ml220μm的多肽(给药组)、10μm的顺铂(阳性药)、培养基(对照组)，分别培养24h后收获细胞。pbs洗涤细胞一次后，将细胞重悬在pbs中，一边涡旋，一边逐滴加入预冷的无水乙醇，乙醇浓度在75％左右，置于-20℃固定过夜。固定的细胞，1500rpm，4℃离心10min，预冷的pbs洗涤细胞一次后，加入rna酶至浓度为10μg/ml，37℃孵育30min。再加入pi使其终浓度为50μg/ml，4℃孵育避光30min，上流式细胞仪检测细胞周期，结果如图4a、图4b所示。

通过图4a、图4b可以发现qk-17处理后，与对照组相比，处于g1/g0期的细胞数量减少，处于s期的细胞数量增多，说明qk-17可以引起mda-mb-231发生细胞周期阻滞，细胞大多阻滞于s期。

实施例4动物实验

6-8周龄的balb/c小鼠(斯贝福(北京)生物技术有限公司；scxk(京)2019-0004)，雄性，饲养于spf级环境中，温度保持在22～25℃，湿度保持在50％左右，饮用水、饲料及实验用品均经灭菌消毒。取对数生长期的4t1-luc细胞，pbs洗涤，经胰酶消化制成单细胞悬液，离心，接着无血清培养液离心洗涤两次，用不含血清的dmem培养基重悬制成单细胞悬液，接种于小鼠腋下，10⁶个细胞/每只小鼠。待小鼠肿瘤大小达到100mm³左右，将接种成功的小鼠随机分为对照组、实验组和阳性药组，对照组小鼠皮下注射0.2mlpbs；实验组小鼠皮下注射0.2ml多肽溶液(0.47mg多肽溶于0.2mlpbs中)；阳性药组小鼠皮下注射0.2ml阿霉素溶液(5mg/kg)。三组给药间隔均为五天一次，共三次。用微型卡钳测量肿瘤体积，并记录小鼠体重，每三天一次；实验结果如图5a-图5c所示。

通过图5a，可以发现与模型组相比，qk-17可以显著降低肿瘤小鼠的肿瘤体积，说明qk-17可以抑制肿瘤的生长；由图5b，图5c发现qk-17可以增加肿瘤小鼠的体重，提高肿瘤小鼠的存活率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110>天津中医药大学

<120>一种多肽qk-17及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

glnlysasnilelyslysasnlysglyvallysglytrpleutrptrp

151015

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