一种新的二萜糖酯类化合物的制备方法及其用途与流程

本发明涉及香蕉枯萎病菌抑制剂制备技术领域，特别是涉及一种新的二萜糖酯类化合物的制备方法及其用途。

背景技术：

香蕉是人们普遍爱吃的热带水果，也是重要的经济作物和粮食作物。广西是我国香蕉的主要产地，种植面积和产量均位居全国第二。香蕉枯萎病，由尖孢镰刀菌古巴专化型(fusariumoxysporumf.sp.cubense)侵染引起的破坏维管束、导致植株死亡的毁灭性真菌性土传病害，该病原菌有4个生理小种，其中4号生理小种危害最大，几乎感染所有类型的香蕉品种。香蕉枯萎病的防控已成为广西香蕉产业急需解决的重要问题。

在防控香蕉枯萎病的方法中，药物防治是最有效的方法。为了防止香蕉枯萎病的蔓延，寻找防治香蕉枯萎病安全低毒有效的抗菌剂，对香蕉产业的发展有非常重要的现实意义。2015年，杨妙在《广西香蕉主要病害及防治方法》中发现在抗菌剂的筛选过程中，没有筛选到高效的化学药物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的二萜糖酯类化合物的制备方法及其用途，对香蕉枯萎病菌具有抑制作用。

为实现上述目的，本发明提供了一种新的二萜糖酯类化合物，其化学通式为(i)式所示的化合物：

一种新的二萜糖酯类化合物的制备方法，步骤如下：

s1、发酵培养青霉菌h1(penicilliumsp.h1)，并获得青霉菌h1的发酵产物，发酵产物中含式i的化合物；

s2、从含式i的发酵物中分离纯化出得到二萜糖酯类化合物。

优选的，步骤s2的分离纯化流程如下：

(1)将步骤s1获得的发酵产物浓缩后制得浸膏，并通过减压硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，将洗脱液收集、浓缩后经tlc检测合并得到6个流分，并记为fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.5、fr.6；

(2)fr.3经过反相硅胶柱色谱(甲醇/水系统，10％～100％，体积分数)梯度洗脱后，将洗脱液收集、浓缩后经tlc检测合并得到5个流分fr.3.1、fr.3.2、fr.3.3、fr.3.4、fr.3.5；

(3)fr.3.1采用甲醇凝胶色谱洗脱，收集、浓缩后经tlc检测合并得到3个流分fr.3.1.1、fr.3.1.2、fr.3.1.3；

(4)fr.3.1.1采用硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯(3∶1～1∶1)梯度洗脱纯化得到二萜糖酯类化合物。

优选的，步骤(1)中石油醚-乙酸乙酯进行洗脱的梯度如下，体积分数比为10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2。

一种新的二萜糖酯类化合物在农药中的用途，在制备香蕉枯萎病菌抑制剂的农药中应用。

本发明采用纸片法测试了式i所示新的二萜糖酯类化合物对香蕉枯萎病菌的抑菌活性。实验证实，二萜糖酯类化合物对香蕉枯萎病菌的mic值为32.0μg·ml-1，此类化合物对香蕉枯萎病菌具有抑制作用，因此，本发明的式i二萜糖酯类化合物可用作香蕉枯萎病菌抑制剂。

下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1是本发明一种新的二萜糖酯类化合物的制备方法及其用途中二萜糖酯类化合物的¹h-¹hcosy、hmbc、roesy相关性示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施方式做进一步的说明。

本发明利用青霉菌h1(penicilliumsp.h1)，保藏于广西高校微生物与植物资源利用重点实验室，保藏地址为广西民族大学，保藏日期为2018.6.26，保藏编号为mdcw-50。

青霉菌h1(penicilliumsp.h1)菌株具有如下形态学特征：菌落呈淡绿色，不透明，表面比较干燥，呈现粉末状，与青霉属的形态类似，与penicilliumsp.的形态特征相一致。该青霉菌h1(penicilliumsp.h1)菌株具有如下分子生物学特征：其18srrna基因序列信息为：

一种新的二萜糖酯类化合物，其化学通式为(i)式所示的化合物：

一种新的二萜糖酯类化合物的制备方法，步骤如下：

s1、发酵培养青霉菌h1(penicilliumsp.h1)，并获得青霉菌h1的发酵产物，发酵产物中含式i的化合物；

s2、从含式i的发酵物中分离纯化出得到二萜糖酯类化合物。

步骤s2的分离纯化流程如下：

(1)将步骤s1获得的发酵产物浓缩后制得浸膏，并通过减压硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，将洗脱液收集、浓缩后经tlc检测合并得到6个流分，并记为fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.5、fr.6；

步骤(1)中石油醚-乙酸乙酯进行洗脱的梯度如下，体积分数比为10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2。

(2)fr.3经过反相硅胶柱色谱(甲醇/水系统，10％～100％，体积分数)梯度洗脱后，将洗脱液收集、浓缩后经tlc检测合并得到5个流分fr.3.1、fr.3.2、fr.3.3、fr.3.4、fr.3.5；

(3)fr.3.1采用甲醇凝胶色谱洗脱，收集、浓缩后经tlc检测合并得到3个流分fr.3.1.1、fr.3.1.2、fr.3.1.3；

(4)fr.3.1.1采用硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯(3∶1～1∶1)梯度洗脱纯化得到二萜糖酯类化合物。

一种新的二萜糖酯类化合物在植物病原菌抑制剂的用途，在制备香蕉枯萎病菌抑制剂的农药中应用。

实施例一

一种新的二萜糖酯类化合物，其化学通式为如下所示的化合物：

一种新的二萜糖酯类化合物的制备方法，步骤如下：

s1、发酵培养青霉菌h1(penicilliumsp.h1)，并获得青霉菌h1的发酵产物，发酵产物中含式i的化合物；

将菌株penicilliumsp.h1接种在pda培养基中，28℃培养箱中培养3d，将培养好的菌株接种于灭菌后的200ml大米培养液(大米80g，nacl6.6g，自来水120ml)的锥形瓶(1000ml)中，28℃静置培养30d，发酵规模为10l。

s2、从含式i的发酵物中分离纯化出得到二萜糖酯类化合物。

将步骤s1的发酵产物浓缩后制得浸膏进行减压硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯(体积分数10∶1，8∶1，6∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2)梯度洗脱，收集、浓缩后经tlc检测合并得到6个流分(fr.1-fr.6)。fr.3(1.1g)经过反相硅胶柱色谱(甲醇/水系统，10％～100％，体积分数)梯度洗脱后，收集、浓缩后经tlc检测合并得到5个流分fr.3.1-3.5。fr.3.1(108mg)采用甲醇凝胶色谱洗脱，收集、浓缩后经tlc检测合并得到3个流分fr.3.1.1-3.1.3。fr.3.1.1(19mg)采用硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯(3∶1～1∶1)梯度洗脱纯化得到二萜糖酯类化合物(2.6mg)。

(1)二萜糖酯类化合物的1h-1hcosy、hmbc、roesy相关性，如图1。

(2)二萜糖酯类化合物，白色粉末，[α]²⁵d+84(c0.1，meoh)。uv(meoh)λmax(logε):207(3.63)nm。阳离子高分辨质谱hresims在m/z573.2325给出准分子离子峰[m+na]⁺；¹h及¹³cnmr数据见下表。

二萜糖酯类化合物的¹h和¹³cnmr数据(500and125mhzincd3od)

(3)抗香蕉枯萎病活性的测试

a.实验样品及实验方法

抑菌活性测试采用药敏纸片法和二倍稀释法。将香蕉枯萎病菌涂布到ypd培养基(葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、琼脂20g，自来水1l)上。吸取样品10μl于无菌滤纸片上，待纸片干燥后将其贴于培养基上，倒置于28℃培养箱中，培养时间为12～24h，观察有无抑菌圈产生。致病菌真菌的阳性药是酮康唑。对有活性的化合物继续以二倍稀释法测定其最小抑制浓度(mic)。

b.实验结果：化合物1对香蕉枯萎病菌具有中等的抑制活性，mic为32.0μg·ml-1(阳性药酮康唑的mic为2.0μg·ml-1)。

因此，本发明采用上述新的二萜糖酯类化合物的制备方法及其用途，对香蕉枯萎病菌具有抑制作用。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。