针对多种登革病毒亚型的新疫苗的制作方法

发明领域

本发明涉及改进的登革疫苗、用于诱导针对登革病毒的免疫反应和用于预防性地和/或治疗性地针对登革病毒免疫个体的改进的方法。

背景

登革病毒(denv)是一种新出现的引起登革热(df)和严重的威胁生命的疾病登革出血热/登革休克综合征(dhf/dss)的蚊媒病原。denv是一种小的、包膜的正链rna病毒，它属于黄病毒科(flaviviridae)家族的黄病毒属。登革病毒的四种不同的亚型或血清型(dv-1到dv-4)通过蚊种埃及伊蚊(aedesaegypti)和白纹伊蚊(aedesalbopictus)的叮咬传播给人类。据估计每年出现5千万至1亿的df病例和250,000至500000的dhf病例。登革成为了巨大的国际公共卫生问题，因为世界人口的五分之二生活在登革的流行区域并且每年出现估计5千万至1亿的登革感染病例。此外，在不存在有效干涉的情况下，在世界的亚热带和热带区域，25亿人处在感染的危险之下。

超过100个热带国家具有流行性登革病毒感染，并且已证明dhf在大于60个这些国家中存在。在大多数国家缺乏对df/dhf的监视并且过去主要集中于dhf；因此只能估计每年出现的df病例的数目。然而在1998年，主要的流行病发生遍及亚洲和美国，其中向世界卫生组织(who)报告了大于120万例df/dhf病例。dhf的全球报告在过去20年内已平均增加五倍。在21世纪初，根据流行病活性，估计每年出现5千万至1亿的df病例和几十万dhf病例。病死率(cfr)在国家之间有差异，但是在一些国家可以高达10–15％而在另一些国家<1％。

存在四种登革病毒亚型：登革1型(dv-1)、登革2型(dv-2)、登革3型(dv-3)和登革4型(dv-4)。这些亚型中的每一个在黄病毒家族内形成抗原上不同的亚类。它们是编码十种蛋白的包膜的rna病毒：三种结构蛋白和七种非结构蛋白。所述结构蛋白是衣壳(c)、包膜(e)和预膜前体(prem)。dv的生命周期开始于受体介导的病毒进入细胞的胞吞作用，接着病毒的包膜蛋白与晚期内含体膜融合，这导致病毒的基因组释放到细胞质中复制。

dv感染可能无症状或者以发热、寒战、额痛、肌痛、关节痛和疹为特征。随后感染不同的血清型可导致包括血浆渗漏或出血(登革出血热)和休克(登革休克综合征)的更为严重的疾病表现。虽然多年来已进行广泛研究来了解denv感染的病原性，但在特效的抗dv化合物的研制上没有取得什么进展。目前在美国没有批准的针对登革感染的特定抗病毒剂或疫苗。

包膜(e)糖基化蛋白是成熟的登革病毒粒子表面上存在的主要结构蛋白，是一种i型整合膜蛋白。已证明成熟登革病毒的e蛋白以反向平行方式(头到尾方向)形成同型二聚体。每个单体被折叠成三种不同的结构域，即结构域i(di，中心的n端结构域)、结构域ii(dii，二聚化结构域)和结构域iii(prm/e，免疫球蛋白(ig)样的c端结构域)。e蛋白的prm/e结构域由c端的100个氨基酸(残基303-395)组成。这个结构域已表明是受体识别和结合结构域。prm/e蛋白中存在的ig样折叠通常与具有附着功能的结构有关。这个结构域垂直地延伸到病毒的表面，具有一个从病毒粒子表面伸出的比e蛋白的任何其他部分更远的尖端。此外，研究已证明重组prm/e蛋白和产生的抗黄病毒的e蛋白的prm/e的抗体均能抑制黄病毒进入靶细胞。此外，具有e蛋白的prm/e的突变的黄病毒显示出减弱的毒力或逃避免疫中和的能力。

研制安全且有效的针对登革病毒感染的疫苗仍是一个主要的公共卫生目标。假定免疫性与登革病毒的主要关联被认为是中和抗体的存在，那么用于比较和优化疫苗候选物的前提是精确地测量由疫苗诱发的中和抗体反应的能力。来自所有四种血清型的包含减弱的活病毒的疫苗的组合已显示导致几种并发症(guyb,almondjw,compimmunolmicrobiolinfectdis.2008年3月；31(2-3):239-52)。此外，存在很少的关于基于腺病毒的登革抗原的递送的报告。尽管如此，腺病毒系统的这个众所周知的问题是大多数的人类群体已知具有抗腺病毒之一的抗体，并且此类预先存在的抗体能够引起这些基于腺病毒的疫苗失效。

因此，仍有必要研制提供针对多种且优选所有四种血清型的登革病毒的广泛免疫性或通用免疫性(universalimmunity)的疫苗，以及优选地是经济的且在所有血清型之间有效的疫苗。此外，存有需要向哺乳动物施用疫苗诸如dna疫苗或dna质粒疫苗以在预防上或治疗上提供针对登革病毒的免疫的有效方法。

发明概述

本发明的一个方面提供能够表达引发哺乳动物针对多于一种登革病毒亚型的免疫反应的多肽的核酸构建体。所述核酸构建体由编码核苷酸序列和与所述编码核苷酸序列可操作地连接的启动子组成。所述编码核苷酸序列表达所述多肽，其中所述多肽包括来自至少两种不同的登革病毒亚型的包膜蛋白的结构域iii(prm/e结构域或prm/e)。所述启动子调节哺乳动物中所述多肽的表达。

本发明的另一个方面提供了能够在哺乳动物中产生针对多种登革病毒亚型的免疫反应的dna质粒疫苗。所述dna质粒疫苗由能够在所述哺乳动物中表达共有登革抗原的dna质粒和药学上可接受的赋形剂组成。所述dna质粒由与编码所述共有登革prm/e抗原的编码序列可操作地连接的启动子组成。所述共有登革抗原由登革病毒亚型1、登革病毒亚型2、登革病毒亚型3或登革病毒亚型4的共有prm/e结构域组成。

本发明的另一方面提供了引发哺乳动物针对多种病毒亚型的免疫反应的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送dna质粒疫苗，并用能量脉冲以有效允许所述dna质粒进入所述细胞的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔，所述dna质粒疫苗包含能够在所述哺乳动物的细胞中表达衍生自所述病毒亚型的多种共有抗原以引发所述哺乳动物的免疫反应的dna质粒，所述多种共有抗原包含来自所述至少两种不同的病毒亚型的抗原结构域。

附图简述

图1示出对比来自接种d1prme的小鼠的血清与来自接种du的小鼠的血清的、针对来自亚型1的所有登革prm/e结构域的结合滴度。

图2示出对比来自接种d2prme的小鼠的血清与来自接种du的小鼠的血清的、针对来自亚型2的所有登革prm/e结构域的结合滴度。

图3示出对比来自接种d3prme的小鼠的血清与来自接种du的小鼠的血清的、针对来自亚型3的所有登革prm/e结构域的结合滴度。

图4示出对比来自接种d4prme的小鼠的血清与来自接种du的小鼠的血清的、针对来自亚型4的所有登革prm/e结构域的结合滴度。

图5示出染色凝胶，所述染色凝胶展示对用来自血清型1、2、3或4的prm/e结构域免疫的小鼠来说，针对prme蛋白类型d1、d2、d3和d4产生的结合抗体。

图6示出展示对于对照豚鼠血清来说针对登革prm/e蛋白类型(1至4)中的每一种的中和抗体的图。

图7示出展示对于du-diii豚鼠血清来说针对登革prm/e蛋白类型(1至4)中的每一种的中和抗体的图。

图8示出展示对于d1-d4prme豚鼠血清(所有四种疫苗组合成一种混合物并且一起施用)来说针对登革prm/e蛋白类型(1至4)中的每一种的中和抗体的图。

图9示出展示对于d1-d4prme豚鼠血清(单独地施用每一种疫苗)来说针对登革prm/e蛋白类型(1至4)中的每一种的中和抗体的图。

图10示出展示对于d1prme豚鼠血清来说针对登革prm/e蛋白类型(1至4)中的每一种的中和抗体的图。

图11示出展示对于d2prme豚鼠血清来说针对登革prm/e蛋白类型(1至4)中的每一种的中和抗体的图。

图12示出展示对于d3prme豚鼠血清来说针对登革prm/e蛋白类型(1至4)中的每一种的中和抗体的图。

图13示出展示对于d4prme豚鼠血清来说针对登革prm/e蛋白类型(1至4)中的每一种的中和抗体的图。

图14示出展示对于来自用所有四种d1-d4prme接种的动物的血清来说针对登革1病毒的中和抗体的图。

图15示出展示对于来自用所有四种d1-d4prme接种的动物的血清来说针对登革2病毒的中和抗体的图。

图16示出展示对于来自用所有四种d1-d4prme接种的动物的血清来说针对登革3病毒的中和抗体的图。

图17示出展示对于来自用所有四种d1-d4prme接种的动物的血清来说针对登革4病毒的中和抗体的图。

优选实施方案的详细描述

给出下述简略或简短的定义以帮助理解本发明的优选实施方案。这里所给出的简略的定义绝不是详尽的，它们与本领域理解的定义或字典含义也绝不矛盾。在这里给出简略的定义是为了补充或更清晰地界定本领域中已知的定义。

定义

如本文使用，核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用fasta、blast和gappedblast(altschul等人,nuc.acidsres.,1997,25,3389，其通过引用将其全部内容并入本文)以及paup*4.0b10软件(d.l.swofford,sinauerassociates,massachusetts)确定。简言之，blast算法代表基本局部比对搜索工具(basiclocalalignmentsearchtool)，它适合于确定序列相似性(altschul等人,j.mol.biol.,1990,215,403-410，其通过引用将其全部内容并入本文)。用于执行blast分析的软件是通过国家生物技术信息中心公共可利用的。由blast算法提供的相似性的一个量度是最小和概率(p(n))法，它提供了两条核苷酸序列之间的匹配偶然发生的概率的指示。例如，如果在检测核酸与另一种核酸的比较中最小和概率小于大约1、优选地小于大约0.1、更优选地小于大约0.01且最优选地小于大约0.001，那么认为所述核酸与所述另一种核酸是相似的。可使用paup*4.0b10软件(d.l.swofford,sinauerassociates,massachusetts)计算“相似性的百分比”。计算出共有序列与系统树(phylogenictree)中的所有序列相比的平均相似性。

如本文所用，术语“核酸构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的dna或rna分子。编码序列或“编码核酸序列”可包括与调控元件可操作地连接的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用了所述核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。

如本文使用，术语“可表达的形式”是指包含必要调控元件的核酸构建体，所述调控元件与编码蛋白质的编码序列可操作地连接以使得当所述编码序列存在于个体的细胞中时，其将被表达。

本文使用术语“恒定电流”来定义由组织或界定所述组织的细胞在递送到相同组织的电脉冲的持续期间所接受或经历的电流。所述电脉冲是从本文所述的电穿孔装置中递送的。这种电流在电脉冲的使用期内在所述组织中保持恒定安培数，因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈。所述反馈元件能够测量整个脉冲持续期间组织(或细胞)的阻抗，并引起电穿孔装置改变其电能输出(例如增加电压)，所以相同组织中的电流在整个电脉冲(微妙数量级)以及从脉冲到脉冲中保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。

术语“反馈”或“电流反馈”可被互换使用并且表示所提供的电穿孔装置的主动反应，所述反应包括测量在电极之间的组织中的电流并且因此改变由ep装置递送的能量输出以保持电流在恒定水平。这个恒定水平由使用者在脉冲序列或电处理开始之前预先设定。优选地，反馈是由电穿孔装置的电穿孔部件例如控制器完成，因为其中的电路能够连续地监测在电极之间的组织中的电流，并将所述监测的电流(或组织内的电流)与预设电流比较，并且能够连续地进行能量输出调整以保持监测的电流在预设水平。在一些实施方案中，所述反馈环路是瞬时的，因为它是模拟闭合环路反馈。

如本文可互换使用的术语“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“ep”)是指使用跨膜电场脉冲来诱导生物膜中的微观途径(孔)；这些微观途径的存在允许生物分子例如质粒、寡核苷酸、sirna、药物、离子和/或水从细胞膜的一侧通过到另一侧。

本文使用术语“分散电流”来定义从本文所述的电穿孔装置的各个针电极阵列中递送的电流模式，其中所述模式使得在被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关的热应激的发生最小化，或者优选地将其消除。

如本文使用，术语“反馈机制”是指通过软件或硬件(或固件)执行的过程，所述过程接收期望组织的阻抗(在递送能量脉冲之前、过程中和/或之后)并将其与预设值(presentvalue)(优选电流)进行比较，并且调整递送的能量脉冲以达到预设值。当讨论反馈机制时，术语“阻抗”被本文使用并且能够根据欧姆定律被转换为电流值，由此能够与预设电流比较。在一个优选的实施方案中，“反馈机制”通过模拟闭合环路执行。

本文使用术语“免疫反应”来表示宿主的免疫系统例如哺乳动物的免疫系统的激活，所述免疫系统的激活是对通过所提供的dna质粒疫苗引入登革抗原例如通用登革抗原的反应。免疫反应可以是细胞反应或体液反应的形式或二者兼有。

本文使用术语“共有”或“共有序列”来表示基于特定登革亚型的多个毒株的比对分析而构建的合成的核酸序列或对应的多肽序列，其产生亚型1、亚型2、亚型3、亚型4和以下所述的通用登革的共有登革序列。所述共有通用登革可被用来诱导针对多种登革病毒亚型或血清型的宽泛的免疫性。

本文使用术语“佐剂”来表示加到本文所述的dna质粒疫苗中以增强由所述dna质粒和下文所述的编码核酸序列所编码的登革抗原的抗原性的任何分子。

术语“亚型”或“血清型”可在本文中互换使用并涉及一种病毒例如登革病毒使用，并且表示所述病毒抗原的遗传变体以使得一个亚型区别于一个不同亚型地被免疫系统识别。例如，登革病毒亚型1在免疫学上可区别于登革病毒亚型2。

本发明的一个方面提供能够表达引发哺乳动物针对多于一种登革病毒亚型的免疫反应的多肽的核酸构建体。所述核酸构建体由编码核苷酸序列和与所述编码核苷酸序列可操作地连接的启动子组成。编码核苷酸序列表达多肽，其中所述多肽包括来自至少两种不同的登革病毒亚型的prm/e结构域。所述启动子调控哺乳动物中所述多肽的表达。

在一些实施方案中，核酸构建体还可以包括与编码序列的n端末端可操作地连接并与启动子可操作地连接的ige前导序列。优选地，所述ige前导序列具有seqidno:11的序列。所述核酸构建体还可以包含与所述编码序列的c端末端相连的聚腺苷酸化序列。优选地，所述核酸构建体是密码子优化的。

在一些实施方案中，编码核苷酸序列编码包括来自登革病毒亚型1、登革病毒亚型2、登革病毒亚型3和登革病毒亚型4的prm/e结构域的多肽。在优选的实施方案中，所述编码核苷酸序列选自由以下组成的组：

本发明的另一个方面提供了能够在哺乳动物中产生针对多种登革病毒亚型的免疫反应的dna质粒疫苗。所述dna质粒疫苗由能够在所述哺乳动物中表达共有登革抗原的dna质粒和药学上可接受的赋形剂组成。所述dna质粒由与编码所述共有登革抗原的编码序列可操作地连接的启动子组成。所述共有登革抗原由登革病毒亚型1、登革病毒亚型2、登革病毒亚型3或登革病毒亚型4的共有prm/e结构域组成。优选地，所述dna质粒包含编码共有登革抗原的共有登革抗原，所述共有登革抗原选自由以下组成的组：seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6和seqidno:8。

在一些实施方案中，所述dna质粒还包括与所述编码序列的n端末端相连并与启动子可操作地连接的ige前导序列。优选地，所述ige前导序列具有序列metargtrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargvalhisser。

dna质粒还可以包括与所述编码序列的c端末端相连的聚腺苷酸化序列。优选地，dna质粒是密码子优化的。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂是佐剂。优选地，佐剂选自由il-12和il-15组成的组：在一些实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂是转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子或脂质，以及更优选地是聚l谷氨酸。优选地，聚l谷氨酸为小于6mg/ml的浓度。优选地，dna质粒疫苗具有1mg/ml或更大的总dna质粒浓度。

在一些实施方案中，所述dna质粒包括多种单一dna质粒，其中所述多种单一dna质粒的每一种都编码包含prme登革病毒亚型1、登革病毒亚型2、登革病毒亚型3或登革病毒亚型4的多肽。

所述dna质粒疫苗可包括包含以下编码核苷酸序列的dna质粒：seqidno:1；编码seqidno:2、seqidno:3的核苷酸序列；编码seqidno:4、seqidno:5核苷酸序列；编码seqidno:6、seqidno:7和seqidno:8核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述dna质粒疫苗包含表达登革病毒prme的至少两种不同的dna质粒。在一些实施方案中，所述dna质粒疫苗可包括四种共有登革病毒prme(亚型1-4)。

在一些实施方案中，其中dna质粒疫苗产生免疫反应的哺乳动物是灵长类。优选地，哺乳动物是灵长类。免疫反应可以是体液反应或细胞反应，并且优选地二者兼有。

本发明的另一方面提供了引发哺乳动物针对多种登革病毒亚型的免疫反应的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送dna质粒疫苗并且用能量脉冲以有效允许所述dna质粒进入所述细胞的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。

在一些实施方案中，引发免疫反应的方法包括将dna质粒疫苗注射到皮内组织、皮下组织或肌肉组织中的递送步骤。

在一些实施方案中，引发免疫反应的方法还可以包括预先设定期望被递送到组织的电流；并且用能量脉冲以等于预设电流的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。

在一些实施方案中，引发免疫反应的方法还包括测量被电穿孔的细胞中的阻抗；相对于测量的阻抗调整能量脉冲的能量水平以保持电穿孔细胞中的恒定电流。所述测量和调整步骤优选地发生在所述能量脉冲的使用期内。

在一些实施方案中，电穿孔步骤包括根据以分散模式递送能量脉冲的脉冲序列模式，将能量脉冲递送至多个电极。

在本发明的一些实施方案中，dna质粒疫苗能够还包括佐剂。在一些实施方案中，佐剂选自由以下组成的组：α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、皮肤t细胞虏获趋化因子(ctack)、上皮胸腺表达的趋化因子(teck)、粘膜相关上皮趋化因子(mec)、il-12、il-15、mhc、cd80、cd86，包括具有被删除信号序列的il-15并任选地包括来自ige的信号肽。可能是有用的佐剂的其他基因包括编码以下的基因：mcp-1、mip-l-α、mip-1p、il-8、rantes、l-选择素、p-选择素、e-选择素、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、vla-1、mac-1、pl50.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、m-csf、g-csf、il-4、il-18的突变体形式、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、il-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、flt、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、胱天蛋白酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、无活性nik、sapk、sap-1、jnk、干扰素反应基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rank配体、ox40、ox40配体、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1、tap2以及它们的功能片段。在一些优选的实施方案中，佐剂选自il-12、il-15、ctack、teck或mec。

在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是转染促进剂，它可包括以下转染促进剂：表面活性剂，例如免疫刺激复合物(iscoms)；弗氏不完全佐剂；lps类似物，包括单磷酰脂质a；胞壁酰肽；醌类似物；小泡，例如角鲨烯和角鲨烯(squaleneandsqualene)；透明质酸；脂质；脂质体；钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子；或纳米颗粒或者其他已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子、包括聚l谷氨酸(lgs)或脂质。优选地，转染促进剂是聚l谷氨酸，并且更优选地，聚l谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于dna质粒疫苗中。在一些实施方案中，dna质粒疫苗中聚l谷氨酸的浓度是小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

在一些实施方案中，可以将dna质粒疫苗递送给哺乳动物以引发免疫反应；优选地，哺乳动物是灵长类动物，包括人类和非人类的灵长类动物、牛、猪、鸡、狗或雪貂。更优选地，哺乳动物是人类灵长类动物。

本发明的一个方面涉及引发哺乳动物针对多种病毒亚型的免疫反应的方法。所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送dna质粒疫苗，并且用能量脉冲以有效允许所述dna质粒进入所述细胞的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。dna质粒疫苗包含能够在所述哺乳动物的细胞中表达衍生自所述病毒的亚型的多种共有抗原以引发所述哺乳动物的免疫反应的dna质粒，所述多种共有抗原包括来自至少两种不同病毒亚型的抗原结构域。

本发明的一个方面涉及引发哺乳动物针对多种登革病毒亚型的免疫反应的方法。所述方法包括向所述哺乳动物的组织递送dna质粒疫苗，所述dna质粒疫苗包含能够在所述哺乳动物的细胞中表达共有登革抗原以引发所述哺乳动物的免疫反应的dna质粒，所述共有登革抗原包含编码prme蛋白的共有序列，所述prme蛋白来自至少两种登革亚型，以及优选地来自所有四种登革亚型。登革亚型包括亚型1、亚型2、亚型3和亚型4。引发免疫反应的方法包括用能量脉冲以有效允许dna质粒进入细胞的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。

在一些实施方案中，本发明的方法包括将dna质粒疫苗注射到皮内组织、皮下组织或肌肉组织的递送步骤。优选地，这些方法包括使用体内电穿孔装置来预先设定期望被递送到组织的电流；并且用能量脉冲以等于预设电流的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。在一些实施方案中，电穿孔步骤还包括：测量电穿孔的细胞中的阻抗；相对于测量的阻抗调整能量脉冲的能量水平以保持电穿孔细胞中的恒定电流；其中所述测量和调整步骤发生在能量脉冲的使用期内。

在一些实施方案中，电穿孔步骤包括根据以分散模式递送能量脉冲的脉冲序列模式，将能量脉冲递送至多个电极。

本发明还包括编码能够在哺乳动物中引发免疫反应的多肽的dna片段，所述免疫反应基本上类似于至少一种登革病毒亚型的非片段的免疫反应。当所述dna片段应用于本文提供的特定编码核酸序列时，它是选自于本发明的各种编码核苷酸序列(包括seqidno:1；编码seqidno:2、seqidno:3的核苷酸序列；编码seqidno:4、seqidno:5核苷酸序列；编码seqidno:6、seqidno:7和seqidno:8核苷酸序列)的至少一种的片段，并且可以是以下所述dna片段中的任一种。在一些实施方案中，dna片段可包括30个或更多、45个或更多、60个或更多、75个或更多、90个或更多、120个或更多、150个或更多、180个或更多、210个或更多、240个或更多、270个或更多、300个或更多、320个或更多、340个或更多或者360个或更多的氨基酸。在一些实施方案中，dna片段可包括免疫球蛋白e(ige)前导序列的编码序列。在一些实施方案中，dna片段可以包括少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于320、少于340或少于360个核苷酸。

本发明包括由编码核苷酸序列所编码的多肽并且可包括具有seqidno:2、4、6和8的氨基酸序列的多肽。本发明还包括能够在哺乳动物中引发免疫反应的多肽片段，所述免疫反应基本上类似于至少一种登革亚型的非片段的免疫反应。当所述多肽片段应用于本文提供的特定多肽序列时，它们选自于本发明的各种多肽序列(包括seqidno:2、4、6和8)的至少一种，并且可以是以下所述多肽片段中的任一种。在一些实施方案中，多肽片段可包括15个或更多、30个或更多、45个或更多、60个或更多、75个或更多、90个或更多、100个或更多、110个或更多或者120个或更多的氨基酸。在一些实施方案中，多肽片段可包括少于30、少于45、少于60、少于75、少于90、少于100、少于110或少于120个氨基酸。

在哺乳动物中引发与至少一种登革亚型的非片段的免疫反应基本上类似的免疫反应的功能片段的确定，可由本领域普通技术人员容易地确定。如由公共可利用的数据库例如国家生物技术信息中心(ncbi)所提供的，可分析所述片段以包含至少一个、优选地更多个抗原表位。此外，可使用小鼠和抗体滴度以及酶联免疫斑点分析(elispots)常规地评估免疫反应研究，例如在下文实施例中所示。

疫苗

在一些实施方案中，本发明通过提供蛋白质和编码具有如下表位的蛋白质的遗传构建体而提供了改进的疫苗：所述表位使得蛋白质特别有效地作为诱导免疫反应所针对的免疫原。因此，可提供疫苗以诱导治疗性或预防性免疫反应。

根据本发明的一些实施方案，将根据本发明的疫苗递送给个体来调节个体免疫系统的活性并由此增强免疫反应。当编码所述蛋白质的核酸分子被所述个体的细胞摄取时，所述核苷酸序列在细胞中被表达并且所述蛋白质由此被递送给个体。本发明的各方面提供了将蛋白质的编码序列递送到核酸分子例如质粒上的方法。根据本发明的某些方面，提供了预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。

当被细胞摄取时，dna质粒能够作为分离的遗传物质留在细胞中。可选择地，rna可被施用至细胞。还包括提供作为线性微型染色体的遗传构建体，包括着丝粒、端粒和复制起点。遗传构建体包括核酸分子的基因表达所必需的调控元件。所述元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达通常需要增强子。这些元件必须与编码期望蛋白的序列可操作地连接，并且调节元件必须可操作地处于施用它们的个体中。

一般认为起始密码子和终止密码子是编码期望蛋白的核苷酸序列的一部分。然而，这些元件在施用核酸构建体的哺乳动物中必须是有功能的。起始密码子和终止密码子与编码序列必须处在框内。

所使用的启动子和聚腺苷酸化信号必须是在个体细胞中有功能的。

实施本发明尤其是在人遗传疫苗的生产中使用的启动子的实例包括但不限于：来自猿猴病毒40(sv40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、人免疫缺陷病毒(hiv)例如牛免疫缺陷病毒(biv)长末端重复(ltr)启动子、莫洛尼(moloney)病毒、禽类白细胞增生病毒(alv)、巨细胞病毒(cmv)例如cmv立即早期启动子、eb病毒(ebv)、劳斯氏肉瘤病毒(rsv)的启动子，以及来自人类基因例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白(metalothionein)的启动子；在其他实施方案中，启动子可以是天然的或合成的组织特异性启动子例如肌肉或皮肤特异性启动子。此类启动子的实例描述于美国专利申请公布第us20040175727号中，其以全文并入本文。

实施本发明尤其是在人遗传疫苗的生产中使用的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于：sv40聚腺苷酸化信号、ltr聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hgh)聚腺苷酸化信号和人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。具体而言，可使用pcep4质粒(invitrogen,sandiego,ca)中的sv40聚腺苷酸化信号，称为sv40聚腺苷酸化信号。

除了dna表达所需的调控元件之外，其他元件也可以被包括在dna分子中。此类其他元件包括增强子。增强子可选自于包括但不限于以下的组：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强子，例如来自cmv、rsv和ebv的增强子。

遗传构建体可与哺乳动物复制起点一起被提供以便使构建体保持在染色体外，并且在细胞中产生构建体的多个拷贝。来自invitrogen(sandiego,ca)的质粒pvax1、pcep4和prep4包含eb病毒的复制起点和产生未整合的高拷贝附加型复制的核抗原ebna-1编码区。

为了使蛋白质的产生最大化，可选择很好地适合施用构建体的细胞中基因表达的调控序列。此外，可选择在所述宿主细胞中被最有效率地转录的编码所述蛋白质的密码子。本领域普通技术人员可生产在细胞中有功能的dna构建体。

在一些实施方案中，可提供其中本文所述蛋白质的编码序列与ige信号肽相连的核酸构建体。在一些实施方案中，本文所述的蛋白质与ige信号肽相连。

在使用蛋白质的一些实施方案中，例如，本领域普通技术人员可使用公知技术生产并使用公知技术分离本发明的蛋白质。在使用蛋白质的一些实施方案中，例如，本领域普通技术人员可使用公知技术将编码本发明的蛋白质的dna分子插入到在公知表达系统中使用的可商购获得的表达载体中。例如，可商购获得的质粒pse420(invitrogen,sandiego,ca)可被用于在大肠杆菌(e.coli)中生产蛋白。例如，可商购获得的质粒pyes2(invitrogen,sandiego,ca)可被用于在酵母的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)菌株中的生产。例如，可商购获得的maxbac^tm完整杆状病毒表达系统(invitrogen,sandiego,ca)可用于在昆虫细胞中的生产。例如，可商购获得的质粒pcdna或pcdna3(invitrogen,sandiego,ca)可用于在哺乳动物细胞，例如中华仓鼠卵巢(cho)细胞中的生产。本领域普通技术人员可使用这些商购表达载体和系统或其他载体和系统通过常规技术和可容易获得的起始材料生产蛋白质(参见例如sambrook等人,molecularcloningalaboratorymanual(分子克隆实验指南),第二版。coldspringharborpress(1989))。因此，可以在原核系统和真核系统中制备期望蛋白，产生蛋白质的一系列加工形式。

本领域普通技术人员可使用其他可商购获得的表达载体和系统，或者使用公知方法和容易获得的起始材料来生产载体。包含必要的调控序列例如启动子和聚腺苷酸化信号以及优选地包含增强子的表达系统可容易地获得并且在本领域中对于各种宿主是已知的。参见例如，sambrook等人,molecularcloningalaboratorymanual(分子克隆实验指南),第二版。coldspringharborpress(1989)。基因构建体包括与启动子可操作地连接的蛋白质编码序列，所述启动子在转染构建体的细胞系或靶组织的细胞中是有功能的。组成型启动子的实例包括来自巨细胞病毒(cmv)或sv40的启动子。诱导型启动子的实例包括小鼠乳腺白血病病毒或金属硫蛋白的启动子。本领域普通技术人员可从容易获得的起始材料中容易地生产用于用编码本发明的蛋白质的dna转染细胞的遗传构建体。将包括编码蛋白质的dna的表达载体用来转化相容的宿主，然后将所述宿主在其中发生外源dna表达的条件下培养并保持。

通过溶解细胞或者从适当的和本领域技术人员已知的培养基中将产生的蛋白质从培养物中回收。本领域普通技术人员可使用公知技术来分离使用此类表达系统生产的蛋白质。使用与以上所述的特定蛋白特异性结合的抗体从自然来源中纯化蛋白质的方法可同样地应用于通过重组dna方法产生的纯化蛋白质。

除了通过重组技术生产蛋白质之外，还可以采用自动化肽合成仪来生产分离的、基本上纯的蛋白。此类技术对于本领域普通技术人员是公知的，并且如果具有替代的衍生物没有在dna编码的蛋白质的生产中提供的话，此类技术是有用的。

可使用几种公知技术中的任一种递送核酸分子，所述技术包括：有和没有体内电穿孔的dna注射(也称为dna接种)，脂质体介导，纳米颗粒促进，重组载体例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘苗。优选地，本文所述的核酸分子例如dna质粒是通过dna注射连同体内电穿孔递送。

施用途径包括但不限于：肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部地、经皮、通过吸入或栓剂或者至粘膜组织例如通过灌洗至阴道、直肠、尿道、颊或舌下的组织。优选的施用途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。遗传构建体可以通过如下手段施用，包括但不限于：常规注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪(microprojectilebombardmentgonegun)”或其他物理方法例如电穿孔(“ep”)、“流体动力学方法”或超声。

用于促进本发明的dna疫苗的递送的优选的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在draghia-akli等人的美国专利第7,245,963号、smith等人递交的美国专利申请公布第2005/0052630号中描述的实例，两篇文献的内容通过引用将它们的全部内容并入本文。还优选下述文献中提供的用于促进dna疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法：2007年10月17号提交的共同待审和共有拥有的美国专利申请系列号11/874072，它依据美国法典第35条119款(e)要求享有2006年10月17日提交的美国临时申请系列号60/852,149和2007年10月提交的美国临时申请系列号60/978,982的权益，所有这些文献均将其全部内容并入本文。

draghia-akli等人的美国专利第7,245,963号描述了标准电极系统和它们用于促进将生物分子导入身体或植物内选定组织的细胞中的用途。标准电极系统包括多个针状电极；皮下针；提供从程序化恒定电流脉冲控制器到所述多个针状电极的传导连接的电连接器；以及电源。操作者可以抓住装在支撑结构上的多个针状电极并将它们牢固地插入到身体或植物内的选定组织中。然后将生物分子通过皮下针递送到选定组织中。程序化恒定电流脉冲控制器被激活，并且恒定电流的电脉冲被应用到多个针状电极。应用的恒定电流电脉冲促进生物分子导入到多个电极之间的细胞中。美国专利第7,245,963号的全部内容通过引用并入本文。

smith等人递交的美国专利申请公布第2005/0052630号描述了可被用来有效促进生物分子导入到身体或植物内选定组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括由软件或固件指定操作的电动装置(“ekd装置”)。ekd装置基于使用者的控制和脉冲参数的输入在阵列中的电极之间产生一系列可程序化的恒定电流脉冲模式，并且允许电流波形数据的存储和获取。电穿孔装置还包括具有针状电极阵列的可替代的电极盘、用于注射针的中心注射通道以及可移去的引导盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容通过引用并入本文。

美国专利第7,245,963号和美国专利申请公布第2005/0052630号中描述的电极阵列和方法适合用于深深穿入例如肌肉的组织以及其他组织或器官。因为电极阵列的配置，注射针(递送选择的生物分子)也被完全插入到靶器官中，并且注射被垂直施用至由电极预先划定的区域中的靶组织。在美国专利第7,245,963号和美国专利申请公布2005/005263中描述的电极优选地是20mm长以及21厚度(gauge)。

以下是本发明的方法的一个实例，并且在以上讨论的专利参考文献中更详细地被讨论：可以配置电穿孔装置来将产生的恒定电流的能量脉冲递送至哺乳动物的期望组织，所述恒定电流类似于使用者的预设电流输入。电穿孔装置包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔部件可包括并掺入电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测验器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆部件、电源和电源开关。电穿孔部件能够作为电穿孔装置的一个元件起作用，并且其他元件是与电穿孔部件保持联系的分开的元件(或部件)。在一些实施方案中，电穿孔部件能够作为多于一个电穿孔装置的元件起作用，它还能够与电穿孔装置的其他元件保持联系，所述其他元件与电穿孔部件是分开的。本发明不受作为机电装置或机械装置的零件存在的电穿孔装置的元件限制，因为所述元件能够作为一个装置或者作为彼此保持联系的分开的元件起作用。电穿孔部件能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极组件包括在空间排布中具有多个电极的电极阵列，其中所述电极组件接收来自电穿孔部件的能量脉冲并且将此能量脉冲通过电极递送到期望组织。多个电极中的至少一个在递送能量脉冲的过程中是中性的，并且测量期望组织中的阻抗，并且将该阻抗传递到电穿孔部件。反馈机制能够接收测量的阻抗并且能调整由电穿孔部件递送的能量脉冲以保持恒定电流。

在一些实施方案中，所述多个电极能够以分散模式递送能量脉冲。在一些实施方案中，所述多个电极能够通过在程序序列下控制电极以分散模式递送能量脉冲，并且所述程序序列是由使用者输入到电穿孔部件中。在一些实施方案中，程序序列包括按顺序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的每个脉冲是通过至少两个活性电极和测量阻抗的一个中性电极递送，并且其中多个脉冲中的随后脉冲是通过至少两个活性电极中不同的一个和测量阻抗的一个中性电极递送。

在一些实施方案中，反馈机制是通过硬件或软件执行的。优选地，反馈机制是通过模拟闭合环路执行的。优选地，这种反馈每50μs、20μs、10μs或1μs发生，但优选地是实时反馈或是瞬时反馈(即如通过用于确定反应时间的可用技术所确定的基本上瞬时的反馈)。在一些实施方案中，中性电极测量期望组织中的阻抗并且将该阻抗传递至反馈机制，该反馈机制响应该阻抗，并调整能量脉冲以将恒定电流保持在与预设电流类似的值。在一些实施方案中，反馈机制在递送能量脉冲的过程中连续地并瞬时地保持恒定电流。

药学上可接受的赋形剂可包括例如运载体、佐剂、载体或稀释剂这类公共已知并且可容易获得的功能分子。优选地，药学上可接受的赋形剂是佐剂或转染促进剂。在一些实施方案中，将核酸分子或dna质粒递送至细胞，并且施用多核苷酸功能增强剂或遗传疫苗促进剂(或转染促进剂)。多核苷酸功能增强剂描述于美国专利第5,593,972号、美国专利第5,962,428号和1994年1月26日提交的国际专利申请系列号pct/us94/00899中，这些文献各自通过引用并入本文。遗传疫苗促进剂描述于1994年4月1日提交的美国系列第021,579号中，其通过引用并入本文。转染促进剂能够与核酸分子一起作为与核酸分子的混合物施用，或者在核酸分子施用的同时、之前或之后分开施用。转染促进剂的实例包括表面活性剂，例如免疫刺激复合物(iscoms)；弗氏不完全佐剂；lps类似物，包括单磷酰脂质a；胞壁酰肽；醌类似物以及小泡例如角鲨烯和角鲨烯；并且也可以使用透明质酸与遗传构建体联合施用。在一些实施方案中，dna质粒疫苗还可以包括转染促进剂，例如脂质；脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域其他已知脂质体，为dna脂质体混合物(参见例如w09324640)；钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子或纳米颗粒；或者其他已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚l谷氨酸(lgs)或脂质。

在一些优选的实施方案中，将dna质粒与佐剂一起递送，所述佐剂是进一步增强针对此类靶蛋白的免疫反应的蛋白质的基因。此类基因的实例是那些编码其他细胞因子和淋巴因子的基因，所述细胞因子和淋巴因子例如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-12、il-18、mhc、cd80、cd86和il-15，包括被删除信号序列的il-15并任选地包括来自ige的信号肽。可能有用的其他基因包括编码以下的基因：mcp-1、mip-lα、mip-1p、il-8、rantes、l-选择素、p-选择素、e-选择素、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、vla-1、mac-1、pl50.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、m-csf、g-csf、il-4、il-18的突变体形式、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、il-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、flt、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、胱天蛋白酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、无活性nik、sapk、sap-1、jnk、干扰素反应基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rank配体、ox40、ox40配体、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1、tap2以及它们的功能片段。

根据本发明的dna质粒疫苗包含的dna量为从约1纳克到10毫克；约1微克到约10毫克；或者优选地约0.1微克到约10毫克；或者更优选地约100微克到约1毫克。在一些优选的实施方案中，根据本发明的dna质粒疫苗包含约5纳克到约1000微克的dna。在一些优选的实施方案中，dna质粒疫苗含有约10纳克到约800微克的dna。在一些优选的实施方案中，dna质粒疫苗含有约0.1微克到约500微克的dna。在一些优选的实施方案中，dna质粒疫苗含有约1微克到约350微克的dna。在一些优选的实施方案中，dna质粒疫苗含有约25微克到约250微克的dna。在一些优选的实施方案中，dna质粒疫苗含有约100微克到约1毫克的dna。

根据待使用的施用方式配制根据本发明的dna质粒疫苗。在dna质粒疫苗是可注射的组合物的情况中，它们是灭菌的和/或无热原的和/或无颗粒的。优选地使用等渗制剂。一般来说，等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况中，优选等渗溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂加到制剂中。在一些实施方案中，使得制剂在室温或环境温度下稳定延续的一段时间的稳定剂例如lgs或其他聚阳离子或聚阴离子被加到制剂中。

在一些实施方案中，引发哺乳动物针对共有登革抗原的免疫反应的方法包括诱导粘膜免疫反应的方法。此类方法包括向所述哺乳动物施用一种或多种ctack蛋白、teck蛋白、mec蛋白和它们的功能片段或它们的可表达的编码序列以及包括以上所述的共有登革抗原的dna质粒。一种或多种ctack蛋白、teck蛋白、mec蛋白和它们的功能片段可以在本文提供的dna质粒登革疫苗的施用之前、同时或之后施用。在一些实施方案中，向哺乳动物施用分离的核酸分子，所述核酸分子编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质：ctack、teck、mec和它们的功能片段。

在以下实施例中进一步举例说明了本发明。应当理解这些实施例指出本发明的优选实施方案时，仅通过举例说明方式被给出。由以上讨论和这些实施例，本领域技术人员能够确定本发明的必要特征，并且在不背离本发明的精神和范围的情况下，能够对本发明进行各种变动和改良以使其适合于各种运用和条件。因此，由上述描述，本发明的各种改良以及本文示出并描述的那些改良对本领域技术人员将是明显的。此类改良也旨在落入所附权利要求书的范围之内。

优选地，供本文所述的肌肉或皮肤ep装置使用的dna制剂具有小体积的高dna浓度，优选包括微克到数十毫克量的、并且优选毫克量的dna浓度，所述小体积对于递送到皮肤是最佳的，优选小注射体积，理想的是25-200微升(μl)。在一些实施方案中，所述dna制剂具有高dna浓度，例如1mg/ml或更大(mgdna/制剂体积)。更优选地，dna制剂具有的dna浓度提供了在200μl的配方中的克量的dna，并且更优选在100μl的配方中克量的dna。

可使用已知装置与技术的组合配制或制造供本发明的ep装置使用的dna质粒，但优选地使用在以下文献中描述的优化的质粒制造技术来制造它们：美国专利申请第12/126611号，它作为2009年1月1日公开的美国专利申请公布第20090004716号而公开。在一些实例中，在这些研究中使用的dna质粒能够以大于或等于10mg/ml的浓度配制。除了在美国专利申请公布第20090004716号中描述的和在2007年7月3日提交的美国专利第7,238,522号中描述的装置和方案之外，制造技术还包括或结合了本领域普通技术人员通常知道的各种装置和方案。供本文描述的皮肤ep装置和递送技术使用的高浓度质粒允许质粒以相当低的体积施用到id/sc空间中并且帮助增强表达和免疫作用。公开文本美国专利申请公布第20090004716号和美国专利第7,238,522号均将其整体在此并入。

实施例

实施例1

prm防止e蛋白在病毒成熟期间由于形成非感染性不成熟病毒颗粒即prm-e异源二聚复合物的过早融合。不成熟颗粒通过高尔基体房室的低ph环境而转变，并且在这个阶段，在prm的加工之前，在e蛋白中发生可逆的构象变化。在prm通过反面高尔基体网状结构中的细胞丝氨酸蛋白酶切割成m之后，产生了e的不可逆构象变化，从而维持中和抗原表位的完整性。

d1prme、d2prme、d3prme和d4prme是编码包含prm(预膜前体)蛋白和e(包膜)蛋白两者中分别针对血清型d1、d2、d3或d4的共有序列的抗原的构建体。

du是编码包含以下共有序列的抗原的构建体：针对血清型d1的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列、针对血清型d2的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列、针对血清型d3的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列和针对血清型d4的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列，所述共有序列各自由连接体分开。构建了组合所有四种diii结构域(通用的或通用diii)的构建体并将其称为du(seqidno:9)，所述四种diii结构域是由蛋白水解切割序列分开。具有序列seqidno:10的共有diii结构域du由连接序列组成，所述连接序列连接diii的四种亚型(dv-1-diii、dv-2-diii、dv-3-diii和dv-4-diii)中的每一种。所述连接体具有序列rgrkrrs，它是已知的切割位点并且允许将du切割成具有特定亚型的单独diii序列。然而，所述连接序列可以是具有相似特征的本领域中可用的任何其他的连接序列，并且用这种连接体替换成当前利用的rgrkrrs属于本领域的普通技术。

用100μg的d1prme、d2prme、d3prme、d4prme或du免疫小鼠。小鼠接收用3pcellectra(id)进行的3次免疫，每次免疫间隔3周，并且每3周在同一注射位点处采血。每一组包括5只动物(n＝5)。

对来自每一小鼠的血清进行连续稀释(1:50、1:150、1:450、1:1350和1:4050)。使血清接触来自四种血清型d1、d2、d3或d4中的每一种的diii(包膜蛋白e的结构域iii)。通过在450nm下测量吸光度来测定血清中抗体与diii蛋白的结合。bsa用作对照。

以下是实验设计的概述。

表1.实验设计

图1-5中示出结果。如图1所示，用d1prme免疫的所有小鼠产生结合来自d1的diii的抗体，并且用du免疫的所有小鼠也产生结合来自d1的diii的抗体。如图2所示，用d2prme免疫的所有小鼠产生结合来自d2的diii的抗体，并且用du免疫的所有小鼠也产生结合来自d2的diii的抗体。如图3所示，用d3prme免疫的小鼠3、4和5产生结合来自d3的diii的抗体，但是并不与图1和2所示的结合一样良好。用d3prme免疫的小鼠1和2不产生良好结合来自d3的diii的抗体。用du免疫的所有小鼠产生结合来自d3的diii的抗体。如图4所示，用d1prme免疫的小鼠4和5产生结合来自d4的diii的抗体，但是来自小鼠1、2和3的抗体不产生结合。用du免疫的所有小鼠产生结合来自d4的diii的抗体。

用蛋白质印迹分析对来自用d1prme、d2prme、d3prme或d4prme免疫的小鼠的血清分析蛋白e和蛋白prm。如图5所示，蛋白e和prm是单独的，并且存在于来自所有小鼠的血清中。

实施例2：登革li-cor测定

用100μg的d1prme、d2prme、d3prme、d4prme或du免疫豚鼠。如以下详细描述，在一些组中，用所有四种d1prme、d2prme、d3prme或d4prme在单个免疫位点或单独免疫位点中免疫每一豚鼠。在单个施用位点中，以单次施用方式将所有四种混合在一起。对于单独免疫位点来说，单独地施用每一种。如在实施例2中，d1prme、d2prme、d3prme和d4prme是编码包含分别来自血清型d1、d2、d3或d4的prm(预膜前体)蛋白和e(包膜)蛋白两者的抗原的构建体。du是编码包含以下共有序列的抗原的构建体：针对血清型d1的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列、针对血清型d2的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列、针对血清型d3的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列和针对血清型d4的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列，所述共有序列各自由连接体分开，如在实施例1中详细所述。

对来自每一豚鼠的血清进行连续稀释(1:50、1:150、1:450、1:1350和1:4050)。通过在450nm下测量吸光度来测定血清中抗体与登革热病毒的结合。

进行血清的2倍连续稀释，并且将它放置在96孔板中，每孔50μl。将50pfu(每孔50μl)的登革热病毒加入每一孔中。将板在37℃下孵育1小时，以允许病毒与来自血清的抗体的中和。将整个混合物(100μl)加入vero细胞(种子1.5x10⁴/孔)。将板在37℃下孵育4天。使用3.7％甲醛将细胞固定30分钟。使用0.1％tritonx-100/pbs洗涤并透化细胞。使用小鼠4g2mab、生物素化抗小鼠igg和irdye800cw抗生蛋白链菌素+5mmdraq5混合物解决方案来执行基于细胞的elisa。将板洗涤、干燥，并且使用li-coraerius系统扫描。计算800nm/700nm比率。

图6-13示出结果。如图6所示，来自两只对照豚鼠(未免疫)的血清不结合来自d1、d2、d3或d4血清型的diii。如图7所示，用du免疫豚鼠，并且仅豚鼠4产生结合来自d1、d2、d3和d4血清型的diii蛋白的抗体。如图8所示，用100μg的d1prme、100μg的d2prme、100μg的d3prme和100μg的d4prme的混合物免疫五只豚鼠，每只豚鼠总共400μg，全部在一个免疫位点。所有豚鼠产生结合来自d1、d2和d3的diii蛋白的抗体。然而，仅两只豚鼠产生结合来自d4的diii蛋白的抗体，并且结合相对于其他血清型来说减弱。如图9所示，用100μg的d1prme、100μg的d2prme、100μg的d3prme和100μg的d4prme在四个单独位点处免疫五只豚鼠，每只豚鼠总共400μg。所有豚鼠产生结合来自d1、d2和d3的diii蛋白的抗体。然而，仅三或四只豚鼠产生结合来自d4的diii蛋白的抗体，并且结合相对于其他血清型来说减弱。如图10所示，以每只100μg的d1prme免疫五只豚鼠。所有豚鼠产生结合来自d1的diii蛋白的抗体。然而，仅几只豚鼠产生结合来自d2、d3或d4的diii蛋白的抗体，并且结合相对于d1来说减弱。如图11所示，以每只100μg的d2prme免疫五只豚鼠。所有豚鼠产生结合来自d2的diii蛋白的抗体。然而，仅一只豚鼠产生结合来自d1的diii蛋白的抗体，并且结合相对于其他d1来说减弱。无豚鼠产生结合来自d3或d4的diii蛋白的抗体。如图12所示，以每只100μg的d3prme免疫五只豚鼠。所有豚鼠产生结合来自d1和d3的diii蛋白的抗体。然而，仅一只豚鼠产生结合来自d2的diii蛋白的抗体。无豚鼠产生结合来自d4的diii蛋白的抗体。如图13所示，以每只100μg的d4prme免疫五只豚鼠。四只豚鼠产生结合来自d4的diii蛋白的抗体。豚鼠1产生结合来自d1和d2的diii蛋白的抗体。仅几只豚鼠产生结合(最小程度地)来自d2和d3的diii蛋白的抗体。

图8和9与图7的比较指示：用d1prme、d2prme、d3prme和d4prme的组合(无论单独还是混合)进行的免疫比用du进行免疫产生对diii更好的免疫原性。

实施例3：登革prnt50和frnt测定

用100μg的du、d1prme、d2prme、d3prme或d4prme免疫豚鼠。如以下详细描述，在一些组中，用所有四种d1prme、d2prme、d3prme或d4prme在单个免疫位点或单独免疫位点中免疫每一豚鼠。如在实施例2和3中，d1prme、d2prme、d3prme和d4prme是编码包含分别来自血清型d1、d2、d3或d4的prm(预膜前体)蛋白和e(包膜)蛋白两者的抗原的构建体。du是编码包含以下共有序列的抗原的构建体：针对血清型d1的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列、针对血清型d2的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列、针对血清型d3的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列和针对血清型d4的e(包膜)蛋白的diii结构域的共有序列，所述共有序列各自由连接体分开，如在实施例2中详细所述。

对于登革prnt50测定来说，在第1天将vero细胞以6孔格式接种(7.5x10⁵至1.0x10⁶个细胞/孔)。在第2天，在37℃下，用来自豚鼠的血清孵育50pfu的登革热病毒/孔达1小时。所使用的登革热病毒是菌株夏威夷、ngc、h87或h241中的一种。将混合物加入板中的细胞单层，并且在37℃下孵育1小时。用在2％培养基199中的1％甲基纤维素覆盖细胞。在37℃下将细胞孵育达感染后5天。在第7天，用结晶紫/20％甲醇混合物固定并染色细胞(孵育2小时)。用dh2o洗涤板并且加以干燥。对噬斑计数。中和滴度被定义为：与无血清的对照相比，噬斑计数减少>50％的最高血清稀释度的倒数。

对于focusdiagnosticsfrnt测定来说，使用24孔板与血清的4倍稀释。将板孵育4天。使用免疫聚焦来测定并计数噬斑的发展。

以下表2中以及图14-17中示出结果。如图14所示，来自用所有d1prme、d2prme、d3prme或d4prme构建体免疫的豚鼠以及来自只用d1prme免疫的豚鼠的血清产生结合来自夏威夷登革热病毒的蛋白质的抗体。用du进行的免疫则不产生。如图15所示，来自用所有d1prme、d2prme、d3prme或d4prme构建体免疫的豚鼠以及来自只用d2prme免疫的豚鼠的血清产生结合来自ngc登革热病毒的蛋白质的抗体。用du进行的免疫则不产生。如图16所示，来自用所有d1prme、d2prme、d3prme或d4prme构建体免疫的豚鼠以及来自只用d3prme免疫的豚鼠的血清产生结合来自h87登革热病毒的蛋白质的抗体。在用du进行的免疫之后观察到的滴度是最小的。如图17所示，来自用所有d1prme、d2prme、d3prme或d4prme构建体免疫的豚鼠以及来自只用d4prme免疫的豚鼠的血清产生结合来自h241登革热病毒的蛋白质的抗体。用du进行的免疫则不产生。

表2.通过licor、frnt和prnt测定来测定的1期临床研究病毒中和抗体反应。

序列表

<110>宾夕法尼亚大学理事会

大卫•韦纳

严健

尼兰詹•萨尔德赛

<120>针对多种登革病毒亚型的新疫苗

<130>upvg0055wo2

<150>61801972

<151>2013-03-15

<160>10

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>2100

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>登革1-prmedna序列

<400>1

atggactggacctggattctgtttctggtcgccgccgcaactagagtgcattcaaatagg60

aggaagaggagcgtcacaatgctgctgatgctgatgcccaccgccctggctttccacctg120

accacacggggcggggagcctcatatgatcgtgtccaagcaggaaagagggaaatccctg180

ctgtttaagacttctgccggagtgaacatgtgcaccctgattgctatggacctgggcgag240

ctgtgcgaagataccatgacatacaagtgtccaaggatcacagaggccgaacccgacgat300

gtggactgctggtgtaatgctactgatacctgggtgacctatgggacatgttcacagacc360

ggagagcaccggagagacaagaggagcgtggcactggcccctcacgtcggactgggactg420

gagacacgcactgaaacctggatgagctccgagggggcctggaaacagattcagagagtg480

gaaacctgggctctgaggcaccctggattcacagtgatcgcactgtttctggctcatgca540

attggaacttctatcacccagaagggcatcattttcattctgctgatgctggtgacccca600

agtatggcaatgcgatgcgtgggaatcggaaaccgagactttgtcgagggcctgtccggg660

gctacatgggtggatgtggtcctggaacacggctcttgtgtcactaccatggcaaaggac720

aaaccaaccctggatatcgagctgctgaagacagaagtgactaaccccgcagtcctgcga780

aaactgtgcattgaggccaagatcagtaatacaactaccgattcacgctgtcccactcag840

ggcgaagctaccctggtggaggaacaggacgcaaacttcgtgtgcaggcgcacctttgtc900

gatcgcggatggggcaatgggtgtggactgttcggcaaggggtccctgatcacatgcgcc960

aagtttaaatgtgtgactaagctggagggcaaaattgtccagtacgaaaacctgaaatat1020

tcagtcatcgtgaccgtccacacaggcgaccagcatcaagtggggaatgagtctaccgaa1080

cacgggacaactgcaacaattactcctcaggccccaacaagcgagatccagctgactgac1140

tacggagccctgaccctggattgctcccctcggaccggactggatttcaacgagatggtg1200

ctgctgacaatgaaggaaaaaagttggctggtgcataagcagtggtttctggacctgcca1260

ctgccctggacatctggcgcctcaacaagccaggagacttggaatagacaggatctgctg1320

gtgactttcaagaccgcccacgctaagaaacaggaggtggtcgtgctgggcagccaggaa1380

ggagctatgcatacagcactgactggcgccaccgagattcagaccagcgggaccacaact1440

atcttcgccggacacctgaagtgccggctgaagatggacaaactgacactgaaaggaatg1500

agctacgtgatgtgtactggctcctttaagctggagaaagaagtggctgagacccagcat1560

ggcacagtgctggtccaggtgaaatatgaagggaccgacgccccctgtaagatccctttc1620

agcacccaggatgagaaaggagtgacacagaacggcaggctgattacagcaaatcctatc1680

gtgactgataaggaaaaaccagtcaacattgaggccgaacccccttttggcgagagttac1740

atcgtcgtgggagctggcgaaaaggcactgaaactgtcatggttcaagaaagggtctagt1800

attggaaagatgtttgaggcaaccgccagaggcgcccgacgaatggctattctgggcgac1860

actgcttgggatttcgggtctatcggaggcgtctttaccagtgtgggcaagctggtccac1920

cagatcttcggcacagcctatggggtgctgttttcaggggtcagctggactatgaaaatc1980

gggattggaatcctgctgacttggctgggactgaattccagatctaccagtctgagcatg2040

acttgtattgccgtcggactggtgacactgtatctgggcgtgatggtgcaggcctgataa2100

<210>2

<211>698

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>登革1-prme蛋白序列

<400>2

metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval

151015

hisserasnargarglysargservalthrmetleuleumetleumet

202530

prothralaleualaphehisleuthrthrargglyglygluprohis

354045

metilevalserlysglngluargglylysserleuleuphelysthr

505560

seralaglyvalasnmetcysthrleuilealametaspleuglyglu

65707580

leucysgluaspthrmetthrtyrlyscysproargilethrgluala

859095

gluproaspaspvalaspcystrpcysasnalathraspthrtrpval

100105110

thrtyrglythrcysserglnthrglygluhisargargasplysarg

115120125

servalalaleualaprohisvalglyleuglyleugluthrargthr

130135140

gluthrtrpmetsersergluglyalatrplysglnileglnargval

145150155160

gluthrtrpalaleuarghisproglyphethrvalilealaleuphe

165170175

leualahisalaileglythrserilethrglnlysglyileilephe

180185190

ileleuleumetleuvalthrprosermetalametargcysvalgly

195200205

ileglyasnargaspphevalgluglyleuserglyalathrtrpval

210215220

aspvalvalleugluhisglysercysvalthrthrmetalalysasp

225230235240

lysprothrleuaspilegluleuleulysthrgluvalthrasnpro

245250255

alavalleuarglysleucysileglualalysileserasnthrthr

260265270

thraspserargcysprothrglnglyglualathrleuvalgluglu

275280285

glnaspalaasnphevalcysargargthrphevalaspargglytrp

290295300

glyasnglycysglyleupheglylysglyserleuilethrcysala

305310315320

lysphelyscysvalthrlysleugluglylysilevalglntyrglu

325330335

asnleulystyrservalilevalthrvalhisthrglyaspglnhis

340345350

glnvalglyasngluserthrgluhisglythrthralathrilethr

355360365

proglnalaprothrsergluileglnleuthrasptyrglyalaleu

370375380

thrleuaspcysserproargthrglyleuasppheasnglumetval

385390395400

leuleuthrmetlysglulyssertrpleuvalhislysglntrpphe

405410415

leuaspleuproleuprotrpthrserglyalaserthrserglnglu

420425430

thrtrpasnargglnaspleuleuvalthrphelysthralahisala

435440445

lyslysglngluvalvalvalleuglyserglngluglyalamethis

450455460

thralaleuthrglyalathrgluileglnthrserglythrthrthr

465470475480

ilephealaglyhisleulyscysargleulysmetasplysleuthr

485490495

leulysglymetsertyrvalmetcysthrglyserphelysleuglu

500505510

lysgluvalalagluthrglnhisglythrvalleuvalglnvallys

515520525

tyrgluglythraspalaprocyslysilepropheserthrglnasp

530535540

glulysglyvalthrglnasnglyargleuilethralaasnproile

545550555560

valthrasplysglulysprovalasnileglualagluproprophe

565570575

glyglusertyrilevalvalglyalaglyglulysalaleulysleu

580585590

sertrpphelyslysglyserserileglylysmetpheglualathr

595600605

alaargglyalaargargmetalaileleuglyaspthralatrpasp

610615620

pheglyserileglyglyvalphethrservalglylysleuvalhis

625630635640

glnilepheglythralatyrglyvalleupheserglyvalsertrp

645650655

thrmetlysileglyileglyileleuleuthrtrpleuglyleuasn

660665670

serargserthrserleusermetthrcysilealavalglyleuval

675680685

thrleutyrleuglyvalmetvalglnala

690695

<210>3

<211>2100

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>登革2-prmedna序列

<400>3

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cacggaaaagagattaaggtcacccctcagtctagtatcaccgaggctgaactgacaggc1140

tatgggaccgtgacaatggaatgctctcctcggacaggcctggatttcaacgagatggtg1200

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ctgttcacaggacacctgaaatgcaggctgcgcatggataaactgcagctgaaggggatg1500

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gagatcatggatctggaaaagagacatgtgctggggaggctgattactgtgaaccctatc1680

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<210>4

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>登革2-prme蛋白序列

<400>4

metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval

151015

hisserasnargargargargseralaglymetileilemetleuile

202530

prothrvalmetalaphehisleuthrthrargasnglygluprohis

354045

metilevalglyargglnglulysglylysserleuleuphelysthr

505560

gluaspglyvalasnmetcysthrleumetalaileaspleuglyglu

65707580

leucysgluaspthrilethrtyrlyscysproleuleuargglnasn

859095

gluprogluaspileaspcystrpcysasnserthrserthrtrpval

100105110

thrtyrglythrcysthrthrthrglygluhisargargglulysarg

115120125

servalalaleuvalprohisvalglymetglyleugluthrargthr

130135140

gluthrtrpmetsersergluglyalatrplyshisvalglnargile

145150155160

gluthrtrpileleuarghisproglyphethrilemetalaalaile

165170175

leualatyrthrileglythrthrhispheglnargalaleuilephe

180185190

ileleuleuthralavalalaprosermetthrmetargcysilegly

195200205

ileserasnargaspphevalgluglyvalserglyglysertrpval

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aspilevalleugluhisglysercysvalthrthrmetalalysasn

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245250255

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thrgluserargcysprothrglnglygluproserleuasngluglu

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290295300

glyasnglycysglyleupheglylysglyglyilevalthrcysala

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metphethrcyslyslysasnmetgluglylysilevalglnproglu

325330335

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proglnserserilethrglualagluleuthrglytyrglythrval

370375380

thrmetglucysserproargthrglyleuasppheasnglumetval

385390395400

leuleuglnmetgluasnlysalatrpleuvalhisargglntrpphe

405410415

leuaspleuproleuprotrpleuproglyalaaspthrglnglyser

420425430

asntrpileglnlysgluthrleuvalthrphelysasnprohisala

435440445

lyslysglnaspvalvalvalleuglyserglngluglyalamethis

450455460

thralaleuthrglyalathrgluileglnmetserserglyasnleu

465470475480

leuphethrglyhisleulyscysargleuargmetasplysleugln

485490495

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lysgluilealagluthrglnhisglythrilevalileargvalgln

515520525

tyrgluglyaspglyserprocyslysileprophegluilemetasp

530535540

leuglulysarghisvalleuglyargleuilethrvalasnproile

545550555560

valthrglulysaspserprovalasnileglualagluproprophe

565570575

glyaspsertyrileileileglyvalgluproglyglnleulysleu

580585590

asntrpphelyslysglyserserileglyglnmetphegluthrthr

595600605

metargglyalalysargmetalaileleuglyaspthralatrpasp

610615620

pheglyserleuglyglyvalphethrserileglylysalaleuhis

625630635640

glnvalpheglyalailetyrglyalaalapheserglyvalsertrp

645650655

thrmetlysileleuileglyvalileilethrtrpileglymetasn

660665670

serargserthrserleuservalserleuvalleuvalglyvalval

675680685

thrleutyrleuglyvalmetvalglnala

690695

<210>5

<211>2094

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>登革3-prmedna序列

<400>5

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metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval

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hisserasnlysarglyslysthrserleucysleumetmetmetleu

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proalathrleualaphehisleuthrserargaspglygluproarg

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metilevalglylysasngluargglylysserleuleuphelysthr

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alaserglyileasnmetcysthrleuilealametaspleuglyglu

65707580

metcysaspaspthrvalthrtyrlyscysprohisilethrgluval

859095

gluprogluaspileaspcystrpcysasnleuthrserthrtrpval

100105110

thrtyrglythrcysasnglnalaglygluhisargargasplysarg

115120125

servalalaleualaprohisvalglymetglyleuaspthrargthr

130135140

glnthrtrpmetseralagluglyalatrpargglnvalglulysval

145150155160

gluthrtrpalaleuarghisproglyphethrileleualaleuphe

165170175

leualahistyrileglythrserleuthrglnlysvalvalilephe

180185190

ileleuleumetleuvalthrprosermetthrmetargcysvalgly

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valglyasnargaspphevalgluglyleuserglyalathrtrpval

210215220

aspvalvalleugluhisglyglycysvalthrthrmetalalysasn

225230235240

lysprothrleuaspilegluleuglnlysthrglualathrglnleu

245250255

alathrleuarglysleucysilegluglylysilethrasnilethr

260265270

thraspserargcysprothrglnglyglualavalleuprogluglu

275280285

glnaspglnasntyrvalcyslyshisthrtyrvalaspargglytrp

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asnleulystyrthrvalileilethrvalhisthrglyaspglnhis

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