缺氧相关基因在预测I/II期结直肠癌的试剂盒中的应用的制作方法

本发明涉及缺氧相关基因在预测i/ii期结直肠癌的试剂盒中的应用。

背景技术：

结直肠癌(crc)是世界常见癌症之一，每年有接近140万新发病例。虽然新治疗方案层出不穷，但是5年存活率只有55％。手术治疗作为一线方案，但是按照传统临床特征定义为同一类型的病人，治疗后的预后效果也有很大区别。近年来研究认为这主要是有癌症病人的分子异质性导致。

基因分子标志物，是指基于一组基因的表达，通过机器学习建立数学模型，用于预测临床上的具体目标。近年来基因表达检测手段已经相当成熟，包括高通量的rna测序技术、微阵列技术(microarray)，以及相对低通量的实时定量聚合酶链式反应(rt-qpcr)和nanostring技术等。但是如何找到一组用于结直肠癌预后预测的基因组合，以及优化的数学模型用于预测，并能达到良好效果，已知的研究较少。

缺氧相关基因，已被近年来的大量研究指出，其癌症的产生和发展起了至关重要的作用。特别是，肿瘤微环境和结直肠癌的发展有紧密联系，均和缺氧相关。但是，目前少有用缺氧相关基因来预测结直肠癌预后且未有大规模研究。

现有技术的主要缺点：没有有机结合缺氧相关基因在结直肠癌上的作用，且没有进行大规模验证。更重要的是，已有的基因组合在使用时有诸多问题，例如，很多产品要求必须使用一整套试剂盒，在完全标准的前提下需对病人重新测量才能进行预测，对其他测量手段没有兼容性。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了缺氧相关基因在预测i/ii期结直肠癌的试剂盒中的应用，通过检测本发明发筛选出14个缺氧相关基因，并代入风险模型中即可准确判断i/ii期结直肠癌病人治疗后的预后风险。

为实现上述目的，所采取的技术方案：基因mdm2、vegfa、orai3、mvd、traf3、cyb5r3、zbtb44、casp6、fbp1、ccng1、fam117b、prelid2、rrp1b和gas6的联合使用在制备用于预测i/ii期结直肠癌病人预后的试剂盒中的应用。

另外，本发明还提供检测缺氧相关基因的表达水平的试剂在制备用于预测i/ii期结直肠癌病人预后的试剂盒中的用途，所述试剂用于检测基因mdm2、vegfa、orai3、mvd、traf3、cyb5r3、zbtb44、casp6、fbp1、ccng1、fam117b、prelid2、rrp1b和gas6的mrna表达水平。

另外，本发明还提供一种用于预测i/ii期结直肠癌病人预后的试剂盒，其包括用于检测检测基因mdm2、vegfa、orai3、mvd、traf3、cyb5r3、zbtb44、casp6、fbp1、ccng1、fam117b、prelid2、rrp1b和gas6的mrna表达水平的试剂。

另外，本发明还提供一种用于预测i/ii期结直肠癌病人预后的系统，其包括：

数据输入模块，用于将结直肠癌病人的缺氧相关基因的mrna表达值的结果输入模型计算模块，所述缺氧相关基因包括基因mdm2、vegfa、orai3、mvd、traf3、cyb5r3、zbtb44、casp6、fbp1、ccng1、fam117b、prelid2、rrp1b和gas6；所述mrna表达值为通过bioconductor的geoquery程序包标准化处理后的mrna表达水平数据；

模型计算模块，包括lassocox风险模型，用于根据结直肠癌病人缺氧相关基因的mrna表达值以及lassocox风险模型计算病人风险分数；所述风险分数的计算公式为：riskscore＝-0.013×exp(mdm2的mrna表达值)+0.0733×exp(vegfa的mrna表达值)+0.112×exp(orai3的mrna表达值)+0.043×exp(mvd的mrna表达值)-0.060×exp(traf3的mrna表达值)-0.003×exp(cyb5r3的mrna表达值)-0.003×exp(zbtb44的mrna表达值)-0.045×exp(casp6的mrna表达值)+0.082×exp(fbp1的mrna表达值)-0.026×exp(ccng1的mrna表达值)-0.032×exp(fam117b的mrna表达值)-0.025×exp(prelid2的mrna表达值)-0.129×exp(rrp1b的mrna表达值)+0.014×exp(gas6的mrna表达值)，高风险组和低风险组的cutoff值-0.037；

结果输出模块，用于根据结直肠癌病人风险分数来预测结直肠癌病人治疗后的预后风险；当结直肠癌病人风险分数≥-0.037时，结直肠癌病人为高风险，生存会显著差，需要更多的临床关注和更好的临床管理；当结直肠癌病人风险分数＜-0.037时，结直肠癌病人为低风险，生存较好，可以用更温和的治疗方案，避免过度治疗。

本发明的有益效果在于：本发明提供了缺氧相关基因在预测i/ii期结直肠癌的试剂盒中的应用，本发明结合缺氧相关基因，找到一组可以稳定预测i/ii期结直肠癌预后的14个缺氧相关基因；在不需要使用标准化技术平台统一测量前提下，可以兼容任何类型的测量平台来预测i/ii期结直肠癌的预后；另外，本发明还进行了单变量及多变量分析，证明采用此风险模型计算的缺氧风险分数(immunerisk)确实可以独立预测结直肠癌病人预后风险。

附图说明

图1显示lasso勾选用于结直肠癌预后预测的缺氧相关基因；

图2为采用构建好的缺氧相关基因模型进行结直肠癌病人预后分析；其中，图a、d、g显示缺氧相关征基因构建的结直肠癌预后模型对training、validation-1和validation-2三个队列病人进行风险评分(纵坐标)与i/ii期结直肠癌复发与否的分布(横坐标)概况图；图b、e、h显示缺氧相关基因构建的结直肠癌预后模型结合training、validation-1和validation-2三个队列结直肠癌病人2年、3年以及5年随访信息的roc曲线图，auc(曲线下面积)体现缺氧相关基因具备很好的结直肠癌病人预后预测效果；图c、f、i显示缺氧相关基因模型划分的缺氧高风险组与低风险组在training、validation-1和validation-2三个队列中的生存曲线图，hr(风险比)体现缺氧相关基因划分的高风险组与低风险组能可有效划分结直肠癌病人的dfs(无瘤生存时间)，p＜0.05。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

结直肠癌预后免疫相关基因的发掘

使用公开高通量geo数据库中的编号为gse39582的数据集作为开发数据集，测量平台为affymetrix公司的微阵列平台，包含566例结直肠癌病人样本，下称cit微阵列数据集。其中，557例病人有完整的临床预后信息，309例有早期结直肠癌病例。缺氧相关基因从immport数据库获得，合计3444个基因，49个分类，其中1636个缺氧相关基因在cit微阵列数据集上测量到了并且在不同病人之间表达有显著差异(medianabsolutedeviation大于0.5)。进一步利用重采样技术进行1000次采样分析，找到与预后稳定相关的106个缺氧相关基因。

构建用于结直肠癌预后预测的免疫相关基因

根据病人的预后信息，使用lassocox模型，将106个缺氧相关基因缩减到14个基因(见图1)：mdm2、vegfa、orai3、mvd、traf3、cyb5r3、zbtb44、casp6、fbp1、ccng1、fam117b、prelid2、rrp1b和gas6。

预后模型的建立

使用14个缺氧相关基因，建立预测模型，并通过大规模样本验证(6个独立数据集，1877例病人)证明确实可以显著预测病人预后；风险分数的计算公式为：riskscore＝-0.013×exp(mdm2的mrna表达值)+0.0733×exp(vegfa的mrna表达值)+0.112×exp(orai3的mrna表达值)+0.043×exp(mvd的mrna表达值)-0.060×exp(traf3的mrna表达值)-0.003×exp(cyb5r3的mrna表达值)-0.003×exp(zbtb44的mrna表达值)-0.045×exp(casp6的mrna表达值)+0.082×exp(fbp1的mrna表达值)-0.026×exp(ccng1的mrna表达值)-0.032×exp(fam117b的mrna表达值)-0.025×exp(prelid2的mrna表达值)-0.129×exp(rrp1b的mrna表达值)+0.014×exp(gas6的mrna表达值)，roc曲线划分免疫高风险组和低风险组的cutoff值-0.037；见表1。

表1各基因功能及其在模型中的比重β

实施例2使用此模型对结直肠癌预后进行预测

如图2所示，采用构建好的缺氧相关基因模型进行结直肠癌病人预后分析，结果显示缺氧相关基因具备很好的结直肠癌病人预后预测效果。

另外，如表2～4所示，本发明还进行了单变量及多变量分析，证明使用本发明模型计算的缺氧风险分数(immunerisk)确实可以独立预测i/ii期结直肠癌病人预后风险。

表2

表3

表4

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。