运用硅藻土澄清细胞发酵液的方法与流程

本发明涉及生物领域，特别是涉及运用硅藻土澄清细胞发酵液的方法。
背景技术：
：细胞培养液经过一段时间的摇床培养，出现大量代谢产物，称为细胞发酵液。目前的蛋白质药物多数是通过哺乳动物细胞表达，尤其是在药物前期研发阶段，需要进行大量的备选蛋白质表达筛选。由于所需蛋白为分泌型蛋白，蛋白质会分泌到细胞培养液中，因此在进行蛋白质纯化前，需要对细胞发酵液进行澄清，去除培养液中的残余细胞和细胞碎片，以便于后续通过液相色谱进行蛋白质纯化。目前澄清细胞发酵液常用的做法是通过离心、过滤去除细胞和细胞碎片。而离心步骤的准备工作包括：首先，将离心机专用的离心杯用0.5mnaoh浸泡处理30分钟以上，以防污染，再用超纯水将naoh清洗干净备用。然后将发酵液倒入准备好的离心杯中，并使每个离心杯的重量相同。按照常用的离心条件，每台离心机一次可以离心6个离心杯的量，处理量约为6l，调节目标转速10,000g，需时30分钟。离心结束后，取出发酵液进行过滤，1l样品通常需要使用2个滤杯才能过滤完全。现有的澄清方法有以下缺点：1、操作复杂繁琐，且涉及强碱操作，具有一定的危险性；2、离心杯每次使用都需要进行清洗，增加了操作步骤，且由于离心机转速达10,000g，高转速影响离心杯的使用寿命，有一定破碎的风险，因此需要经常换新，然而离心杯价格昂贵，增加了生产成本；3、样品转移过程中易发生两个样品混淆的情况，离心过程中易发生离心杯破碎，则样品需要重新发酵，增加生产时间和成本；4、离心耗时长，且处理量小，因此限制了高通量处理；5、离心方法对蛋白质和细胞碎片的分离效果欠佳，增加了过滤的时间和所需耗材成本；6、离心机属于大型设备，采购费用高，操作过程中易损坏，维护成本高。技术实现要素：本发明提供一种运用硅藻土澄清细胞发酵液的方法，其主要目的在于提供一种操作更加快速、高效、简便，效果佳的澄清方法，作为现有离心澄清方法的替代。为达前述目的，本发明提供一种运用硅藻土澄清细胞发酵液的方法，包括步骤：步骤一，将细胞发酵液与硅藻土充分混合均匀，静置3-5分钟；步骤二，将步骤一中的混合物倒入真空过滤器的滤杯，进行真空抽滤，收集滤液；具体的，所述硅藻土符合国家标准，二氧化硅含量大于90％，细度为200-300目，内毒素含量小于1eu/g，渗透率0.2-5d(达西)。所述硅藻土加入的量是根据细胞类型和细胞密度加入相应重量的所述硅藻土，对于3x106-8x106个/升的细胞密度，硅藻土的用量为30g/l-50g/l。作为一个具体的实例，对于细胞类型为cho(chinesehamsterovarycell)细胞，密度为3x106-8x106个/升的细胞发酵液，按40g/l加入所述硅藻土。作为一个具体的实例，对于细胞类型为293细胞，密度为3x106-8x106个/升的细胞发酵液，按45g/l加入所述硅藻土。具体的，所述真空过滤器装有0.22μmpes膜。具体的，所述真空抽滤的压力为0.2-0.5bar。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、硅藻土无毒无腐蚀性成分安全且吸附力强，整个过程无危险性操作，操作简单安全；2、省去了离心步骤，节省了相应的耗材和成本；3、操作更高效省事，且能够应对高通量处理；4、澄清效果对样品和收率纯度和蛋白的糖基化类型与现有方法相当。附图说明图1离心澄清纯化样品和硅藻土澄清纯化样品sds-page蛋白质电泳胶图：1离心澄清纯化样品非还原电泳分析，2离心澄清纯化样品还原电泳分析，3硅藻土澄清纯化样品还原电泳分析，4硅藻土澄清纯化样品非还原电泳分析，m蛋白质分子量标准品；图2离心澄清纯化样品和硅藻土澄清纯化样品hplc分析结果；图3离心澄清纯化样品和硅藻土澄清纯化样品lc-ms分析结果。具体实施方式下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。一、样品制备：1.在cho细胞中表达蛋白质分子a，a为抗体蛋白。采用瞬时转染方式，表达体积为2l，培养10天；培养结束时，细胞密度为5x106个/升；平均分装，使每瓶有1l细胞发酵液。2-1其中1l细胞发酵液采用本发明的方法澄清：a.往所述1l细胞发酵液加入40g硅藻土；b.充分混合均匀，静置3-5分钟；c.真空泵连接pes膜过滤器，将静置后的混合物再次混合均匀，一次性倒入过滤器内，打开真空泵，进行真空抽滤，抽滤压力为0.2-0.5bar；d.待抽滤完成，关闭真空泵，取下过滤器，紧闭收集瓶盖。2-2另外的1l采用现有的离心、过滤方法澄清：a.0.5mnaoh浸泡处理离心机专用离心杯30分钟，再用超纯水清洗备用；b.倒1l发酵液至清洗过的离心杯，调节目标转速10,000g，离心30分钟；c.离心结束后，取出发酵液进行过滤(过程中需更换一次过滤器)。二、用时对比对于1个1l发酵液样品的处理，按照现有方法，离心以及准备步骤需要至少1小时，过滤需要15分钟，总耗时至少为75分钟；而按照本发明的方法，将硅藻土与发酵液混合后需要静置3-5分钟，对1l的发酵液进行真空抽滤约需3分钟，总耗时少于10分钟。另外，对于高通量处理需求而言，例如：48个1l发酵液样品的处理，对于一台处理量是每次6个1l样品的离心机，共需进行离心8次，离心总耗时约为240分钟；将48l的发酵液样品根据体积按比例增加硅藻土用量，混合后静置3-5分钟，以1l为单位进行真空抽滤，若使用一个真空管道，则总用时约为150分钟；若有更多的真空管道，则可同时真空抽滤多个样品，则所需时间更短。三、效果对比试验主要试剂：1mlmabselectsure，pbs,醋酸主要仪器：aktapure分别取“样品制备”中的按两种不同方式澄清的所得样品各100ml，分别使用1mlmabselectsure在aktapure上进行平行纯化，并分别收集洗脱液样本。(1)检测浓度产量计算收率。使用thermonanodrop(微量分光光度计)分别检测两洗脱液样本的a280(即在280nm处的吸光值)，按照如下计算公式得出所述两洗脱液样本的浓度、产量、收率；浓度(mg/ml)＝a280/蛋白质消光系数；产量(mg)＝浓度(mg/ml)*体积(ml)；收率＝实际产量/检测产量*100％；(使用高效液相色谱仪，采用液固吸附色谱法对两洗脱液样本的色谱吸收峰进行积分，计算出目的蛋白的含量，即检测含量)根据以上格式得出结果如下表：浓度(mg/ml)体积(ml)产量(mg)收率(％)离心澄清方法3.275.517.9990.86硅藻土澄清方法3.265.517.9390.55(2)sds-page分析根据蛋白质电泳的现有技术的标准操作方法，准备还原和非还原样品，还原样品加入dtt后95℃加热5分钟，非还原样品加入iam；然后将还原样品、非还原样品、蛋白质分子量标准品分别加入胶孔内，电压180v电泳50分钟。结束后，将胶取出进行染色脱色，拍照分析。结果见图1，以蛋白质分子量标准品为参照，1和4泳道的条带分子量大小一致，2和3泳道分离的条带分子量大小一致，一一对应；且条带清晰，无杂带；本发明的方法与离心澄清方法所得样品的纯度基本一致。(3)hplc分析使用安捷伦高效液相色谱仪进行分析，色谱柱为tsk3000，上样量10微升，每个样品分析时间15分钟。结果见图2，左侧为离心澄清纯化样品，右侧为硅藻土澄清纯化样品。图中6.8min左右的小峰为聚体峰，分子量较大；8min左右的大峰为单体峰，即目的蛋白峰；表格中area％表示纯度。由结果可知两样本的单体含量基本一致，本发明的方法与离心澄清方法所得样品的纯度基本一致。(4)lc-ms分析结果见图3，左侧为离心澄清纯化样品，右侧为硅藻土澄清纯化样品。图中数值是样品中蛋白质的实际分子量，经过与理论分子量比较则可知其糖基化类型。由结果可以看出两样本的糖基化类型一致，分子量一致。综合分析结果表明，本发明的样品澄清方法，对样品和收率纯度和蛋白的糖基化类型没有影响，可以替代传统的离心澄清过程。综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。当前第1页12