一种深层土中噬菌体的分离方法与流程

本发明涉及一种深层土中噬菌体的分离方法，属于微生物分离技术领域。

背景技术：

噬菌体是由frederickw.twort和felixd’herelle于1915年和1917年分别发现，是可感染细菌等原核微生物的病毒。现在的研究发现，噬菌体是地球上数量最多的生命体，数量级达到10¹³，分布于生物圈的所有角落。可根据其生活史，将噬菌体分为烈性噬菌体和溶源性噬菌体两大类。烈性噬菌体可以通过裂解宿主菌，繁殖子代噬菌体。溶源性噬菌体则可在某些条件下选择进入溶源循环，将自身的基因组整合进宿主菌的基因组中和宿主菌稳定共存，在受到外界刺激时又可转入裂解循环，裂解宿主菌。

因为噬菌体所具有的裂解宿主菌的特性，利用噬菌体治疗细菌性感染已被广泛研究，这种治疗方法被称作噬菌体疗法。因为抗生素的存在，现在噬菌体疗法并未被大量应用。但随着病原菌抗生素耐药性的日益严重和超级细菌的不断出现，传统的抗生素治疗已受到严重挑战。噬菌体疗法也越来越受到科学家的重视。

噬菌体疗法的关键点在于分离尽量多的噬菌体。到目前为止，已有大量的噬菌体被分离测序，但它们的数量和自然界中的实际数量相比还有较大差距。并且这些被分离的噬菌体大多数来自于浅层土和水体，从深层土中分离噬菌体的数目太少。

中国专利文献cn104312984a(申请号201410593832.9)公开了一种水中噬菌体的分离方法，主要通过正电荷硅胶颗粒制备、洗脱以及噬菌体分离等步骤，高效的分离水环境中极低浓度的噬菌体。

中国专利文献cn109750026a(申请号201910061904.8)公开了一种筛选噬菌体的前处理方法。首先，向处于生长对数期的目标菌株发酵液中按照一定的质量百分比添加海藻酸钠、聚二甲基硅氧烷、低聚异麦芽糖和纳基膨润土，搅拌混匀至完全溶解，然后，利用滴液发生器将上述溶液滴至氯化钙溶液中形成微球，回收微球并将其置于真空冷冻干燥机中干燥，将冻干微球置于噬菌体分离原液中孵育，同时使用磁力搅拌器保持噬菌体分离原液的流动性，回收微球，并将微球置于研钵中，向研钵中加入pbs溶液，研磨至微球溶解在pbs溶液中，将溶解后的溶液过0.22微米孔径滤膜，收集滤过液，滤过液即为目标菌株的噬菌体富集液。

中国专利文献cn104849249a(申请号201510215442.2)公开了一种利用荧光显微镜测定土壤中噬菌体丰度的优化方法。通过分别利用ph8.0的1×te缓冲溶液、10％tween80和10mm的焦磷酸钠等试剂对土壤中腐植酸处理从而制备出土壤悬浮液，并采取了对样品不同倍数的稀释，然后进行样品的染色和制片，在荧光显微镜下观察制片效果，利用荧光显微镜测定样品核酸荧光强度及土壤中的噬菌体丰度准确分析，结果表明用10％tween80和10mm的焦磷酸钠同时处理样品并对样品稀释10倍时制片效果最好，测得的噬菌体丰度较高。本发明的方法制样简单，准确性高，重复性好，操作简便快速，为噬菌体丰度的快速测定提供了方法依据。

上述专利文献cn104312984a(申请号201410593832.9)的方法主要应用于水环境中噬菌体的分离；专利文献cn109750026a(申请号201910061904.8)的方法主要针对噬菌体宿主菌进行处理；专利文献cn104849249a(申请号201510215442.2)的方法主要是为了荧光显微镜检测噬菌体，不是获得有感染能力的噬菌体，且处理对象并非针对深层土。当将它们应用于深层土中噬菌体的分离时，由于不存在对深层土的前处理步骤以及对噬菌体的缓冲保护，会出现分离失败、分离效率低、丢失某些噬菌体物种等问题，并无法高效率的分离噬菌体。

技术实现要素：

本发明针对现有技术不足，提供了一种深层土中噬菌体的分离方法。

本发明的技术方案如下：

一种深层土中噬菌体的分离方法，包括如下步骤：

(1)将土壤样品与悬浮液混合，超声震荡处理，离心，取上清液，制得噬菌体初提液；

(2)将步骤(1)制得的噬菌体初提液经0.22μm的滤膜过滤，制得噬菌体提取液；

(3)将步骤(2)制得的噬菌体提取液经30kd的超滤膜离心过滤，去除滤出液，制得噬菌体浓缩液；

(4)将步骤(3)制得噬菌体浓缩液、宿主菌菌液和缓冲液混合后，35～38℃静置20～28小时，离心，取上清，经0.22μm的滤膜过滤，取滤液，制得噬菌体。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，悬浮液为质量百分比浓度为1％的柠檬酸钾缓冲液；进一步优选的，所述所述柠檬酸钾缓冲液每升组份如下：

10g柠檬酸钾、1.44gna2po4、0.24gkhpo4，ph7.0，定溶至1升。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，土壤样品与悬浮液的质量体积比为1:1，单位g/ml。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，超声震荡为在0℃、100w、20khz的条件下处理3min，每超声处理1min翻转震荡30秒。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，离心为在4℃、9000g离心15min。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，离心为在4℃、5000g离心15min。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，噬菌体浓缩液：宿主菌菌液：缓冲液的体积比为1：(8～12)：(45～55)。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，宿主菌菌液中宿主菌菌体浓度为od600＝0.8。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，缓冲液为成分如下：

tris–hcl50mm，nacl150mm，mgcl210mm，cacl22mm，ph＝7.5。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，离心为在4℃、9000g离心15min。

有益效果

本发明克服了现有噬菌体分离方法效率低下，无法有效分离深层土中噬菌体的弊端。通过对深层土样品重悬至可有效保护噬菌体的柠檬酸钾缓冲液，并进行超声、过滤、超滤等前处理，得到土壤中的噬菌体群；然后将获得的噬菌体群和相应的噬菌体宿主菌共培养，富集待分离的噬菌体；该方法不只是可有效分离深层土的噬菌体，还大大提高了噬菌体分离的效率，并且操作简单、可行性强、成本低，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1所述方法得到的噬菌体原液后铺双层平板后结果，形成了噬菌斑；

图2为实施例2所述方法得到的噬菌体原液后铺双层平板后结果，形成了噬菌斑；

图3为对比例1所述方法得到的噬菌体原液后铺双层平板后结果，未形成噬菌斑；

图4为对比例2所述方法得到的噬菌体原液后铺双层平板后结果，未形成噬菌斑。

图5为对比例3所述方法得到的噬菌体原液后铺双层平板后结果，未形成噬菌斑；

图6为对比例4所述方法得到的噬菌体原液后铺双层平板后结果，未形成噬菌斑。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所述0.22μm滤膜为0.22μmpessyringefilters，购自thermoscientific公司；所述超滤离心管为15ml/30kdultrafiltrationcentrifugaltube，购自solarbio公司；

土壤来源：甲子湖边地表土壤80cm以下深层土。

实施例1

一种深层土中大肠埃希氏菌dh5α噬菌体的分离方法，包括如下步骤：

1.称取10g土壤样品，将其重悬在10ml的1％柠檬酸钾缓冲液中置于15ml无菌离心管中。用100w,20khz在冰上超声3min。每超声1min都翻转震荡30秒。

2.4℃，9,000g离心15min，使得菌体沉淀。

3.将上一步得到的上清液通过无菌的0.22μmpessyringefilters。

4.将上一步得到的上清液置于30kd的15ml超滤离心管中，4℃，5000g，离心15min。

5.收集超滤管中上层液体置于无菌离心管中，4℃保存待用。

6.将大肠埃希氏菌dh5α接种在15ml液体培养基中37℃培养24小时。

7.取1ml上一步得到的大肠埃希氏菌dh5α的菌液，100μl第5步收集得到的上层液体，5mlmpbuffer(tris–hclph＝7.550mm，nacl150mm，mgcl210mm，cacl22mm)。混合后，37℃培养24小时。

8.4℃，9,000g离心15min，使得菌体沉淀。

9.将上一步得到的上清液通过无菌的0.22μmpessyringefilters，将得到的液体4℃保存待用。

10.利用固体培养基铺下层平板。取1ml第6步得到的大肠埃希氏菌dh5α的菌液、3ml水琼脂(0.7％琼脂，1mmcacl2)和上一步得到的液体10μl，混合后铺上层平板。37℃，倒置培养24小时。检测是否有噬菌斑出现。

实施例2

一种深层土中铜绿假单胞菌atcc9027噬菌体的分离方法，包括如下步骤：

1.称取10g土壤样品，将其重悬在10ml的1％柠檬酸钾缓冲液中置于15ml无菌离心管中。用100w,20khz在冰上超声3min。每超声1min都翻转震荡30秒。

2.4℃，9,000g离心15min，使得菌体沉淀。

3.将上一步得到的上清液通过无菌的0.22μmpessyringefilters。

4.将上一步得到的上清液置于30kd的15ml超滤离心管中，4℃，5000g，离心15min。

5.收集超滤管中上层液体置于无菌离心管中，4℃保存待用。

6.将铜绿假单胞菌atcc9027接种在15ml液体培养基中37℃培养24小时。

7.取1ml上一步得到的铜绿假单胞菌atcc9027的菌液，100μl第5步收集得到的上层液体，5mlmpbuffer(tris–hclph＝7.550mm，nacl150mm，mgcl210mm，cacl22mm)。混合后，37℃培养24小时。

8.4℃，9,000g离心15min，使得菌体沉淀。

9.将上一步得到的上清液通过无菌的0.22μmpessyringefilters，将得到的液体4℃保存待用。

10.利用固体培养基铺下层平板。取1ml第6步得到的铜绿假单胞菌atcc9027的菌液、3ml水琼脂(0.7％琼脂，1mmcacl2)和上一步得到的液体10μl，混合后铺上层平板。37℃，倒置培养24小时。检测是否有噬菌斑出现。

对比例1

采用中国专利文献cn104312984a(申请号201410593832.9)说明书中实施例1所述的方法分离大肠埃希氏菌dh5α噬菌体，步骤如下：

(1)正电荷硅胶颗粒的制备

①室温下称取6.675g氯化铝缓慢加入到950ml蒸馏水中使溶解；加入45ml、2m碳酸钠水溶液，出现乳白色的al(oh)3凝胶，调节ph值至7.2，加水定容至1000ml；在室温下静置24h；

②将步骤①获得的液体以1100g离心15min后弃上清；向沉淀中加入0.14m氯化钠水溶液至1000ml重悬沉淀，静置24h；

③重复步骤②3次，于121℃高压灭菌20min，冷却至常温；

④取1375g粒径为270μm硅胶加入到步骤③获得的液体中，边加边搅拌，使之充分混匀，置于60℃烤箱中烤干，得到正电荷硅胶颗粒；

(2)洗脱液的配制

称取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化钠、37.5g甘氨酸和20g氢氧化钠加蒸馏水至1l，加热溶解，用0.1mol/l盐酸溶液或0.1mol/l氢氧化钠水溶液调节ph为10.2，在121℃下高压灭菌20min；

(3)噬菌体的分离：

①称取10g土壤样品，将其重悬在100l自来水中，其中加入硫代硫酸钠(每升水中加入0.5ml质量浓度为10％硫代硫酸钠水溶液)以中和水中的余氯，得待测水样；

在内径为83.5mm、高为400mm的层析柱中加入1.5l灭菌蒸馏水，再加入800g正电荷硅胶颗粒不断搅拌去除气泡，通过蠕动泵以500ml/min速度将待测水样从层析柱的顶部流过层析柱；

②当待测水样全部流过层析柱后，用2800g的洗脱液洗脱，收集洗脱流出液，调节ph为7.2；加入peg6000使质量浓度为13％并在搅拌下使peg6000溶解，在常温下静置30min，15000g离心30min，弃上清液，用0.1mph＝7.2的pbs重悬沉淀并定容至50ml得液体1，向液体1中加入5ml10×的lb液体培养基，得液体2；

③另取1ml10×lb液体培养基加灭菌生理盐水至10ml得1×lb液体培养基，将噬菌体的宿主菌大肠埃希氏菌15597接种至1×lb液体培养基中，35℃下培养24h；

④取1ml步骤(3)③获得的菌液接种至液体2中，37℃下培养24h，然后4000g离心10min，收集上清液，取1ml上清液与100μl步骤(3)③获得的菌液混匀后静置5min，采用双层平板法检测上清液中有噬菌斑出现。

对比例2

采用中国专利文献cn104312984a(申请号201410593832.9)说明书中实施例1所述的方法分离铜绿假单胞菌atcc9027噬菌体，步骤如下：

(1)正电荷硅胶颗粒的制备

①室温下称取6.675g氯化铝缓慢加入到950ml蒸馏水中使溶解；加入45ml、2m碳酸钠水溶液，出现乳白色的al(oh)3凝胶，调节ph值至7.2，加水定容至1000ml；在室温下静置24h；

②将步骤①获得的液体以1100g离心15min后弃上清；向沉淀中加入0.14m氯化钠水溶液至1000ml重悬沉淀，静置24h；

③重复步骤②3次，于121℃高压灭菌20min，冷却至常温；

④取1375g粒径为270μm硅胶加入到步骤③获得的液体中，边加边搅拌，使之充分混匀，置于60℃烤箱中烤干，得到正电荷硅胶颗粒；

(2)洗脱液的配制

称取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化钠、37.5g甘氨酸和20g氢氧化钠加蒸馏水至1l，加热溶解，用0.1mol/l盐酸溶液或0.1mol/l氢氧化钠水溶液调节ph为10.2，在121℃下高压灭菌20min；

(3)噬菌体的分离：

①称取10g土壤样品，将其重悬在100l自来水中，其中加入硫代硫酸钠(每升水中加入0.5ml质量浓度为10％硫代硫酸钠水溶液)以中和水中的余氯，得待测水样；

在内径为83.5mm、高为400mm的层析柱中加入1.5l灭菌蒸馏水，再加入800g正电荷硅胶颗粒不断搅拌去除气泡，通过蠕动泵以500ml/min速度将待测水样从层析柱的顶部流过层析柱；

②当待测水样全部流过层析柱后，用2800g的洗脱液洗脱，收集洗脱流出液，调节ph为7.2；加入peg6000使质量浓度为13％并在搅拌下使peg6000溶解，在常温下静置30min，15000g离心30min，弃上清液，用0.1mph＝7.2的pbs重悬沉淀并定容至50ml得液体1，向液体1中加入5ml10×的lb液体培养基，得液体2；

③另取1ml10×lb液体培养基加灭菌生理盐水至10ml得1×lb液体培养基，将噬菌体的宿主菌铜绿假单胞菌atcc9027接种至1×lb液体培养基中，35℃下培养24h；

④取1ml步骤(3)③获得的菌液接种至液体2中，37℃下培养24h，然后4000g离心10min，收集上清液，取1ml上清液与100μl步骤(3)③获得的菌液混匀后静置5min，采用双层平板法检测上清液中有噬菌斑出现。

对比例3

一种土壤中噬菌体的分离方法，步骤如下：

1.配制1×te缓冲液。1mtris-hcl：取121.1gtris，加浓盐酸约42ml高温高盐灭菌后，冷却到室温后调ph为8.0；0.5medta(ph8.0)：186.1gna2edta·2h2o，用naoh调ph至8.0,高温高压灭菌，室温保存；10×te缓冲液(ph8.0)的配制：1mtris-hcl(ph8.0)取100ml，0.5medta(ph8.0)取20ml，高温高压灭菌，室温保存。1×te缓冲液用10×te缓冲液稀释10倍即可。

2.称取10g土壤样品，将其重悬在40mlph8.0经过0.22μm滤膜过滤的1×te缓冲液，置于50ml无菌离心管中。用100w,20khz在冰上超声3min。每超声1min都翻转震荡30秒。

3.4℃，9,000g离心15min，使得菌体沉淀。

4.将上一步得到的上清液通过无菌的0.22μmpessyringefilters。

5.将上一步得到的上清液置于30kd的15ml超滤离心管中，4℃，5000g，离心15min。

6.收集超滤管中上层液体置于无菌离心管中，4℃保存待用。

7.将铜绿假单胞菌atcc9027接种在15ml液体培养基中37℃培养24小时。

8.取1ml上一步得到的铜绿假单胞菌atcc9027的菌液，100μl第5步收集得到的上层液体，5mlmpbuffer(tris–hclph＝7.550mm，nacl150mm，mgcl210mm，cacl22mm)。混合后，37℃培养24小时。

9.4℃，9,000g离心15min，使得菌体沉淀。

10.将上一步得到的上清液通过无菌的0.22μmpessyringefilters，将得到的液体4℃保存待用。

11.利用固体培养基铺下层平板。取1ml第6步得到的铜绿假单胞菌atcc9027的菌液、3ml水琼脂(0.7％琼脂，1mmcacl2)和上一步得到的液体10μl，混合后铺上层平板。37℃，倒置培养24小时。检测是否有噬菌斑出现。

对比例4

一种土壤中噬菌体的分离方法，步骤如下：

1.称取10g土壤样品，将其重悬在10ml的1％柠檬酸钾缓冲液中置于15ml无菌离心管中。用59hz超声45s，停30s，重复3次。

2.4℃，9,000g离心15min，使得菌体沉淀。

3.将上一步得到的上清液通过无菌的0.22μmpessyringefilters。

4.将上一步得到的上清液置于30kd的15ml超滤离心管中，4℃，5000g，离心15min。

5.收集超滤管中上层液体置于无菌离心管中，4℃保存待用。

6.将铜绿假单胞菌atcc9027接种在15ml液体培养基中37℃培养24小时。

7.取1ml上一步得到的铜绿假单胞菌atcc9027的菌液，100μl第5步收集得到的上层液体，5mlmpbuffer(tris–hclph＝7.550mm，nacl150mm，mgcl210mm，cacl22mm)。混合后，37℃培养24小时。

8.4℃，9,000g离心15min，使得菌体沉淀。

9.将上一步得到的上清液通过无菌的0.22μmpessyringefilters，将得到的液体4℃保存待用。

10.利用固体培养基铺下层平板。取1ml第6步得到的铜绿假单胞菌atcc9027的菌液、3ml水琼脂(0.7％琼脂，1mmcacl2)和上一步得到的液体10μl，混合后铺上层平板。37℃，倒置培养24小时。检测是否有噬菌斑出现。

结果分析

实施例1双层平板法铺板后得到图1；实施例2双层平板法铺板后得到图2；对比例1双层平板法铺板后得到图3；对比例2双层平板法铺板后得到图4；对比例3双层平板法铺板后得到图5；对比例4双层平板法铺板后得到图6。通过比较图1、图2、图3、图4、图5和图6结果，可以看出实施例1可以有效的分离出大肠埃希氏菌dh5α噬菌体，实施例2可以有效的分离出铜绿假单胞菌atcc9027噬菌体，而对比例1、对比例2、对比例3和对比例4的方法没有分离出相应噬菌体。经分析发现深层土壤中噬菌体的分离的重要步骤是土壤颗粒有效打散，以释放出被土壤包裹着的噬菌体，且保持噬菌体的感染能力。通过1％柠檬酸钾缓冲液重悬土壤，并利用100w,20khz冰上超声3min，可提高有感染能力的噬菌体分散到缓冲液中的效率，帮助后续的分离过程。