生物标志物UGGT1在宫颈疾病中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及生物标志物uggt1在宫颈疾病中的应用。

背景技术：

宫颈鳞癌是目前最为常见的、并且极大程度威胁广大女性身体健康的妇科恶性肿瘤之一(wuc,krarp,zhaik,changj,wangz,liyhuz,hez,jiaw,abnetcc,et.algenome-wideassociationanalysesofcervicalsquamouscellcarcinomainchineseidentifymultiplesusceptibilitylociandgeneenvironmentinteractions.natgenet2015.44:1090-1097.)。宫颈鳞癌死亡率据统计居女性肿瘤第二位，其比例在全世界女性恶性肿瘤中，宫颈鳞癌的发病率位居第三位(chenm,huangj,zhuz,zhangj,lik:systematicreviewandmeta-analysisoftumorbio-markersinpredictingprognosisincervicalcancer.bmccancer2014,13:539.)。根据2015年全球数据统计，预计大约每年有531,800例新发宫颈鳞癌病例，其中有272,700例为死亡病例。在中国每年新增的宫颈鳞癌的患者已经超过130,000例，约占全球发病数量的三分之一，已经成为影响社会发展的沉重的医疗负担[4]。自20世纪50年代以后，宫颈癌的细胞学相关筛查、预防以及治疗的工作也取得了长足进展，推广至全球范围得以广泛的应用，使得宫颈鳞癌能够更早的被发现，从而使得宫颈鳞癌的治疗取得了举世瞩目的良好的治疗效果。然而，近50年以来，由于社会生活的改变及进步，人乳头瘤状病毒(humanpapillomavirus，hpv)感染人数较前明显增多，宫颈癌的发病在一些地区有了上升的趋势，且近年出现宫颈鳞癌发病年轻化的现象。根据2013年国际妇产科联盟(internationalfederationofgynecologyandobstetrics，figo)调查报告统计，宫颈鳞癌的发病年龄从上世纪50年代平均为60岁，而至上世纪90年代，宫颈鳞癌的平均发病年龄就下降到了50岁，宫颈鳞癌再次成为妇女健康的主要杀手(ghadbant,schmidt-yangm,uzunoglufqperezdr,tsuitye1gammalar,erbespj,zilbennintsv,wellneru,pantelk,eta1:ana/cgermlinesingle-nucleotidepolymorphisminthetnrfaip3geneisassociatedwithadvanceddiseasestageandsurvivalinonlysurgicallytreatedesophagealcancer.jhumgenet2015,60:107.)。

宫颈癌的病理分型相对其它恶性肿瘤来说比较简单，主要分为鳞癌与腺癌两种类型(renz,zhuj,guh,liur,chens,ronggsunb:decoyreceptor3polymorphismsarenotassociatedwiththeriskofesophagealcancerinachinesepopulationbio-markers2014,19:340-344.)，其中鳞癌所占的比重为80％，腺癌的比重不到20％，其余的病理类型比较少见，包括腺鳞癌、小细胞癌、黑色素瘤、肉瘤等。宫颈鳞癌的发生与发展经历一种复杂的过程。这种复杂的体系包括包括：部分基因在表达方面的异常调控、部分基因通过抑制其信号通路、部分基因则激活其信号通路，进一步引起肿瘤细胞的过度增殖、肿瘤细胞的分化的异常，进一步进展为癌前病变，随后表现为肿瘤特有的侵袭和转移等恶性的生物学行为。

在临床工作中可以发现，临床病理及分期近似的中晚期宫颈鳞癌患者，尽管采用相同的标准的同期放化疗方案，其治疗效果也是有较大的差异，局部控制率患者有时出现远处转移情况，甚至有部分患者在放疗期间即表现出明显的放化疗抗拒，治疗效果极差(maruyamar,suzukih:longnoncodingrnainvolvementincancer.bmbrep2012,45:604-611.)。这一部分放疗不敏感的患者就成为临床治疗中的难题，即需要临床医师寻找敏感特异的预测方法。因此，为了进一步改变宫颈癌的快速增长的高发病率，完善宫颈癌的临床靶向性治疗方案，寻找组织特异性的宫颈癌相关肿瘤基因的鉴定成为其在理论和技术上的预诊、治疗的新手段。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种宫颈疾病的临床诊断和治疗的分子靶标。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测uggt1的试剂在制备早期诊断宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的产品中的应用。

进一步，所述产品包括：芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。

本发明提供了一种诊断宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的产品，所述产品包括检测uggt1水平的试剂。

进一步，所述试剂选自特异性针对uggt1的探针、引物或蛋白结合剂。

进一步，针对uggt1的引物序列如seqidno.1～2所示。

本发明提供了uggt1在筛选治疗宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的候选药物中的应用。

本发明提供了一种筛选治疗宫颈鳞癌的候选药物的方法，步骤包括：

用待筛选物质处理表达或含有uggt1基因或其编码的蛋白的培养体系；和

检测所述体系中uggt1基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述待筛选物质可以抑制uggt1基因的水平或表达活性，则表明该待筛选物质是治疗宫颈鳞癌的候选药物。

本发明提供了uggt1的抑制剂在制备治疗宫颈鳞癌及其转移、侵袭的药物中的应用。

进一步，所述抑制剂包括降低高uggt1基因或其表达产物稳定性、下调uggt1基因或其表达产物的表达水平、减少uggt1基因或其表达产物有效作用时间的物质；优选的所述抑制剂是sirna。

本发明提供了一种治疗宫颈鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括uggt1的抑制剂，优选的uggt1的抑制剂为uggt1的核酸抑制物，更为优选的，所述核酸抑制物为sirna。

附图说明

图1是利用qpcr检测uggt1基因在宫颈鳞癌患者中的表达情况图；

图2是uggt1基因表达水平图；

图3是cck-8法检测uggt1对细胞增殖活性的影响图；

图4是利用transwell小室检测uggt1基因对细胞迁移侵袭的影响图，其中图a是对细胞迁移的影响图；图b是对细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明通过高通量测序技术以及进行高通量测序分析，检测宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌患者组织中的基因表达水平，发现其中表达具有明显差异的基因，探讨其与宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的发生之间的关系，从而为宫颈鳞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。经过筛选本发明首次发现了uggt1在宫颈鳞癌患者中表达上调，并通过基因沉默技术进一步验证了uggt1参与宫颈癌细胞的增殖、侵袭过程，提示uggt1可作为宫颈鳞癌的独立预测因子，也可以和其他的基因标志物联合应用。

本文所用术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定mrna的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的rna和/或所述生物标志物mrna的一种或多种剪接变体表达水平的差异。“差异表达的”还可以包括与第二种样品或样品群中蛋白质表达量或水平比较，对样品或样品群中本发明生物标志物编码的蛋白质的测定。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较，经测定rna的量和/或蛋白质的量，样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。本文所用“差异表达”可以用给定生物标志物的表达水平相对于对照中给定生物标志物的平均表达水平的比率进行测定，其中比率不等于1.0。还可以用p值测定差异表达。当使用p值时，当p值小于0.1时生物标志物被鉴定为在第一和第二群体之间差异表达。更优选p值小于0.05。甚至更优选p值小于0.01。还更优选p值小于0.005。最优选p值小于0.001。当基于比率确定差异表达时，如果第一种和第二种样品中表达水平的比率大于或小于1.0，则rna或蛋白质是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一群体的平均表达水平与第二群体的平均表达水平的比率大于或小于1.0，则核酸转录本是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一个样品中表达水平与第二个群体中平均表达水平的比率大于或小于1.0，例如包括比率大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20，或比率小于1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05，则核酸转录本是差异表达的。

“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以rna表达或蛋白质表达测定)显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以rna表达或蛋白质表达测定)显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如，上调基因包括与从正常个体分离的mrna或蛋白质的表达相比，从以患有宫颈病变疾病为特征的个体分离的组织中mrna或蛋白质表达水平增加的基因。例如，下调基因包括与从正常个体分离的组织相比，从以患有宫颈病变疾病为特征的个体分离的组织中mrna或蛋白质表达水平降低的基因。

uggt1基因

术语“uggt1”(基因id：56886)指udp-glucoseglycoproteinglucosyltransferase1基因与蛋白且涵盖其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的uggt1，以及源自细胞中加工的任何形式的uggt1。该术语涵盖uggt1的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如uggt1基因，人uggt1的mrna序列(例如genbank登录号nm_020120.3)，和人uggt1的氨基酸序列(genbank登录号np_064505.1)以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的uggt1dna，mrna，和氨基酸序列。在本发明的具体实施方式中，uggt1为人的uggt1基因及其表达产物。

本发明的uggt1核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平或翻译水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的基因和蛋白使用本领域普通技术人员已知的多种技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)。其中，pcr需要在扩增前将rna逆转录成dna(rt-pcr)，tma和nasba直接扩增rna。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ish)、微阵列和southern或northern印迹。原位杂交(ish)是一种使用标记的互补dna或rna链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ish)中的特异性dna或rna序列的杂交。

本发明的蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心elisa，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(ria)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(elisa)、酶免疫测定(eia)、荧光免疫测定(fia)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

检测uggt1蛋白的试剂为uggt1蛋白的特异性结合剂。特异性结合剂是例如蛋白质uggt1的受体、结合蛋白质uggt1的凝集素、针对蛋白质uggt1的抗体、针对蛋白质uggt1的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。

特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。在本发明的具体实施例中，所述特异性结合剂为uggt1特异性抗体。

本发明提供了检测uggt1的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针或抗体，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于uggt1所示的部分或全部序列，所述抗体特异性的结合uggt1蛋白。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测uggt1基因或蛋白的试剂。选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测。

在某些实施方案中，本文提供的是用于检测一种或多种生物标志物的蛋白质水平的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含用识别蛋白质生物标志物的抗体包被的试纸条、洗涤溶液、进行该试验的试剂、蛋白质分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。

抑制剂和药物组合物

本发明提供了一种药物(组合物)，它含有有效量的所述的uggt1的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述抑制剂包括降低uggt1基因或其表达产物稳定性、下调uggt1基因或其表达产物的表达水平、减少uggt1基因或其表达产物有效作用时间的物质。例如所述抑制剂包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。

作为本发明的一种选择方式，所述的uggt1的抑制剂是一种特异性与uggt1结合的抗体。所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体；本发明不仅包括完整的抗体分子，也包括抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与uggt1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体

作为本发明的一种优选方式，所述uggt1的抑制剂是一种uggt1特异性的小干扰rna分子。如本文所用，所述的“小干扰rna”是指一种短片段双链rna分子，能够以同源互补序列的mrna为靶目标降解特定的mrna，这个过程就是rna干扰(rnainterference)过程。小干扰rna可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链rna复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链rna复合物。

在筛选有效的sirna序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种sirna序列，并将它们分别通过转染试剂转染相关细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的sirna，并进一步地在细胞水平实验，从而证明基因对相关细胞的影响。

本发明的核酸抑制物如sirna可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链rna之后进行制备。sirna等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

作为本发明的一种可选方式，所述的uggt1的抑制剂也可以是一种“小发夹rna(smallhairpinrna，shrna)”，其是能够形成发夹结构的非编码小rna分子，小发夹rna能够通过rna干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shrna可以由双链dna模板来表达。双链dna模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shrna在真核细胞内dicer酶的作用下，可被切割成小干扰rna分子，从而进入rnai途径。“shrna表达载体”是指一些本领域常规用于构建shrna结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shrna(或类似物)相应的dna序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该dna序列转录后的rna可形成shrna(shorthairpin)结构。所述的“shrna表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。

在本发明中，可将这些抑制剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

在本发明中，药学上可接受的载体，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、ph控制剂及表面活性剂等添加剂。

其中，稳定剂包括人类血清蛋白、l-氨基酸、糖及纤维素衍生物。l-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。

本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。

本发明的药物组合物还可以与其他治疗宫颈鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将uggt1的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带uggt1的促进调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选与宫颈鳞癌相关的基因标志物

1、样本收集

收集32例宫颈鳞癌(cesc)组织和18正常组织(n)，24例宫颈上皮内瘤样病变(cin)组织，所有病例术前未做任何免疫抑制剂治疗、放疗以及化疗，所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。每组各取4例标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部病例标本中进行验证实验。

2、rna样品的制备

利用qiagen的组织rna提取试剂盒提取各组组织中的总rna，具体步骤参考说明书。

3、rna样品的质量分析

将上述提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳，利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。

4、cdna文库的构建

利用illuminatruseqtmrnasampleprepkit进行cdna文库的构建，具体操作按说明书进行。

5、测序

使用illuminax-ten测序平台对cdna文库进行测序，具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，采用metama包分析，meta分析中p值合并所用方法为inversenormalmethod，差异表达基因的筛选标准是fdr<0.05。

7、结果

rna-seq结果显示，与正常对照相比，uggt1基因在宫颈鳞癌组织、以及在宫颈上皮内瘤样病变组织中的表达量显著上调，其中宫颈鳞癌组织中的表达量与宫颈上皮内瘤样病变组织相比，表达量也显著上调，差异具有统计学意义，因此对uggt1进行进一步的大样本验证。

实施例2qpcr测序验证uggt1基因的差异表达

1、对uggt1基因差异表达进行大样本qpcr验证。

2、rna提取

利用qiagen的组织rna提取试剂盒提取各组组织中的总rna，具体步骤参考说明书。

3、qpcr

1)逆转录反应

采用fastqμantcdna第一链合成试剂盒(货号：kr106)进行lncrna反转录，首先去除基因组dna反应，在试管中加入5×gdnabμffer2.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min.

将10×fastrtbμffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

2)引物设计

根据genebank中uggt1基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

uggt1基因：

正向引物为5’-tctccactgttcactctg-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-cactgtccacctcttctaa-3’(seqidno.2)。

gapdh基因：

正向引物为5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.4)。

3)qpcr扩增检验

用superrealpremixplus(sybrgreen)(货号：fp205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：2×superrealpremixplus10μl，正反向引物(10μm)各0.6μl，5×roxreferencedye^△2μl，dna模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。

4)cdna模板浓度的筛选

将各样本cdna混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线，可以看出，当cdna的进行10倍稀释时，pcr的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。

5)样品realtimepcr检测

将各样品cdna10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-δδct法进行相对定量。

4、结果

结果如图1所示，与正常组织相比，宫颈鳞癌组织和宫颈上皮内瘤样病变组织中的uggt1表达量显著上调，其中宫颈上皮内瘤样病变组织与正常组织相比，呈现显著性上调，宫颈鳞癌组织与宫颈上皮内瘤样病变组织相比，呈现显著性上调，差异均具有统计学意义(p<0.05)。

实施例3uggt1基因的过表达

1、细胞培养

宫颈鳞癌细胞(hela)用含10％胎牛血清和1％p/s的rpim-1640培养基在37℃、5％co2的培养箱中培养，当细胞长至80％～90％时，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。

转染前，将对数生长期的细胞消化轻轻吹打成单细胞悬液，用不含抗生素的培养基接种于6孔板，6孔板的细胞密度达2×10⁵个/孔，当细胞融合率达40％-60％进行转染试验。

2、uggt1基因sirna的设计

阴性对照sirna-nc的序列：

正义链：5’-uucuccgaacgugucacgu-3’(seqidno.5)，

反义链：5’-acgugacacguucggagaa-3’(seqidno.6)；

sirna1：

正义链：5’-aaccauuuuguuguaagagag-3’(seqidno.7)，

反义链：5’-cucuuacaacaaaaugguuuu-3’(seqidno.8)；

sirna2：

正义链：5’-aauuccaaaauuucucuugac-3’(seqidno.9)，

反义链：5’-caagagaaauuuuggaauuuu-3’(seqidno.10)；

sirna3：

正义链为5’-aucagauucacaagucuucuu-3’(seqidno.11)，

反义链为5’-gaagacuugugaaucugauac-3’(seqidno.12)

3、转染

将实验分为3组，分别为对照组(hela)、阴性对照组(sirna-nc)、实验组(转染sirna1～3)，按照invitrogen公司的lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染。

4、qpcr检测uggt1基因的转录水平

1)细胞总rna的提取

采用qiagen的细胞rna提取试剂盒进行细胞总rna的提取，具体步骤详见试剂盒说明书

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3qpcr扩增步骤同实施例2。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，沉默uggt1基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图2显示，与对照组相比，阴性对照组uggt1的水平无显著变化，相比对照组和阴性对照组，实验组uggt1的水平显著降低，而sirna1的沉默效果最为显著，因此选择sirna1进行后续的实验。

实施例4cck-8法检测宫颈鳞癌细胞增殖活性

1、转染6小时后用0.25％胰蛋白酶消化细胞，用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液(1×10⁴/孔)，接种于96孔培养板中(100μl/孔)，每组各设6个复孔，同时设立无细胞的培养液空白对照。

2、于检测时间点(0h，24h，48h，72h，96h，120h)分别加入细胞增殖检测试剂cck-8，工作浓度为1:10，即100μl培养液加入10μlcck-8；

3、在37℃，5％co2孵育箱中孵育1h后，进行检测，酶标仪读数od450nm。

4、结果判断：转染后0h，24h，48h，72h，96h，120h使用酶标仪观察hela细胞的增殖活性，细胞在波长450nm处的吸光光度值(od值)表示处于增殖状态的细胞数量，以无细胞的培养液组od值为对照。

5、结果

结果如图3所示，转染sirna1的实验组的细胞增殖显著减少，提示改变uggt1的表达水平可以改变宫颈鳞癌细胞的增殖能力，说明uggt1与宫颈鳞癌细胞的增殖相关。

实施例5transwell方法检测宫颈鳞癌细胞迁移和侵袭

1、细胞迁移能力检测

1)迁移前一天将完全培养基加入孔板中，放入小室置于培养箱中过夜；

2)将转染48h后的细胞进行饥饿处理，收集细胞计数，用0.2％bsa的无血清培养基制成1×10⁵的悬液。

3)取200μl细胞悬液接种于transwell小室内培养。

4)取出小室，吸干剩余液体后置于70％甲醇固定30min，用棉签擦去上室面的细胞。

5)小室浸入0.4％结晶紫染色10min，pbs清洗两遍，显微镜下随机选取视野计数膜底面的细胞数。

2、细胞侵袭能力检测

1)侵袭实验前一天在冰上用rpim16401:8稀释基质胶，每个24孔悬挂式小室底部膜上室面加稀释后的基质胶60μl干燥待用。

2)水化基底膜：每孔加入50μl含10g/lbsa的无血清培养液，37℃，30min，吸出培养板中残余液体。

3)将转染48h后的细胞进行饥饿处理，收集细胞计数，用0.2％bsa的无血清培养基制成1×10⁵的悬液。

4)取出小室，吸干剩余液体后置于70％甲醇固定30min，用棉签擦去上室面的细胞。

5)小室浸入0.4％结晶紫染色10min，pbs清洗两遍，显微镜下随机选取视野计数膜底面的细胞数。

3、数据处理

用spss18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。

4、结果

结果如图4所示，实验组的细胞迁移和侵袭数分别较转染空白质粒的少，说明降低uggt1基因的表达水平可以降低宫颈鳞癌细胞的迁移和侵袭能力，提示uggt1可作为分子靶标应用于宫颈鳞癌的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>北京泱深生物信息技术有限公司

<120>生物标志物uggt1在宫颈疾病中的应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tctccactgttcactctg18

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>rna

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<400>9

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<212>rna

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<400>10

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<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

aucagauucacaagucuucuu21

<210>12

<211>21

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

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