基于hnRNPA1剪接变体诊断慢粒急变期的试剂及试剂盒的制作方法

文档序号：17924348发布日期：2019-06-15 00:18阅读：350来源：国知局

本发明涉及hnrnpa1剪接变体作为标志物在诊断慢性粒细胞白血病急变期患者中的应用，以及制备相应的检测试剂和试剂盒盒中的应用。

背景技术：

慢性粒细胞性白血病(chronicmyeloidleukemia,cml)是一种起源于多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，约占人白血病的20％。研究发现约95％的cml患者存在异常的细胞遗传学改变，即9号染色体和22号染色体交互易位形成费城染色体(philadelphia，ph)和bcr-abl融合基因。bcr/abl融合蛋白具有强烈酪氨酸激酶活性，异常激活下游多条信号通路，刺激造血细胞异常增殖和恶性转化。cml的病程通常分为慢性期、加速期及急变期三个阶段，慢性期相对较长且症状可控，如不经合理治疗疾病会不可避免经加速期进展到急变期，而一旦急变，预后极差。

针对cml急变的诊断，国内外出台了多套标准。这些标准的诊断指标主要有骨髓/外周血原始细胞计数、细胞克隆演化、脾肿大程度及临床药物反应性等(融合基因bcr/abl定量由于对诊断急变不敏感而未被纳入)。综合而言，这些指标均过于依赖cml细胞生物学表型和临床表现，只在急变发生之后才有一定的诊断价值，而不能在急变前期提供预警，导致临床上一再错失最佳治疗时机。因此，cml急变早期预警、靶向治疗这两个紧密相连的重要环节都亟待寻求突破。

可变剪接是指选择性地对前mrna剪接位点的组合剪接加工，形成不同的成熟mrna，从而使一个基因产生若干个具有独特结构和功能的蛋白质异构体的过程。近年来的研究表明，可变剪接与疾病例如癌症等的发育、分化有关，许多疾病相关基因受可变剪接调控，回顾研究发现，其中cml的特征融合基因bcr-abl的异常选择性可变剪接出现与cml耐药和急变的发生密切相关。wnt通路作为转录组和蛋白质组多样性的重要驱动因素，调控基因的突变和可变剪接是导致白血病进展和治疗耐药性的重要因素。

核内不均一性核糖核蛋白a1基因(heterogeneousnuclearribonucleoproteinsa1,hnrnpa1)属于hnrnp家族，参与核酸代谢的多个过程，包括rna转录、外显子剪接、前mrna的成熟和降解等。已有研究报道hnrnpa1存在两种经实验验证的蛋白亚型，全长a1-b亚型为372aa，分子量为38kda，较短的320aa是34kda为a1-a亚型，其缺失残基253～303。这两个亚型是通过选择性保留/跳跃外显子8产生的，在一些研究中也称之为hnrnpa1外显子7b。虽然前期一些研究报道证实可变剪接在cml的发生发展过程中扮演重要角色，但尚未有可变剪接，包括hnrnpa1可变剪接可能调控前mrna异常剪接并参与慢粒急变进展的报道，因此，本领域对于慢粒急变的早期、准确和特异性的检测有迫切的需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够准确早期预警慢性粒细胞白血病急变期(慢粒急变期)的诊断试剂和诊断试剂盒，以及使用所述试剂或试剂盒预警慢粒急变的方法。

本发明的一个方面在于提供了hnrnpa1剪接变体用于制备诊断慢性粒细胞白血病急变期的试剂或含有所述诊断试剂的试剂盒中的用途，所述hnrnpa1剪接变体是hnrnpa1-a亚型(核苷酸序列如seqidno.1)和/或hnrnpa1-b亚型(核苷酸序列如seqidno.2)。

所述hnrnpa1-a亚型是hnrnpa1的8号外显子选择性跳跃产生的剪接变体，所述hnrnpa1-b亚型是hnrnpa1的8号外显子选择性保留产生的剪接变体。

本发明的另一个方面在于：提供了诊断受试者是否处于慢粒急变期的方法，该方法包括至少两个步骤：(a)测定怀疑处于慢性粒细胞白血病急变期的受试者外周血标本中hnrnpa1-a亚型和/或hnrnpa1-b亚型的表达量/结合量；和

(b)根据hnrnpa1-a亚型和/或hnrnpa1-b亚型的表达量/结合量，评估该受试者是否处于慢性粒细胞白血病急变期。

作为本发明优选的实施方案，所述评估包括：

(1)将所测定的hnrnpa1-a亚型的表达量/结合量与预确定的阈值进行比较，所测定的hnrnpa1-a亚型表达量/结合量低于阈值；或者

(4)将所测定的hnrnpa1-b亚型的表达量/结合量与预确定的阈值进行比较，所测定的hnrnpa1-b亚型表达量/结合量高于阈值；或者

(5)将所测定的hnrnpa1-a亚型和hnrnpa1-b亚型表达量/结合量之比与预确定的阈值进行比较，所测定的hnrnpa1-a亚型和hnrnpa1-b亚型之比低于阈值；

指示该受试者处于慢性粒细胞白血病急变期。

作为本发明优选的实施方案，所述试剂包括检测hnrnpa1-a亚型的核酸扩增引物和/或检测hnrnpa1-b亚型的核酸扩增引物。

作为本发明优选的实施方案，所述检测hnrnpa1-a亚型的核酸扩增引物，其引物上游5'-3'：ggtaatgatggaagcaattt，下游5'-3'：cctcccttcatgggtccaaa，所述检测hnrnpa1-b亚型的核酸扩增引物，其引物上游5'-3'：gaggctatggaagtggtgga，下游5'-3'；cctcccttcatgggtccaaa。

作为本发明优选的实施方案，所述试剂包括检测hnrnpa1-a亚型的核酸探针和/或检测hnrnpa1-b亚型的核酸探针。

作为本发明优选的实施方案，所述检测hnrnpa1-a和hnrnpa1-b亚型的核酸探针为5'-3'：tttggaggtggtggaagctacaat。

作为本发明优选的实施方案，所述试剂包括抗-hnrnpa1-a亚型蛋白抗体和/或抗-hnrnpa1-b亚型蛋白抗体。

本发明具有的有益效果为：

本发明将hnrnpa1剪接变体hnrnpa1-a亚型和/或hnrnpa1-b亚型用于诊断慢性粒细胞白血病急变期，具有较高的灵敏度和特异性，可以更简单、准确的方法及早观察到疾病进展，及时采取治疗手段，具有较高的临床应用价值。

附图说明

图1为本发明中验证预警慢粒急变的hnrnpa1可变剪接的流程示意图；

图2为本发明中高通量测序hnrnpa1剪接变体差异表达示意图；

图3为本发明中qpcr验证hnrnpa1剪接变体在各组表达情况图；

图4为本发明中免疫印迹验证hnrnpa1剪接变体亚型在各组表达情况图；

图5为本发明中hnrnpa1剪接变体测序验证图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。除了特别指明，以下实施例中所使用的技术手段和操作方法为本领域技术人员所熟知的常规手段和方法，所使用原料均为市售商品。

发明人采用高通量技术，通过比较慢粒急变患者、慢粒慢性期患者和正常对照组外周血单个核细胞总rna可变剪接表达谱的差异，发现hnrnpa1-a剪接亚型在慢粒急变组中有较低的特异性表达。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、cml病患和健康对照组标本采集

据2016年cml的nccn诊断标准，收集初次诊断并未进行治疗慢粒初发和急变病患外周血标本，以及健康体检组外周血标本。

二、外周血单个核细胞提取

ficoll密度梯度离心法：①将5ml全血置入50ml离心管中，5mlpbs溶液稀释，轻轻混匀；②取两支15ml离心管先加入5mlficoll溶液。然后将稀释的血液用移液管(各5ml)轻轻加到ficoll上层(避免两种溶液混合)；③离心2000rpm，20min；④用吸管吸取白色细胞层(即pbmc)放入干净的15ml离心管中；⑤加入pbs至10-15ml，1500rpm，10min离心后去掉上清，加入trizol混匀。-80℃保存备用。

三、总rna提取

trizol法：①加入1mltrizol/5×106个pbmc加入，放置无核酶ep管中反复吹打后，室温静置5min；②加入0.2ml氯仿/1mltrizol，剧烈震荡15s，室温静置2-3min；③4℃，12000rpm，离心15min，最上层的无色水相层(约50％)为rna层(可见三层，轻拿轻放，避免三层液体混合)；④轻轻吸取上层水相至新的ep管中(避免吸到中间层)，加入0.5ml异丙醇/1mltrizol，颠倒混匀，室温放置10min；⑤4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，胶状沉淀可见于ep管侧壁及管底；⑥rna沉淀用1ml的75％乙醇溶液(用无水乙醇和无核酶水现配)吹打混匀洗涤，后4℃、7500rpm，离心5min；⑦弃上清后获rna沉淀于室温干燥5-10min，加入无核酶水(适量)溶解rna，-80℃保存备用。

四、rt-pcr分析

1.对rna-seq数据进行验证，通过时实荧光定量pcr(qrt-pcr)方法，选择各组间多个degs和rasg进行表达水平比较。来自各组样本的总rna用rq1dnase酶除去除dna。总rna纯度和浓度测定，备用。

2.模板dna即cdna的合成：按takara逆转录反应试剂盒说明对制备的总rna进行反转录，配制反应体系如下：

其中，100ng的总rna，据rna浓度可换算所需加入的体积。配制体系需在冰上操作完成，精准加样，避免操作误差。配制好的体系需点动混匀并离心，随后置于pcr扩增仪上逆转录，反应条件为37℃15min、85℃5s和4℃30min，逆转录结束后及时取出扩增产物(即为模板cdna)，-20℃保存备用。

3.目的基因的pcr扩增：加入模板cdna、hnrnpa1的8号外显子跳跃可变剪接特异基因的扩增引物及其他必须试剂配制反应体系在pcr扩增仪上进行扩增。各可变剪接亚型的扩增引物序列、退火温度如下(其中gapdh作为本实验的内参)：

4.sybrgreen法qrt-pcr检测：①差异基因及内参gapdh引物由北京全式金公司合成，分别用无核酶水溶解为10nmol/ml，备用；②按takara荧光定量试剂盒配制qrt-pcr反应体系如下表：

③反应条件：95℃20s，然后按95℃10s、退火温度(上文)、20s和70℃30s的顺序循环40次；④分析结果：结合扩增曲线及熔解曲线判断扩增效果，利用δδct法计算目的基因的相对表达量，计算公式如下：

δδct＝(ct基因–ctgapdh)cml-bc/cp–(ct基因–ctgapdh)ctrl

五、免疫印迹(westernblot)分析

1.pbmc总蛋白提取：①收集各实验组pbmc，加入0.5ml裂解液/5×106个细胞，振荡重悬，4℃静置2min；②加入1ml蛋白抽提试剂/0.5ml裂解液中，振荡混匀，4℃静置10min；③4℃，10000g，离心10min，可见两相，蛋白膜在两相中间。移液管吸除表层相和底层相，保留中间蛋白絮状物。(如果离心以后不能分相，可再加入三蒸水50μl，最后混匀离心)；④蛋白沉淀用1ml无水乙醇洗涤，4℃，10000g，离心3min将蛋白沉淀；⑤除去ep管内的液体，敞开ep管口，置于室温中干燥蛋白沉淀；⑥加入适量的3％的sds蛋白溶解液混匀，将蛋白沉淀置于95℃热水中加热5～10min至完全溶解，室温静置20～30min。不溶物离心去除，-20℃冰箱备用。

2.sds-page电泳：①清洗冲洗干净玻璃板，自然晾干；②制胶：组装制胶装置，根据目的蛋白的分子量大小，制备10％的分离胶(5ml)。缓慢灌胶避免产生气泡，至梳子下缘1cm左右处，1ml的无水乙醇封闭，放置室温30min左右待分离胶凝固后，去除无水乙醇且用滤纸吸干，5％浓缩胶灌注于分离胶上，轻轻将梳子插入且排除气泡，置于室温30min左右，等凝固4℃备用(制胶配方如下)：

③将装载备用胶的玻璃板装备电泳槽中，加入现配的1×tris-甘氨酸电泳缓冲液没过玻璃板，随后拔出梳子并清洗加样孔；④加样：1:4的比例5×蛋白上样缓冲液制备上样蛋白，各样本总蛋白最终含量一致。充分混匀，5-10min沸水浴后，4℃，12000rpm，离心2min除去不溶物，上样。同时上样蛋白预染mark5μl；⑤电泳：80v恒压电压约30min左右电泳，待蛋白从浓缩胶进入分离胶后，再调整电压120v恒压约2h左右电泳，关闭电源在溴酚蓝电泳至分离胶下缘时，停止电泳。将胶剥离放入缓冲液中，缓慢摇匀平衡20min左右。⑥转膜：首先甲醇浸泡pvdf膜1min，随后在1×转膜缓冲液中进行平衡20min左右；其次据蛋白分子量确定位置进行切胶，在转膜夹自下到上叠放顺序为：海绵垫、三层滤纸、胶、pvdf膜、三层滤纸和海绵垫(注意各层之间无气泡)；固定转膜夹置入电泳槽中，加入1×转膜缓冲液，恒流260ma，转膜90min(可根据蛋白质大小进行调整)。电泳槽置于冰水混合液体降低转膜环境温度。

3.免疫反应：①封闭：转膜后，含有蛋白的转膜面朝上，右上角剪角做标记浸泡于封闭液中，室温缓摇1h左右(水平摇床上)；②洗膜：用1×tbst缓冲液清洗封闭好的pvdf膜三遍，室温置水平摇床，每次5min；③孵育一抗：一抗体用一抗稀释液进行稀释后将pvdf膜完全浸泡孵育，放置4℃冰箱过夜，稀释比：tubulin(1:1000,ac015)，hnrnpa1(1:500,11176-1-ap)。

④洗膜：次日，用1×tbst缓冲液漂洗pvdf膜三次，置摇床上室温，每次10min；⑤孵育二抗：用封闭液稀释后的二抗完全浸泡pvdf膜，室温缓摇2h(摇床)；⑥洗膜：取膜后用1×tbst缓冲液漂洗三次，室温放置摇床上，每次10min。

4.曝光：①等体积混合摇匀ecl化学发光液a液和b液，发光液充分地接触覆盖于pvdf膜上(反复吹打3～5min左右)，然后将其放置凝胶呈相仪(上海，勤翔)中拍照存图。实验重复三次。

六、hnrnpa1扩增产物测序与蛋白印迹结果对比分析。

1.分组设计

慢粒急变组(15例)、慢粒慢性期组(16例)与正常对照组(10例)；为减少试验误差，每例样本进行3次重复试验。

2.主要仪器与试验耗材

3.实验结果

(1)分析hnrnpa1可变剪接高通量测序结果

分析前期研究中我们对慢粒急变期(5例)、慢性期(5例)和正常人(5例)外周血单个核细胞总mrna高通量测序结果，根据hnrnpa1可变剪接模式图(图2.a)在8号外显子出现外显子跳跃剪接模式，导致hnrnpa1中8号外显子跳跃和保留两种剪接亚型。通过剪接结合点的分析，在慢粒急变期患者标本中hnrnpa1-a/b亚型之比在明显要低于慢粒慢性期和正常人标本(图2.b)，提示hnrnpa1-a亚型可能成为慢粒急变特异性表达。

(2)qpcr结果分析

通过qpcr分析慢粒急变期(15例)、慢粒慢性期(16例)和正常人(10例)外周血单个核细胞中hnrnpa1-a和hnrnpa1-b两种剪接亚型的表达情况，结果显示在慢粒急变组中hnrnpa1-a亚型呈低表达(图3.a)，而在慢粒慢性期和正常人中hnrnpa1-a亚型呈高表达(图3.b)，hnrnpa1-a/b亚型之比与高通量测序结果一致(图3.c)，进一步确认hnrnpa1可变剪接可用于慢粒急变预警。

(3)免疫印迹(westernblot)结果分析

通过免疫印迹对慢粒急变期(8例)、慢粒慢性期(9例)和正常人(8例)外周血单个核细胞中hnrnpa1蛋白表达情况，结果发现在慢粒急变组中高表达hnrnpa1-b亚型，而正常人中都高表达hnrnpa1-a亚型(图4)。在蛋白水平上证实hnrnpa1可变剪接可应用慢粒急变。蛋白印迹结果显示两个剪接亚型分别在小于35kd和大于35kd位置处，与已报道的hnrnpa1-a和hnrnpa1-b分别为34kd和38kd结果一致。

(4)qpcr扩增产物和hnrnpa1蛋白结果分析

为验证hnrnpa1的8号外显子跳跃剪接模式，对qpcr扩增产物进行测序(图5)。结果证实为hnrnpa1的可变剪接模式为8号外显子跳跃。综述所述hnrnpa1可变剪接与慢粒急变密切相关，hnrnpa1-b亚型在慢粒急变组中呈特异性表达，此外，hnrnpa1-a/b亚型之比可提高慢粒急变与慢粒慢性期患者的诊断。

上述步骤为本专利的较佳实施方式，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的技术或研究人员，可在各所处知识领域内，且不脱离本专利宗旨的前提下作出相应的变化。

序列表

<110>南昌大学第二附属医院

<120>基于hnrnpa1剪接变体诊断慢粒急变期的试剂及试剂盒

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

ggtaatgatggaagcaattt20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

cctcccttcatgggtccaaa20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

gaggctatggaagtggtgga20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>4

cctcccttcatgggtccaaa20

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列()

<400>5

tttggaggtggtggaagctacaat24

<210>6

<211>1799

<212>dna

<213>gi∣994318938∣ref∣nm_002136.3∣人hnrnpa1,transcriptvariant1,mrna,cds119..1081()

<400>6

ggcggggtaaaaaagagagggcgaaggtaggctggcagatacgttcgtcagcttgctcct60

ttctgcccgtggacgccgccgaagaagcatcgttaaagtctctcttcaccctgccgtcat120

gtctaagtcagagtctcctaaagagcccgaacagctgaggaagctcttcattggagggtt180

gagctttgaaacaactgatgagagcctgaggagccattttgagcaatggggaacgctcac240

ggactgtgtggtaatgagagatccaaacaccaagcgctccaggggctttgggtttgtcac300

atatgccactgtggaggaggtggatgcagctatgaatgcaaggccacacaaggtggatgg360

aagagttgtggaaccaaagagagctgtctccagagaagattctcaaagaccaggtgccca420

cttaactgtgaaaaagatatttgttggtggcattaaagaagacactgaagaacatcacct480

aagagattattttgaacagtatggaaaaattgaagtgattgaaatcatgactgaccgagg540

cagtggcaagaaaaggggctttgcctttgtaacctttgacgaccatgactccgtggataa600

gattgtcattcagaaataccatactgtgaatggccacaactgtgaagttagaaaagccct660

gtcaaagcaagagatggctagtgcttcatccagccaaagaggtcgaagtggttctggaaa720

ctttggtggtggtcgtggaggtggtttcggtgggaatgacaacttcggtcgtggaggaaa780

cttcagtggtcgtggtggctttggtggcagccgtggtggtggtggatatggtggcagtgg840

ggatggctataatggatttggtaatgatggaagcaattttggaggtggtggaagctacaa900

tgattttgggaattacaacaatcagtcttcaaattttggacccatgaagggaggaaattt960

tggaggcagaagctctggcccctatggcggtggaggccaatactttgcaaaaccacgaaa1020

ccaaggtggctatggcggttccagcagcagcagtagctatggcagtggcagaagatttta1080

attaggaaacaaagcttagcaggagaggagagccagagaagtgacagggaagctacaggt1140

tacaacagatttgtgaactcagccaagcacagtggtggcagggcctagctgctacaaaga1200

agacatgttttagacaaatactcatgtgtatgggcaaaaaactcgaggactgtatttgtg1260

actaattgtataacaggttattttagtttctgttctgtggaaagtgtaaagcattccaac1320

aaagggttttaatgtagatttttttttttgcaccccatgctgttgattgctaaatgtaac1380

agtctgatcgtgacgctgaataaatgtcttttttttaatgtgctgtgtaaagttagtcta1440

ctcttaagccatcttggtaaatttccccaacagtgtgaagttagaattccttcagggtga1500

tgccaggttctatttggaatttatatacaacctgcttgggtggagaagccattgtcttcg1560

gaaaccttggtgtagttgaactgatagttactgttgtgacctgaagttcaccattaaaag1620

ggattacccaagcaaaatcatggaatggttataaaagtgattgttggcacatcctatgca1680

atatatctaaattgaataatggtaccagataaaattatagatgggaatgaagcttgtgta1740

tccattatcatgtgtaatcaataaacgatttaattctcttgaaaaaaaaaaaaaaaaaa1799

<210>7

<211>1955

<212>dna

<213>gi∣994318937∣ref∣nm_031157.3∣人hnrnpa1,transcriptvariant2,mrna,cds119..1237()

<400>7