工程化多肽及其在合成酪氨酸或酪氨酸衍生物中的应用的制作方法

文档序号：22587038发布日期：2020-10-20 17:55阅读：199来源：国知局

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种工程化多肽及其应用。

背景技术：

l-酪氨酸是一种动物体内重要的营养必需氨基酸，可作为营养增补剂以及多肽类激素、抗生素等医药化工产品的制备原料，在食品、饲料、医药和化工等行业具有广泛应用。l-酪氨酸衍生物也具有重要的工业用途，比如左旋多巴(l-3-羟基酪氨酸，又称l-多巴)是一种重要的生物活性物质，能转化为多巴胺治疗帕金森综合症；3-氟-l-酪氨酸被广泛应用于生化研究，可用于制备修饰蛋白，研究酶的底物特异性，以及合成含氟标记物模拟代谢过程；3-甲氧基-l-酪氨酸可用于阿魏酸等物质的合成，是重要的药物中间体；氮杂酪氨酸具有重要的潜在药用价值。

目前，制备l-酪氨酸及l-多巴的方法主要有3种：(1)提取法：利用天然蛋白质资源如干酪素、猪血粉等为原料，经过水解、浓缩、结晶、脱色等步骤，分离提取l-酪氨酸，缺点是分离出高纯度的l-酪氨酸十分困难，且天然蛋白资源中的l-酪氨酸的含量较低，所以提取法的收率较低，不适合大规模生产；从植物如藜豆、猫豆中提取l-多巴的方法受到原料来源的限制，且步骤繁杂、产量低，不能满足市场需求；(2)化学合成法：通过l-苯丙氨酸羟基化或将对羟基苯甲醛与海因通过缩合、碱解、转氨等步骤得到l-酪氨酸，缺点是工艺复杂，反应步骤多，且得到的外消旋体需经光学拆分才能获得有生理活性的l-酪氨酸；传统不对称法合成l-多巴需经8步反应，由于反应条件苛刻、成本高、转化率和立体选择性低，在工业生产上受到限制，且达不到药剂使用要求；(3)酶催化法：主要是利用酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenol-lyase，简称tpl，enzymecommission分类号为ec4.1.99.2)催化丙酮酸、氨和苯酚或邻苯二酚生成l-酪氨酸或l-多巴。该反应为可逆反应，需要磷酸吡哆醛(plp)作为辅酶。

此外，如果以邻氟苯酚,愈创木酚或羟基吡啶替代苯酚，tpl还能分别催化生成3-氟-l-酪氨酸，3-甲氧基-l-酪氨酸和氮杂酪氨酸。酶法转化具有专一性强、反应条件温和、选择性强和环境友好等优点，在工业生产l-酪氨酸及其衍生物上有重要的应用价值和开发前景。但野生型tpl往往存在稳定性不够等问题，特别是较高的底物浓度易使野生型tpl失活，所以在实际应用中只能维持较低的底物浓度，且需要以表达tpl的微生物的全细胞的方式参与反应，这样细胞内的tpl与细胞外的底物有所隔离，避免了快速失活。这种反应工艺有不少弊端(applmicrobiolbiotechnol(2007)77:751–762)，首先是时空产率不高(即单位时间内所能累计的产物浓度偏低，导致生产效率低下且生产成本高企)，全细胞也会将反应原料之一的丙氨酸代谢为其他副产物导致原料的浪费，同时反应结束后产物(产物的形态为固体)与全细胞的分离也增加了额外的成本。因此开发出稳定性更好和/或高活力的工程化tpl多肽以实现不使用全细胞的、高时空产率的、简便的反应工艺，对实现l-酪氨酸及其衍生物的工业化生产有重要意义。

技术实现要素：

1概述

本发明提供了一种对酚类底物稳定性好、催化效能高的工程化多肽，能够用于制备l-酪氨酸及其衍生物，包括左旋多巴。还提供了工程化多肽的基因，含有该基因的重组表达载体，工程菌株及其高效制备方法，以及使用工程化多肽制备l-酪氨酸及其衍生物的反应工艺。使用本发明提供的工程化多肽及其配套的反应工艺，在24小时内所能合成的l-酪氨酸的最终浓度高达200g/l，大大提高了时空产率；且本发明提供的工程化多肽以澄清酶液的形式参与反应，产物以固体的形态很容易被提纯出来，简化了提纯工艺并降低了成本。

本发明的第一方面提供了一种新型的工程化多肽。这种工程化多肽是由一种野生型的酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenollyase，简称为tpl,enzymecommissionnumber：ec4.1.99.2)经过创造性的定向进化过程的改造，发生一定数量的氨基酸残基置换、插入或缺失等突变而来。定向进化技术的介绍可参考“directedevolution:bringingnewchemistrytolife”francesh.arnold,angewandtechemie,november28,2017.由于对酶定向进化技术的开创性贡献，francesh.arnold获得了2018年的诺贝尔化学奖。该野生型的tpl来源于弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)，其氨基酸序列如seqidno2所示。经发明人检测，seqidno2所对应的野生型tpl具有合成l-酪氨酸的活性，可以催化苯酚、丙酮酸与氨合成l-酪氨酸，也可以催化苯酚与丝氨酸(d-丝氨酸或l-丝氨酸)合成l-酪氨酸(图1)。然而，seqidno2所对应的酶的稳定性很差，特别是在苯酚、邻苯二酚等酚类物质存在的溶液环境中容易变性而失活。在分子生物学领域所熟知的是，苯酚是很强的蛋白质变性剂，在核酸提取过程中，苯酚常被用来使蛋白质变性从而实现蛋白质与核酸的分离。

经发明人检测，在图1所示的反应体系中，当苯酚的浓度≥20g/l时，seqidno：2所对应的野生型tpl很快就完全变性而丧失了活性，几乎没有生成产物l-酪氨酸；即使降低苯酚浓度到约3g/l，虽然seqidno：2对应的酶没有立即失活，可以催化图1所示的反应生成l-酪氨酸；但在含3g/l苯酚的溶液中作用≤20h后，seqidno：2对应的酶也会完全变性失活；即使采用经优化后的、分批加苯酚的反应工艺(如实施例8或实施例9所示)，seqidno：2对应的酶仅能将少部分底物转化，导致生成的产物浓度很低，无法用于工业化生产。为了提高酶对苯酚等酚类底物的稳定性，发明人开发了一系列工程化tpl多肽，这些工程化多肽在催化合成l-酪氨酸及其衍生物的反应中，表现出了较seqidno：2更好的稳定性和/或活性，能够更高效地催化苯酚合成生成l-酪氨酸，同时也能更高效地催化邻苯二酚合成生成左旋多巴。在一些实施方案中，本公开内容中的工程化多肽能够以至少等于或大于seqidno：2的稳定性和/或活性催化合成l-酪氨酸及其衍生物。

本发明提供的工程化多肽与seqidno：2对应的野生型tpl相比，具有更好的稳定性和/或活性，能够以非常低成本的、极简单的工艺不对称地制备l-酪氨酸及其衍生物。这些工程化多肽可包括在对应以下的残基位置与seqidno：2序列相比的一个或多个残基差异的氨基酸序列：x3，x10，x17，x27，x29，x33，x39，x41，x43，x59，x66，x72，x75，x78，x118，x128，x132，x136，x137，x140，x146，x174，x179，x186，x206，x212，x233，x253，x255，x276，x280，x284，x288，x327，x343，x354，x379，x384，x390，x391，x396，x414，x418，x429，x445，x446，x448，x449，x454。工程化多肽包括包含以下特征至少之一的氨基酸序列：y3c，y3f，i10t，s17r，s17k，k27a，k27e，k27r，k27n，k27t，k27q，k27h，k27s，q29k，y33w，n39k，n39y，n39r，n39h，k41r，k41s，k41t，k41q，k41n，k41a，k41h，k41d，k41e，i43t，i43c，k59h，m66l，a72c，e75q，e75r，e75k，y78t，a118l，y128l，y128i，y128v，y128w，y128h，y128r，k132r，k132l，k132n，v136t，v136i，v136m，f137a，i140v，i140l，h146l，h146e，n174k，c179s，l186n，l186i，a206k，f212y，e233k，e233h，e233q，m253h，g255p，s276e，e280n，v284a，m288g，m288l，m288a，m288f，m288h，m288s，d327a，d327e，h343a，h343r，e354p，m379g，i384v，n390k，v391k，h396p，y414r，d418n，q429d，q445g，q445t，q445y，l446n，f448h，f448k，f448m，f449m，f449v，f449y，d454e；或同时在这些差异的基础上，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24、25或更多个氨基酸残基的插入或缺失。

更具体的，在一些实施方案中，在seqidno：2基础上开发的工程化多肽包括对应seqidno：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308所示氨基酸序列组成的多肽。

在一些实施方案中，工程化多肽包括与seqidno：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308的参考序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。

两条氨基酸序列或两条核苷酸序列之间的同一性均可通过本领域常用的算法得到，可采用ncbiblastp和blastn软件根据默认参数计算得到，也可采用采用clustalw算法(nucleicacidresearch,22(22):4673-4680,1994)。比如用采用clustalw算法，seqidno：2与seqidno：286的氨基酸序列同一性为96.9％。

在另一方面，本发明提供了编码工程化多肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸可以是具有用于表达工程化多肽的一种或多种控制序列的表达载体的部分。在一些实施方案中，多核苷酸可包括对应seqidno：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307所示序列的多核苷酸序列。

如本领域技术人员所知，由于核苷酸密码子的简并性，编码seqidno：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308的氨基酸序列的多核苷酸序列不仅仅局限于seqidno：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307。本发明的工程化多肽的核酸序列也可以是编码序列表中seqidno：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。

在另一方面，本公开内容提供包含编码工程化多肽的多核苷酸或能够表达工程化多肽的表达载体和宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以是细菌宿主细胞，比如大肠杆菌。宿主细胞可用于表达和分离本文所述的工程化多肽，或可选地直接用于反应将底物转化为产物。

在一些实施方案中，以完整细胞、粗提取物、分离的多肽或纯化的多肽形式的工程化多肽可单独使用，或以固定化形式(比如固定在树脂上)使用。

本公开内容还提供了使用本文公开的工程化多肽催化合成结构式(i)所示的手性氨基酸化合物的方法：

所述结构式(i)的氨基酸产物在标为*的手性中心具有所示的立体化学构型；所示结构式(i)的氨基酸产物与相应的对映异构体相比过量，其中

r¹、r²、r³、r⁴或r⁵是任选地取代的c1-c6烃基、-h、卤素(如-f、-cl、-br和-i)、-oh、烯基、炔基、芳基、杂芳基、-no2、-no、-so2r’或-sor’、-sr’、-nr’r’、-or’、-co2r’或-cor’、-c(o)nr’、-so2nh2或-sonh2、-cn、-cf3；其中每个r’独立地选自-h、(c1-c4)烃基、卤素、c1-c8烃基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、环烃基、芳基或杂环基。

所述方法包括在合适的反应条件下，在丙酮酸和氨同时存在的情况下或者在丝氨酸存在的情况下(如下面反应式1或反应式2所示)，将结构式(ii)的底物

和本文所述的工程化多肽接触。

在一些实施方案中，所述工程化多肽与seqidno:2-308的偶数序列标识符的参考序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并能够以与seqidno：2相比更优的性能(包括更好的稳定性，更高的活性，或耐受更高的底物浓度)来催化合成结构式(i)的产物。

在一些实施方案中，结构式(i)的产物以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的对映体过量产生。

在该方法的一些实施方案中，结构式(i)的产物是：

其中r¹如上定义，且结构式(ii)的底物是：

在一些实施方案中，r¹在苯基环的对位。在一些实施方案中，r¹在苯基环的间位。在一些实施方案中，r¹在苯基环的邻位。在一些实施方案中，r¹同时在苯基环的对位和间位。在一些实施方案中，r¹同时在苯基环的对位和邻位。在一些实施方案中，r¹同时在苯基环的间位和邻位。

在一些实施方案中，本文公开的工程化多肽可以用在制备l-酪氨酸的方法中：

在这些实施方案中，所述方法包括在合适的反应条件下，在丙酮酸和氨同时存在的情况下或者在丝氨酸存在的情况下，将结构式a1所示化合物苯酚：

与本文公开的工程化多肽接触的步骤。

在一些实施方案中，本文公开的工程化多肽可以用在制备左旋多巴的方法中：

在这些实施方案中，所述方法包括在合适的反应条件下，在丙酮酸和氨同时存在的情况下或者在丝氨酸存在的情况下，将结构式a2所示化合物邻苯二酚：

与本文公开的工程化多肽接触的步骤。

在以上方法的一些实施方案中，式(i)化合物、l-酪氨酸或左旋多巴以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的对映体过量产生。

如本文公开的使用工程化多肽用于制备式(i)化合物、l-酪氨酸或左旋多巴的方法中的任一种可在一系列合适的反应条件下被执行，所述一系列合适的反应条件包括但不限于ph、温度、缓冲液、溶剂系统、底物载量、多肽载量、辅因子载量、压力和反应时间的范围。例如，在一些实施方案中，制备式(i)化合物、l-酪氨酸或左旋多巴可被执行，其中合适的反应条件包括：(a)约1g/l至500g/l化合物(ii)、苯酚或邻苯二酚的载量；(b)约0.1g/l至50g/l工程化多肽的载量；(c)约0.01g/l至1.0g/l的辅因子浓度；(d)约0％(v/v)至约99％(v/v)的有机溶剂，这里所述的有机溶剂包括但不限于4-羟基-2-丁酮、异丙醇、二甲基亚砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)、甲基叔丁基醚(mtbe)、乙酸异丙酯、甲醇、乙醇或丙醇；(e)约4.0至约11.0的ph；和(f)约10℃至60℃的温度。

2详述

2.1定义

关于本公开内容，除非另外明确定义，否则本文说明书中使用的技术术语和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用，表示由酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，而不论长度或翻译后修饰(如，糖基化、磷酸化、脂质化、豆蔻酰化、泛素化等等)。该定义包括d-氨基酸和l-氨基酸、以及d-氨基酸和l-氨基酸的混合物。

“工程化酪氨酸酚裂解酶”、“工程化酪氨酸酚裂解酶多肽”、“工程化tpl多肽”、“改进的酪氨酸酚裂解酶”和“工程化多肽”在本文可互换使用。

“菌体”或“湿菌体”指表达了多肽或工程化多肽的宿主细胞，包括实施例3和实施例7所示的制备过程所得到的湿菌体。

“多核苷酸”和“核酸”在本文可互换使用。

如本文使用的“辅因子”指在催化反应中与酶联合起作用的非蛋白化合物。如本文使用的，“辅因子”意图包括维生素b6家族化合物pyridoxal-5'-phosphate(plp),pyridoxine(pyridoxol,orpn),pyridoxal(pl),pyridoxamine(pm),pyridoxinephosphate(pnp)和pyridoxaminephosphate(pmp)，其有时也被称作辅酶。

“plp”、“磷酸吡哆醛”、“吡哆醛5’-磷酸”、“pyp”和“p5p”在本文可互换地使用，来指在酶催化反应中用作辅因子的化合物。

“编码序列”指编码蛋白的氨基酸序列的核酸部分(例如，基因)。

“天然存在的”或“野生型”是指在自然界发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中、可分离自自然界中的来源且未通过人工操作有意地修饰的序列。

“重组”的或“工程化”的或“非天然存在”的当用于指例如细胞、核酸或多肽时，是指如下材料或与该材料的天然形式或固有形式相对应的材料：所述材料以自然界中不会存在的方式被改变，或与其相同但是从合成材料和/或通过使用重组技术操作而产生或获取。

“序列同一性”和“同源性”在本文可互换地用于指多核苷酸之间或多肽之间的对比(“序列同一性”和“同源性”通常以百分比的形式来表示)，且通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列来确定，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分与参照序列相比可包括添加或缺失(即，空位)，用于两个序列的最佳对齐。百分比可以通过如下计算：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置总数并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。可选地，该百分比可通过以下计算：确定相同核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中都存在的位置数或核酸碱基或氨基酸残基与空位对齐的位置数以得到匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。本领域技术人员将认识到，存在许多可用于比对两个序列的建立的算法。用于比较的序列最佳比对可例如通过smith和waterman，1981，adv.appl.math.2:482的局部同源性算法、通过needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.48:443的同源性比对算法，通过pearson和lipman,1988,proc.natl.acad.sci.usa85:2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机实现(gcgwisconsin软件包中的gap、bestfit、fasta或tfasta)或通过直观检查(一般参见，currentprotocolsinmolecularbiology,f.m.ausubel等编著，currentprotocols,greenepublishingassociatesinc.和johnwiley&sons,inc.之间的合资企业,(1995年增刊)(ausubel))。适宜于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是blast和blast2.0算法，它们分别描述于altschul等人，1990，j.mol.biol.215:403-410和altschul等,1977,nucleicacidsres.3389-3402中。用于执行blast分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)网站公开可用的。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度w的短字来鉴定高评分序列对(hsp)，所述短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值的阀值得分t。t被称作邻近字评分阈值(altschul等，如上述)。这些初始相邻字匹配(wordhit)充当用于启始搜索的种子来寻找包含它们的更长的hsp。然后字匹配沿着每个序列在两个方向延伸到累积比对得分不能够增加的程度。对于核苷酸序列，累积得分使用参数m(对于匹配残基对的奖励得分；永远＞0)和n(对于错配残基的惩罚得分；永远＜0)计算。对于氨基酸序列，得分矩阵被用于计算累计得分。当以下情况时，每个方向中的字匹配字串的延伸被终止：累积比对得分从其最大达到值下降了量x；由于累积一个或多个负得分残基比对，累积得分达到0或以下；或到达任一序列末端。blast算法参数w、t和x决定比对的灵敏度和速度。blastn程序(用于核苷酸序列)使用字长(w)11、期望值(e)10、m＝5、n＝-4以及两链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，blastp程序使用以下作为缺省值：字长(w)为3，期望值(e)为10和blosum62得分矩阵(见henikoff和henikoff,1989,procnatlacadsciusa89：10915)。序列比对和序列同一性％的示例性确定可使用gcgwisconsin软件包(accelrys,madisonwi)中的bestfit或gap程序，使用所提供的缺省参数。

“参考序列”是指用作序列比较的基础的限定序列。参考序列可以是较大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的片段。一般而言，参考序列为至少20个核苷酸或氨基酸残基长，至少25个残基长，至少50个残基长，或者核酸或多肽的全长。因为两种多核苷酸或多肽可以各自(1)包括在两种序列之间相似的序列(即，完整序列的一部分)，且(2)可以进一步包括在两种序列之间不同的序列，两种(或更多)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过在“比较窗口”内比较两种多核苷酸或多肽的序列来进行以鉴定和比较序列相似性的局部区域。在一些实施方案中，“参照序列”不意为限于野生型序列，且可包括工程化或改变的序列。例如，“在对应于x27的残基处具有丙氨酸的基于seqidno:2的参考序列”指其中在seqidno:2中的x27处相应的残基(是赖氨酸)已经改变成丙氨酸的参考序列。

“比较窗口”指至少约20个相邻核苷酸位置或者氨基酸残基的概念性片段，其中序列可以与至少20个相邻核苷酸或氨基酸的参考序列相比较，并且其中比较窗口中的序列的部分可以包括与参考序列(其不包括添加或缺失)相比20％或更少的添加或缺失(即，空位)，用于两序列的最佳比对。比较窗口可以长于20个相邻残基，并且包括任选地30、40、50、100或更长的窗口。

在用于指定的氨基酸或多核苷酸序列的编号的情况下，"相应于"、"参考于"或"相对于"指当指定的氨基酸或多核苷酸序列与参考序列相比较时指定的参考序列残基的编号。换言之，给定序列的残基编号或残基位置是根据参考序列指定的，而不是给定氨基酸或多核苷酸序列内的残基的实际数字位置指定的。例如，可以将给定的氨基酸序列诸如工程化多肽的氨基酸序列与参考序列进行比对，这是通过引入空位以优化这两条序列之间的残基匹配而实现的。在这些情况下，虽然存在空位，但是给定氨基酸或多核苷酸序列中的残基编号相对于已与其比对的参考序列制定。

“氨基酸差异”或“残基差异”指在多肽序列的一个位置处氨基酸残基相对于参考序列中相应位置处的氨基酸残基的差异。本文中氨基酸差异的位置一般被称为“xn”，其中n指残基差异基于其的参考序列中的相应位置。例如，“与seqidno:2相比在位置x27处的残基差异”指在相应于seqidno:2的位置27的多肽位置处的氨基酸残基的差异。因此，如果seqidno:2的参考多肽在位置27处具有赖氨酸，那么“与seqidno:2相比在位置x27处的残基差异”是指在相应于seqidno:2的位置27的多肽位置处除了赖氨酸之外的任何残基的氨基酸取代。在本文的大多数实例中，在一个位置处的特定氨基酸残基差异表示为“xny”，其中“xn”指如以上描述的对应位置，并且“y”为在工程化多肽中发现的氨基酸的一字母标识符(即，与参考多肽中的不同的残基)。在一些实例中(例如，在表1中)，本公开内容还提供由常规符号“anb”表示的特定氨基酸差异，其中a为参考序列中的残基的一字母标识符，“n”为在参考序列中的残基位置的编号，并且b为工程化多肽的序列中残基取代的单字母标识符。在一些实例中，本公开内容的多肽可包含相对于参考序列的一个或更多个氨基酸残基差异，其通过相对于参考序列存在残基差异处的特定位置的列表表示。

“缺失”指通过从参考多肽去除一个或更多个氨基酸而对多肽的修饰。缺失可以包括除去1个或多个、2个或多个氨基酸，5个或多个氨基酸，10个或多个氨基酸，15个或多个氨基酸，或20个或多个氨基酸，多达组成参照酶的氨基酸总数的10％，或多达组成参照酶的氨基酸总数的20％，同时保留工程化多肽的tpl酶活性和/或保留工程化多肽的改进的性质。缺失可以涉及多肽的内部部分和/或末端部分。在各种实施方案中，缺失可以包括连续的区段或者可以是不连续的。

"插入"指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸的多肽的修饰。在一些实施方案中，本文公开的工程化多肽包括一个或更多个氨基酸插入天然存在的tpl多肽，以及一个或更多个氨基酸插入其他工程化多肽。可在多肽的内部部分插入，或插入到羧基或氨基末端。如本文所用的，插入包括本领域中已知的融合蛋白。插入可以是氨基酸的连续区段，或者被在天然存在的多肽中一个或更多个氨基酸分隔。

如本文所用的"片段"指具有氨基末端和/或羧基末端缺失、但是其中保留的氨基酸序列与序列中相应的位置相同的多肽。片段可以为至少10个氨基酸长、至少20个氨基酸长，至少50个氨基酸长或更长，以及高达全长工程化多肽的70％、80％、90％、95％、98％和99％。

“分离的多肽”是指如下多肽：所述多肽基本上与其天然伴随的其他物质例如蛋白、脂质和多核苷酸分离。该术语包括已从其天然存在的环境或表达系统(例如，宿主细胞或体外合成中)移去或纯化的多肽。工程化多肽可以存在于细胞内、存在于细胞培养基中或者以各种形式制备，诸如裂解物或分离的制备物。像这样，在一些实施方案中，工程化多肽可以是分离的多肽。

“手性中心”是指连接四个不同基团的碳原子。

“立体选择性”(stereoselectivity)指在化学或酶促反应中一种立体异构体相对于另一种或多种异构体的优先形成。立体选择性可以是部分的，其中一种立体异构体的形成优于另一种异构体；或可以是完全的，其中仅形成一种立体异构体。当立体异构体是对映异构体时(enantiomers)，立体选择性被称为对映异构体选择性(enantioselectivity)，一种对映异构体在两种对映异构体的混合物之中的过量分数(通常被报告为百分比)通常被可选地报告为“对映异构体过量”(enantiomericexcess，简称为ee)。在本领域内该分数(典型地为百分比)通常可选择地报道为根据下式从中计算的对映异构体过量(enantiomericexcess，即ee)：{主要对映异构体浓度–次要对映异构体浓度}/{主要对映异构体浓度+次要对映异构体浓度}。

“立体异构体”、“立体异构形式”和类似表述在本文可互换使用，是指分子差异仅在其原子在空间中的方位不同所造成的所有异构体。其包括对映异构体和具有多于一个手性中心、且彼此不是镜像的化合物的异构体(即“非对映异构体”)。

“改进的酶性质”指与参考序列相比，工程化多肽显示的任何酶性质的改进，所述参考序列诸如野生型酪氨酸酚裂解酶seqidno：2。期望改进的酶性质包括，但不限于，酶活性(其可以底物的转化百分比的方式被表示)、热稳定性、溶剂稳定性(例如，针对酚类化合物的稳定性)、ph活性特征、辅因子需求、对抑制物的耐受性(例如，底物或产物抑制)、立体特异性和立体选择性。

“转化”指底物向相应的产物的酶促转化。“转化百分比”或“转化率”是指在指定反应条件下在指定的反应时间内，反应体系中被转化为产物的底物的百分比。因此，酪氨酸酚裂解酶或工程化多肽的“酶活性”或“活性”可以被表示为底物向产物的“转化百分比”。转化率一般通过取样来测定反应体系中的产物浓度和主要底物浓度来计算：{产物摩尔浓度}/{主要底物摩尔浓度+产物摩尔浓度}。这里主要底物是指式化合物(ii)、苯酚或邻苯二酚。

“热稳定的”指与野生型酶相比，工程化多肽在暴露于升高的温度(例如72℃或更高温度)持续一段时间(例如2.5小时或更长时间)之后维持相似活性。

“溶剂稳定的”或“溶剂耐受的”指与野生型酶相比，工程化多肽在暴露于不同浓度(例如5-99％)的溶剂(苯酚、邻苯二酚、甲醇、乙醇、异丙醇、二甲基亚砜(dmso)、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、甲苯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚等)持续一段时间(例如0.5-24小时)之后维持相似的活性。

“合适的反应条件”指生物催化反应溶液中的那些条件(例如，酶载量、底物载量、辅因子载量、温度、ph、缓冲液、共溶剂等的范围)，在该条件下本公开内容的工程化多肽能将底物转化成期望的产物化合物。示例性“合适的反应条件”被提供于本公开内容并通过实施例例证。

“烃基”是指直链或支链的烃基团。符号“c”后出现下标的数字规定了特定基团可包含的碳原子数。例如，“c1-c8”是指具有1至8个碳原子的直链或支链烃基基团。烃基基团可任选第被一个或多个取代基基团取代。“芳基”是指6至约20个碳原子的单价芳香族烃基。“杂芳基”和“杂芳族”是指其中母体芳环系统的一个或多个碳原子被杂原子(o，n或s)代替的芳基基团。“取代的”当用于修饰指定基团或自由基时，是指指定基团或自由基的一个或多个氢原子各自彼此独立地本文所用的“化合物”是指伴随本文公开的化合物标明的结构式和/或化学名涵盖的任何化合物。化合物可以其化学结构和/或化学名标明。当化学结构与化学名冲突时，化学结构决定化合物的身份。除非另外具体地描述或指出，否则本文描述的化学结构涵盖所描述化合物的所有可能异构体形式。

被相同或不同的取代基代替。“取代的烃基、芳基或杂芳基”指其中一个或多个氢原子用另一取代基代替的烃基、芳基或杂芳基基团。“任选”或“任选地”是指所描述的事件或情况可能发生或不发生；例如“任选地取代的芳基”是指可能被取代或可能未被取代的芳基基团，这一描述包括取代的芳基基团和未取代的芳基基团二者。

2.2工程化多肽

以下表1举例说明本发明所开发的工程化tpl多肽。每一行给出一个具体的工程化多肽的核苷酸序列编号和氨基酸序列编号，以及与seqidno:2相比较的残基差异。每个举例的工程化多肽的催化性能(综合了酶在反应中的整体表现，包括但不限于在反应体系中的稳定性、活性、对产物的立体选择性等等)以“+”表示，具体的含义见表2或表3。

表1

表2

表2所述的反应条件中的酶液，其制备过程参考实施例3，酶液没有经过任何预处理，且含有等量的表1中氨基酸序列对应的多肽。表2中的筛选反应的操作过程可参考实施例4，这里的转化率是以苯酚转化为l-酪氨酸的摩尔比例来计算的。

表3

表3反应条件中所述的预处理后的酶液，是将酶液与不同浓度的苯酚混合处理后得到的酶液；酶液的预处理和和反应的操作过程可参考实施例5。这里的转化率是以苯酚转化为l-酪氨酸的摩尔比例来计算的。

2.3可用于制备工程化多肽的多核苷酸、控制序列、表达载体和宿主细胞

在另一方面，本公开内容提供了编码本文描述的具有tpl活性(或ec4.1.99.2一类酶活性)的工程化多肽的多核苷酸。多核苷酸可与控制基因表达的一种或多种异源调控序列可操作地连接以产生能够表达多肽的重组多核苷酸。包含编码工程化多肽的异源多核苷酸的表达构建体可被引入合适的宿主细胞以表达相应的工程化多肽。

如对本领域技术人员明显的是，蛋白序列的可得性和相应于多种氨基酸的密码子的知识提供能够编码目标蛋白序列的所有多核苷酸的说明。其中相同氨基酸由可选择的或同义密码子编码的遗传密码的简并性允许产生极大数目的核酸，所有这些核酸编码本文公开的工程化多肽。因此，确定特定的氨基酸序列后，本领域的技术人员可以以不改变蛋白质的氨基酸序列的方式通过仅仅修饰一个或多个密码子的序列来产生任何数目的不同的核酸。在这点上，本公开内容特别地构思了可通过基于可能的密码子选取而选择组合来制备的多核苷酸的各个和每个可能的改变，并且对于本文公开的任何多肽，包括在表1中提供的示例性工程化多肽的氨基酸序列，以及在通过引用并入本文的序列表中作为seqidno:4-308的偶数序列标识符的序列公开的任何多肽，所有这些改变被认为特别地公开。

在多种实施方案中，密码子被优选地选择以适应在其中产生蛋白的宿主细胞。例如，用于细菌的优选密码子用于表达细菌中的基因；用于酵母中的优选密码子用于在酵母中表达；且用于哺乳动物的优选密码子用于在哺乳动物细胞中表达。

在一些实施方案中，所述多核苷酸编码包含与选自seqidno:4-308的偶数序列标识符的参考序列至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列的工程化多肽，其中所述多肽具有tpl活性以及本文描述的改进的特性中的一种或更多种，例如以与seqidno:2的多肽相比增加的稳定性和/或活性催化合成l-酪氨酸或左旋多巴的能力。

在一些实施方案中，所述多核苷酸编码工程化多肽，所述工程化多肽包含与seqidno:2相比具有以上描述的同一性百分比并且具有选自的一个或更多个氨基酸残基差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容提供了具有tpl活性的工程化多肽，所述工程化多肽包含与seqidno:2的参考序列具有至少80％的序列同一性以及具有选自以下位置的残基差异的组合：x3，x10，x17，x27，x29，x33，x39，x41，x43，x59，x66，x72，x75，x78，x118，x128，x132，x136，x137，x140，x146，x174，x179，x186，x206，x212，x233，x253，x255，x276，x280，x284，x288，x327，x343，x354，x379，x384，x390，x391，x396，x414，x418，x429，x445，x446，x448，x449，x454。

在一些实施方案中，编码工程化多肽的多核苷酸包含选自seqidno:3-307的奇数序列标识符的序列。

在一些实施方案中，所述多核苷酸编码本文所述的多肽，但是在核苷酸水平上与编码工程化多肽的参考多核苷酸具有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，参考多核苷酸序列选自具有seqidno:3-307的奇数序列标识符的序列。

编码工程化多肽的分离的多核苷酸可以多种方法被操作以提供多肽的表达，所述方法包括通过密码子优化来进一步改变序列以改进表达、在合适的有或无另外的控制序列的表达元件中插入、和转化入适于表达并产生多肽的宿主细胞。

取决于表达载体，在分离的多核苷酸插入载体之前对分离的多核苷酸的操作可以是期望的或必需的。利用重组dna方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术在本领域中是公知的。在以下中提供了指导：sambrook等人,2001,molecularcloning:alaboratorymanual,第三版,coldspringharborlaboratorypress；和currentprotocolsinmolecularbiology,ausubel.f.编著,greenepub.associates,1998,2010年更新。

在另一个方面，本公开还涉及重组表达载体，根据它们将被导入的宿主的类型，其包括编码工程化多肽或其变体的多核苷酸，和一个或多个表达调节区，诸如启动子和终止子、复制起点等等。可选地，本公开内容的核酸序列可以通过使核酸序列或包括该序列的核酸构建体插入到适当的表达载体中来表达。在产生表达载体时，编码序列位于载体中以使编码序列被可操作地连接于用于表达的合适的控制序列上。

重组表达载体可为任何载体(例如，质粒或病毒)，其可方便地应用于重组dna步骤中并且可带来多核苷酸序列的表达。载体的选择通常将取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状的质粒。表达载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外的实体而存在的载体，它的复制独立于染色体的复制，如质粒、染色体外的元件、微小染色体、或人工染色体。载体可以包含用于保证自我复制的任何工具。可选地，载体可以是在被引入到宿主细胞中时整合到基因组中并且与其所整合到的染色体一起复制的载体。而且，可以使用单一载体或质粒或者一起包含待引入到宿主细胞基因组中的总dna的两种或多种载体或质粒。

对本公开内容的实施方案有用的很多表达载体是商业上可得的。示例性表达载体可通过将编码工程化多肽的多核苷酸可操作地连接到质粒pacyc-duet-1(novagen)中来制备。

在另一方面，本公开内容提供包含编码本公开内容的工程化多肽的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸被可操作地连接至在宿主细胞中用于工程化多肽的表达的一个或更多个控制序列。用于表达由本公开内容的表达载体编码的多肽的宿主细胞在本领域是公知的，并且包括但不局限于诸如大肠杆菌、节杆菌属种knk168、链霉菌属和鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)细胞的细菌细胞；诸如酵母细胞(例如，酿酒酵母或巴斯德毕赤氏酵母(pichiapastoris))的真菌细胞；诸如果蝇s2以及灰翅夜蛾(spodoptera)sf9细胞的昆虫细胞；诸如cho、cos、bhk、293和bowes黑色素瘤细胞的动物细胞；以及植物细胞。示例性的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。上述宿主细胞可以是野生型的，也可以是经过基因组编辑的工程细胞，比如把宿主细胞基因组中所携带的野生型的tpl基因敲除。上述宿主细胞的合适的培养基以及生长条件在本领域内是公知的。

用于表达工程化多肽的多核苷酸可通过本领域已知的多种方法被引入至细胞。技术包括，除了其他以外，电穿孔、生物颗粒轰击法、脂质体介导的转染、氯化钙转染和原生质体融合。将多核苷酸引入细胞的不同方法对于本领域技术人员是明显的。

2.4产生工程化多肽的方法

通过将编码tpl的多核苷酸经历诱变和/或定向进化方法，可以获得工程化多肽。示例性的定向进化技术可见《biocatalysisforthepharmaceuticalindustry:discovery,development,andmanufacturing》(2009johnwiley&sonsasia(pte)ltd.isbn:978-0-470-82314-9)。

当工程化多肽的序列为已知时，编码多肽的多核苷酸可根据已知的合成方法通过标准的固相方法制备。在一些实施方案中，多达约100个碱基的片段可单独地合成，然后连接(例如，通过酶促或化学的连接方法或聚合酶介导的方法)以形成任何需要的连续序列。例如，本公开内容的多核苷酸和寡核苷酸可通过化学合成制备，使用，例如，描述于beaucage等人,1981,tetlett22：1859-69的经典的亚磷酰胺方法，或描述于matthes等人,1984,emboj.3:801-05的方法，例如，如在自动化合成方法中典型地实践的。根据亚磷酰胺方法，寡核苷酸在例如，在自动化dna合成仪中合成、纯化、退火、连接以及克隆至合适的载体中。另外，基本上任何核酸可从多种商业来源的任一个获得。

在一些实施方案中，本公开内容还提供了用于制备或制作工程化多肽的方法，其中该方法包括在适于表达多肽的培养条件下培养能够表达编码工程化多肽的多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，制备多肽的方法还包括分离多肽。工程化多肽可在合适的细胞中表达，并利用所熟知的用于蛋白纯化的技术中的任何一种或更多种从宿主细胞和/或培养基分离(或回收)，所述用于蛋白纯化的技术包括，除了其他以外，溶菌酶处理、超声、过滤、盐析、超速离心和色谱。

2.5利用工程化多肽的方法以及用其制备的化合物

在另一方面，本文所述的工程化多肽，可催化合成手性氨基酸化合物。本公开内容还提供了使用本文公开的工程化多肽制备广泛范围的化合物(i)或其结构类似物的方法。在一些实施方案中，工程化多肽可用在制备结构式(i)的化合物的方法中

所述结构式(i)的氨基酸产物在标为*的手性中心具有所示的立体化学构型；所示结构式(i)的氨基酸产物与相应的对映异构体相比过量，其中

所述方法包括在合适的反应条件下，在丙酮酸和氨同时存在的情况下或者在丝氨酸存在的情况下，将结构式(ii)的底物

和本文所述的工程化多肽接触。

在一些实施方案中，所述工程化多肽与seqidno:2-308的偶数序列标识符的参考序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并能够以与seqidno：2相比更优的性能(包括更好的稳定性，更高的活性，或耐受更高的底物浓度)来催化合成结构式(i)的产物。

在一些实施方案中，结构式(i)的产物以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的对映体过量产生。

如上所述，可用于本公开内容的方法中的工程化多肽可按照其催化合成l-酪氨酸的能力来表征。因此，在本文公开的方法的任何实施方案中，可进行该方法，其中工程化多肽能够以与seqidno：2相比更优的性能来催化合成l-酪氨酸，并与seqidno:2-308的偶数序列标识符的参考序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的氨基酸序列同一性。

在该方法的一些实施方案中，结构式(i)的产物是：

其中r¹如上定义，且结构式(ii)的底物是：

用于以上方法的工程化多肽的具体实施方案在详述中进一步提供。可用在以上方法中的工程化多肽可包括选自对应seqidno：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文公开的工程化多肽可以用在制备l-酪氨酸的方法中：

在这些实施方案中，所述方法包括在合适的反应条件下，在丙酮酸和氨同时存在的情况下或者在丝氨酸存在的情况下，将结构式a1所示化合物苯酚：

与本文公开的工程化多肽接触的步骤。

在一些实施方案中，本文公开的工程化多肽可以用在制备左旋多巴的方法中：

与本文公开的工程化多肽接触的步骤。

在以上方法的一些实施方案中，l-酪氨酸或左旋多巴以至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的对映体过量产生。

用于该方法的工程化多肽的具体实施方案在详述中进一步提供。可用在以上方法中的工程化多肽可包括选自对应seqidno：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述工程化多肽与seqidno:2-308的偶数序列标识符的参考序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并能够以与seqidno：2相比更优的性能(包括更好的稳定性，更高的活性，或耐受更高的底物浓度)来催化合成l-酪氨酸或左旋多巴。

如本文描述并在实施例中例证的，本公开内容构思了可在本文的方法中使用的合适的反应条件的范围，包括但不限于辅因子的浓度、温度、溶剂系统、各个反应成分的载量、多肽载量、缓冲液、ph、和反应时间的范围。用于执行使用本文描述的工程化多肽催化底物化合物转化成产物化合物的方法的另外的合适的反应条件可容易地通过常规实验优化，所述常规实验包括但不限于在各个反应成分的载量、ph、温度、溶剂条件、辅因子浓度的实验反应条件下使工程化多肽与底物化合物接触，并检测产物化合物，例如，利用在本文提供的实施例中描述的方法。

如以上描述的，用于本公开内容的方法的具有tpl活性的工程化多肽通常包含与选自seqidno:2-308的偶数序列的任一个的参考氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

考虑到例如期望的产物化合物的量、底物浓度对酶活性的影响、反应条件下酶的稳定性、和底物到产物的转化百分比等因素，反应混合物中的各个底物化合物的载量可以变化，这种变化可以是等比例的，也可以是不等比例的。为了尽可能彻底地转化结构式(ii)、a1或a2所示的底物，丙酮酸、氨或丝氨酸在反应混合物中的载量相对于结构式(ii)、a1或a2所示的底物的载量可以是过量的。虽然本文提供的底物载量的值是基于化合物(ii)、a1、a2、丙酮酸、氨或丝氨酸的分子量，但是也预期，在方法中可以使用相等摩尔量的化合物(ii)、a1、a2、丙酮酸、氨或丝氨酸的多种水合物或盐。这里丝氨酸可以使d-丝氨酸，也可以是l-丝氨酸。

在反应的实施方案中，反应条件可包括合适的ph。如以上所述，期望的ph或期望的ph范围可通过使用酸或碱、合适的缓冲剂、或缓冲剂和添加酸或碱的组合来保持。反应混合物的ph可在反应过程之前和/或期间控制。在一些实施方案中，合适的反应条件包括约4至约11的溶液ph。在一些实施方案中，反应条件包括约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11.0的溶液ph。

在本文的方法的实施方案中，例如考虑到在较高的温度下在反应速率上的增加、对于足够久的反应持续时间的酶的活性，合适的温度可被用于反应条件。相应地，在一些实施方案中，合适的反应条件包括约10℃至约60℃、约25℃至约50℃、约25℃至约40℃、或约25℃至约30℃的温度。在一些实施方案中，合适的反应温度包括约10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃的温度。在一些实施方案中，酶促反应期间的温度可以贯穿反应过程保持在一定温度。在一些实施方案中，酶促反应期间的温度可以在反应过程期间调整为温度曲线。

使用工程化多肽的方法通常在水或溶剂中进行。合适的溶剂包括水性缓冲溶液、有机溶剂和/或共溶剂系统，共溶剂系统通常包括水性溶剂和有机溶剂。水性溶液(水或水性共溶剂系统)可为ph-缓冲的或非缓冲的。在一些实施方案中，使用工程化多肽的方法通常地于包含以下的水性共溶剂系统中进行：有机溶剂(例如，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇(ipa)、丙酮)、二甲基亚砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)、乙酸异丙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、1-辛醇、庚烷、辛烷、甲基叔-丁基醚(mtbe)、甲苯等)、离子液体(例如，四氟硼酸1-乙基4-甲基咪唑、四氟硼酸1-丁基-3-甲基咪唑、六氟磷酸1-丁基-3-甲基咪唑等)。水性共溶剂系统中的有机溶剂组分可与水性组分混溶，提供单一的液相，或可与水性组分部分混溶或不混溶，提供双液相。示例性的水性共溶剂系统包含水和一种或多种有机溶剂。通常，选择水性共溶剂系统的有机溶剂组分以便其不会完全使工程化多肽失活。通过在候选溶剂系统中使用感兴趣的底物并利用诸如本文描述的酶活性测定而测量特定的工程化多肽的活性，合适的共溶剂系统可被容易地鉴定。在方法的一些实施方案中，合适的反应条件包括水性共溶剂，所述水性共溶剂包含约1％至约95％(v/v)、约1％至约60％(v/v)、约2％至约60％(v/v)、约5％至约60％(v/v)、约10％至约60％(v/v)、约10％至约50％(v/v)或约10％至约40％(v/v)的浓度的溶剂。在方法的一些实施方案中，合适的反应条件包括含有至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(v/v)的浓度的溶剂。

合适的反应条件可包括提供将底物化合物催化生成其相应的产物化合物的反应参数的组合。相应地，在方法的一些实施方案中，反应参数的组合包括：(a)约5g/l至250g/l化合物(ii)、a1或a2的载量；(b)约1g/l至50g/l的工程化多肽浓度；(c)约4.0至11.0的ph；和(d)约10℃至60℃的温度。

在一些实施方案中，能够进行上述反应的工程化多肽包括对应seqidno：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308的氨基酸序列。

示例性反应条件包括在表2、表3以及实施例8-12中提供的条件。

在进行本文描述的酶催化反应时，工程化多肽可以部分地纯化的或纯化的酶、经热处理的酶液、用编码酶的基因转化的完整细胞、和/或此类细胞的细胞提取物和/或裂解物的形式加入至反应混合物中。用编码工程化多肽的基因转化的完整细胞，或其细胞提取物、其裂解物，以及分离的酶可以多种不同的形式使用，包括固体(例如，冻干的、喷雾干燥的等)或半固体(例如，湿菌体等粗糊状物)。细胞提取物或细胞裂解物可通过沉淀(例如，硫酸铵、聚乙烯亚胺、热处理或类似处理)部分纯化，之后在冻干前进行除盐程序(例如，超滤、透析及类似程序)。任何酶制品可通过使用已知的交联剂诸如，例如戊二醛交联或固定到固相材料(例如树脂)而被稳定化。

在本文描述的酶催化反应的一些实施方案中，反应在本文描述的合适的反应条件下进行，其中工程化多肽被固定至固体支持物上。可用于固定进行酶催化反应的工程化多肽的固体支持物包括但不限于微球或树脂，所述微球或树脂包含具有环氧官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有氨基环氧官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有十八烷基官能团的苯乙烯/dvb共聚物或具有十八烷基官能团的聚甲基丙烯酸酯。示例性固体支持物包括但不限于壳聚糖珠、eupergitc和sepabead(mitsubishi)，包括以下不同类型的sepabead：ec-ep、ec-hfa/s、exa252、exe119和exe120。

在一些实施方案中，其中工程化多肽可以分泌多肽的形式被表达，含有该分泌多肽的培养基可被用于本文的方法中。

在一些实施方案中，固体反应物(例如，酶、盐等)可以各种不同的形式提供给反应，包括粉末(例如，冻干的、喷雾干燥的等)、溶液、乳液、悬浮液等。反应物可使用为本领域普通技术人员共知的方法和仪器容易地冻干或喷雾干燥。例如，蛋白质溶液可以小量冷冻于-80℃，然后加入至预冷却的冻干室内，之后应用真空。

在一些实施方案中，加入反应物的顺序或方式有多种选择。反应物可同时一起加入至溶剂中(例如，单相溶剂、双相水性共溶剂体系等)；或者可选择地，一些反应物可首先加入，其他反应物可流动加入或分批次间隔加入。

本公开内容的不同的特征和实施方案示例于以下代表性的实施例中，其意图是例证性的而不是限制性的。

附图说明

图1酪氨酸酚裂解酶(tpl)催化合成l-酪氨酸的反应

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：基因克隆和表达载体的构建

源自于弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)的野生型的酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列，可从ncbi上检索得到，然后通过本领域的常见技术将其对应的核酸合成出来并克隆到表达载体pacyc-duet-1上。将重组表达质粒转化到e.coilbl21(de3)的感受态细胞中，转化条件42℃，热击90秒，转化液涂布到含有氯霉素的lb平板上，37℃倒置培养过夜，即获得重组转化体。

实施例2：工程化多肽突变文库的构建

这里所用到的都是商业试剂，较佳地选用quikchange试剂盒(供应商：agilent)。突变引物的序列设计按照试剂盒的说明进行。现以单个残基位置的饱和突变文库的构建为例说明。pcr体系为：5xbuffer10ul，10mmdntp1ul，质粒dna模板1ul(50ng/ul),上下游引物各取0.75ul(10um)，高保真酶0.5ul,ddh2o36ul。pcr引物在突变位置的密码子为nnk。

pcr扩增步骤为：(1)98℃，预变性3min；(2)98℃，变性10s；(3)72℃退火和延伸3min；步骤(2)～(3)重复25次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。在pcr产物中加入2uldpni，37℃过夜酶切消除质粒模板。酶切后的pcr产物按转化e.colibl21(de3)感受态细胞，涂布到含氯霉素的lb平板上即得目标残基位置的饱和突变文库。

实施例3：突变酶库的表达和筛选用酶液的制备

从琼脂平板挑取突变酶库的菌落，接种至含有氯霉素的lb培养基的96孔平底浅板中(每孔200ullb培养基)置于摇床180rpm，80％的湿度、30℃过夜培养18～20h。当培养液的od600达到2～3时，取20μl菌液接种到96深孔板中(每孔含400μltb培养基及6g/l乳糖)，置于250rpm、30℃、80％湿度摇床过夜培养18～20h。之后，将培养过夜的深孔板在4000rpm下离心10min，去除培养基并得到菌体。接下来对菌体进行破碎，在含有菌体的深孔板中加入200μl/孔的裂解缓冲液(100mmteoa，ph8.5，含1mg/ml溶菌酶，0.5g/l核酸酶，0.2mmplp)，随后将孔板在振荡器上以700rpm的转速振荡1小时对菌体进行裂解。然后将裂解后的菌液在4000rpm下离心10分钟，每孔取160μl上清到一个新的孔板中，得到供筛选反应用的酶液。

实施例4：筛选反应

实施例3所制得的酶液可以直接用来进行筛选反应。在96孔板上，40μl酶液与160μl的反应母液相混合，使反应体系中各组分的终浓度为【苯酚20g/l，丙酮酸钠25g/l，乙酸铵18g/l，0.2mmplp，0.1mteoa，ph8.5】，将孔板置于250rpm、40℃的摇床中振荡24小时。反应结束后，每孔加入40μl的2mnaoh溶液对反应进行淬灭，置于平板振荡器上震荡30min(800rpm)，然后离心(4000rpm，30min)，取离心后的上清,按照实施例6的方法进行hplc分析并计算苯酚到l-酪氨酸的转化率。

实施例5：酶液的苯酚预处理和筛选反应

从实施例3所制得的酶液中，取40μl酶液与160μl含苯酚的预处理母液在96孔板中混合，置于250rpm、40℃的摇床中振荡20小时，得到预处理后的酶液。预处理母液中苯酚的浓度根据要求可以调整，如果酶液与预处理母液混合后的苯酚的终浓度为11g/l(对应于表3中[11g/l苯酚，20h]的情况)，那么预处理母液的配制如下：13.75g/l苯酚，0.1mteoa，0.2mmplp，ph8.5。预处理完成后，将200μl预处理后的酶液与100μl含有苯酚、丙酮酸钠和乙酸铵的反应母液在96孔板中混合(母液的配制使各个反应物的终浓度满足表3的各个反应条件)，置于250rpm、40℃的摇床中振荡反应6小时。

反应结束后，每孔加入60μl的2mnaoh溶液对反应进行淬灭，置于平板振荡器上震荡30min(800rpm)，然后离心(4000rpm，30min)，取离心后的上清,按照实施例6的方法进行hplc分析并计算苯酚到l-酪氨酸的转化率。

实施例6：分析方法

苯酚和l-酪氨酸的hplc分析方法：分析柱为luna5μmnh2150*4.5mm，流动相为0.1％乙酸水溶液：乙腈＝50:50，流速为2ml/min，检测波长为275nm，苯酚的保留时间为1.0min，l-酪氨酸的保留时间为1.4min。

d-酪氨酸和l-酪氨酸的hplc分析方法：分析注为chirex3126150*4.5mm，流动相为3mm硫酸铜，流速为1.2ml/min,检测波长为226nm，l-酪氨酸的保留时间为31min，d-酪氨酸的保留时间为55min。

实施例7：发酵表达工程化多肽

将包含带有目标工程化多肽表达质粒的大肠杆菌bl21(de3)的单个微生物菌落接种到含30μg/ml氯霉素50mllb肉汤(5.0g/lyeastextract、10g/ltryptone、10g/l氯化钠)中。细胞在30℃摇床中250rpm摇动培养过夜(至少16小时)。当培养物的od600是1.4至2.0时，从培养箱取出细胞，立即使用或储存在4℃。

将含有2.0l生长培养基的5l发酵罐在121℃高压蒸汽灭菌锅灭菌30分钟。向发酵罐接种过夜培养的大肠杆菌(生长在如上述的摇瓶中至初始od600为1.4至2.0)。以夹套循环水控制温度保持在30℃。以200-800rpm搅动发酵罐，以2-8l/min向发酵容器供应空气以保持溶解氧水平为40％饱和或更大。通过加入25-28％v/v氢氧化铵保持培养物的ph在7.0。培养物的生长通过流加含500g/l食用葡萄糖右旋糖一水合物、12g/l氯化铵和5g/l硫酸镁七水合物的补料溶液来维持。培养物达到od600为25±5后，将培养物温度继续维持在30℃，通过加入乳糖至终浓度3.8g/l来诱导工程化tpl多肽的表达，继续发酵另外的18小时。发酵结束后，将发酵液用thermomultifugex3r离心机在4℃以8000rpm离心10分钟来收集湿菌体。

在4℃下将湿菌体用10mmph7.0的磷酸钾盐缓冲液重悬浮,使用thermomultifugex3r离心机在4℃以8000rpm离心10min,再次收集湿菌体，此为清洗后的湿菌体。取上述清洗后湿菌体10g，用50ml10mmph7.0磷酸钾盐缓冲液重悬浮,利用压力均质机破碎2次，得到均质后的菌液。将菌液在4000rpm下离心30min，收集上清液，得到含有工程化tpl多肽酶液。

实施例8：工程化多肽催化生成l-酪氨酸的流加底物的反应工艺

以下为一个具代表性的300ml体积的反应流程和后处理工艺。在容积为500ml的反应瓶里，加入13.11g乙酸铵、169ml水，用水浴控温40℃，搅拌速度400rpm。然后加入1g苯酚水溶液(浓度92％，m/m)，6.2ml丙酮酸钠水溶液(234.4g/l)，用氨水调至ph8.5，加入3mlplp水溶液(20mm)，最后加入7.5ml对应与seqidno：174的酶液，开始反应。在反应过程中，将共计16.42g的苯酚水溶液(浓度92％，m/m)以及93.8ml的丙酮酸钠溶液(234.4g/l)在15小时各自以一定的速率恒速流加进反应瓶中。反应24小时后，取样检测，苯酚转化为l-酪氨酸的摩尔转化率≥95％，产物中l-酪氨酸的ee≥99.5％。

将结束后的反应液进行抽滤，滤饼用50ml纯水淋洗三次。取出滤饼并分散开，然后放在60℃烘箱中烘干12h。将烘干后的固体进行称重，得26.2g提纯后的l-酪氨酸。计算收率为85％。

实施例9：工程化多肽催化生成l-酪氨酸的分批次投料的反应工艺

在容积为250ml的反应瓶里，加入4.37g乙酸铵、71ml水，用水浴控温40℃，搅拌速度400rpm。然后加入0.55ml苯酚水溶液(浓度92％，m/m)，0.78g的丙酮酸钠(固体)，用氨水调至ph8.5，加入2mlplp水溶液(20mm)，最后加入5ml对应与seqidno：304的酶液，开始反应。在反应开始后，每隔1小时分别加入0.55ml苯酚水溶液(浓度92％，m/m)和0.78g丙酮酸钠(固体)，总共添加19次。同时在反应开始后的第6小时、第12小时各加入5ml对应与seqidno：304的酶液，在第8小时加入11ml乙酸铵水溶液(400g/l，用2mnaoh将ph调至8.5)。反应24小时后，取样检测，反应体系中l-酪氨酸的浓度约为200g/l，苯酚转化为l-酪氨酸的摩尔转化率≥95％，产物中l-酪氨酸的ee≥99.5％。

将结束后的反应液进行抽滤，滤饼用50ml纯水淋洗三次。取出滤饼并分散开，然后放在60℃烘箱中烘干12h。将烘干后的固体进行称重，得19.5g提纯后的l-酪氨酸。计算收率为95％。

实施例10：工程化多肽催化生成左旋多巴的反应工艺

以下为一个具代表性的300ml体积的反应流程。在容积为500ml的反应瓶里，加入14.61g乙酸铵、113ml水，用水浴控温15℃，搅拌速度400rpm。然后加入1.88ml邻苯二酚溶液(400g/l)，5.12ml丙酮酸钠溶液(234.4g/l)，0.3g亚硫酸钠，0.6gedta﹒2na，用氨水调至ph8.0，加入3mlplp溶液(20mm)，最后加入30ml对应与seqidno：128的酶液，反应开始，并立即用氮气将反应瓶中的空气置换出来。在反应过程中，将50.62ml邻苯二酚溶液(400g/l)以及94.88ml丙酮酸钠溶液(234.4g/l)在24.5小时各自以一定的速度恒速流加进反应瓶中。反应30小时后，取样检测，邻苯二酚转化为左旋多巴的摩尔转化率≥95％，产物中左旋多巴的ee≥99.5％。

将结束后的反应液进行抽滤，滤饼用50ml纯水淋洗三次。取出滤饼并分散开，然后放在真空干燥箱中(40℃,0.1mpa)烘干12h。将烘干后的固体进行称重，得28.5g左旋多巴。计算收率为85％。

实施例11：工程化多肽催化苯酚和d-丝氨酸或l-丝氨酸生成l-酪氨酸的反应工艺

以下为一个具代表性的5ml体积的反应流程。在容积为30ml的反应瓶里，加入26.7mg苯酚，60mgd-丝氨酸或l-丝氨酸,4.4mlteoa-hcl(0.1m，ph8.5)，用氨水调至ph8.5，加入0.1mlplp溶液(10mm)，最后加入0.5ml对应与seqidno：278的酶液，置于40℃、400rpm的磁力搅拌反应器上开始反应。反应24小时后，取样检测，苯酚转化为l-酪氨酸的摩尔转化率≥95％，产物中l-酪氨酸的ee≥99.5％。

实施例12：工程化多肽催化邻苯二酚和d-丝氨酸或l-丝氨酸生成左旋多巴的反应工艺

以下为一个具代表性的5ml体积的反应流程。在容积为30ml的反应瓶里，加入25mg邻苯二酚，60mgd-丝氨酸或l-丝氨酸，5mg亚硫酸钠，10mgedta﹒2na,4.4mlteoa-hcl(0.1m，ph8.0)，用氨水调至ph8.0，加入0.1ml10mmplp，最后加入0.5ml对应与seqidno：280的酶液。置于15℃、400rpm的磁力搅拌反应器上开始反应。反应24小时后，取样检测，邻苯二酚转化为左旋多巴的摩尔转化率≥95％，产物中左旋多巴的ee≥99.5％。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>宁波酶赛生物工程有限公司

<120>工程化多肽及其在合成酪氨酸或酪氨酸衍生物中的应用

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)

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<400>3

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