本发明涉及细胞工程的技术领域，更具体地说，涉及一种人脂肪间充质干细胞裂解物的获取与纯化方法。
背景技术：
难愈性创面主要是指不能一次性愈合的创面，一般来说均会发生二次污染，在创面治疗的过程中，难愈性创面是目前创面修复领域研究的重点内容。一方面，我国糖尿病患者逐渐增多，随之难愈性创面成为医疗系统的重大负担，另一方面，医疗系统面临着各种肿瘤手术后的继发创面。难愈性创面现阶段在临床医学界还没有统一的界定标准，常规情况下被认识是基于多种因素所引发的，经由常规治疗超过8周没有愈合或是没有出现愈合趋势的创面。虽然难愈性创面不会立刻威胁生命，但因长达数月甚至数年、十数年的经久不愈，严重影响患者原发病康复和生活质量，也给家庭带来沉重的护理和经济负担，少数可发生溃疡癌变。因而难愈性创面的治疗一直以来都是我国医学界重点关注的问题之一。
针对难愈性创面的治疗，采用的治疗方式主要有物理治疗、药物治疗、封闭负压吸引技术、骨髓间充质干细胞填充技术、成纤维细胞生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子技术等等。上述治疗方式在针对创面的治疗中，能够显著提高创面的缩小幅度，具有较好的治疗效果，但是在针对难愈性创面的治疗过程中，其治疗效果还比较有限，
目前在研究脂肪间充质干细胞治疗难愈性创面的过程中，大部分研究学者均将重点放在研究进展或综述性研究方面，对于临床研究还处于起步阶段，有待进一步完善。间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞，常见的间充质细胞有脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、牙龈间充质干细胞等。与其他间充质干细胞的来源相比，脂肪组织是来源丰富、可消耗且容易获得的组织，因此，脂肪间充质干细胞逐渐成为研究难愈性创面治疗方向的热点，
在治理难愈性创面的过程中，采用脂肪间充质干细胞进行治疗是近年来研究的热点方向。利用脂肪间充质干细胞治疗难愈性创面的过程中，采用的治疗方式是将脂肪间充质干细胞裂解液涂抹创面进行治疗。由于间充质干细胞是一种多潜能细胞，具有较强的自我修复能力，故脂肪间充质干细胞裂解液中含有具有自我修复能力的成分。因此，通过改善人脂肪间充质干细胞裂解物的获取和纯化方式，进而提高人脂肪间充质干细胞裂解物的获取量，对利用脂肪间充质干细胞治疗难愈性创面的治疗效果将会有进一步地提高。
技术实现要素：
针对现有方法存在的不足，本发明的目的在于提供一种人脂肪间充质干细胞裂解物的获取与纯化方法，提高人脂肪间充质干细胞裂解物的获取量，进而提高利用脂肪间充质干细胞治疗难愈性创面的治疗效果，缩短治疗周期。
为实现上述目的，本发明提供了如下方法方案：一种人脂肪间充质干细胞裂解物的获取与纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)细胞获取：取人脂肪组织样品，进行原代细胞获取原代间充质干细胞，将获取的原代间充质干细胞进行传代培养；
(2)初步裂解：将第(1)步获得的传代细胞调整细胞浓度为1×106-6×106，溶解于生理盐水中，所用生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为2：1，于-80℃冰箱中冷冻至完全冻结，后置于40℃温度条件下加热，完成冻融操作，离心得到细胞悬液a和沉淀a，收集细胞悬液a，得到初步裂解物；
(3)深度裂解：向第(2)步获得的沉淀a中加入含有体积浓度为0.1％的动物细胞裂解液的生理盐水，所用生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为2：1，于振幅为20％、4℃的超声条件下超声处理，离心得到细胞悬液b和沉淀b，收集细胞悬液b，得到深度裂解物，弃去沉淀b；
(4)裂解物纯化：将第(3)步获得的细胞悬液a和第(4)步获得的细胞悬液b分别用生理盐水溶解并混合，所用生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为1：1，得到混合裂解液；
将混合裂解液离心得到细胞悬液c和沉淀c，弃去沉淀c，收集细胞悬液c，得到最终裂解物，将最终裂解物用生理盐水溶解，所用生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为2：1，在4℃条件下保存，备用。
通过采用上述方法方案，本发明提供的对于人脂肪间充质干细胞裂解物的获取与纯化方法，将人脂肪组织样品中的原代间充质干细胞获取并进行传代培养，后对传代培养进行初步裂解，初步裂解获得细胞悬液a和沉淀，再对初步裂解获得的沉淀进行深度裂解，获得细胞悬液b，再将细胞悬液a和细胞悬液b混合离心得到最终裂解物，并用生理盐水溶解保存。
在冻融的操作中，现有的操作通常是在室温条件下或者与室温条件接近的水浴温度下对冻结的细胞进行融化，对细胞膜以及细胞内的细胞器的损坏作用一般，本发明中用到的融化温度为40℃，一方面，一般情况下，蛋白成分的变性温度一般在60℃-80℃之间，40℃条件下未达到蛋白的变性温度，因而不会影响待提取的有效蛋白成分的性质和作用，另一方面，相比25℃的温度条件，40℃的温度条件对于冻结的细胞来说，是更加剧烈的，故在40℃的温度条件下，对冻结的细胞造成的破坏作用更大，因而更有利于从人脂肪间充质干细胞中获取具有有效作用的蛋白成分。
动物细胞裂解液含有多种细胞裂解成分，可以在变性或非变性的条件下迅速裂解组织或培养细胞，使其释放出细胞内蛋白。前面经过反复冻融处理后的沉淀a中仍残留有具有有效作用的蛋白成分，现有的做法是将这部分沉淀直接丢弃，而本发明中则是加入少量动物细胞裂解物配合超声处理，对沉淀a进一步处理，进而从中进一步提取具有有效作用的蛋白成分。
细胞膜的破裂与溶液的渗透压有关，因此，在蒸馏水和生理盐水作为溶解细胞的溶液的备选下，选择生理盐水作为溶解细胞的溶液；为了更加方便对于人脂肪间充质干细胞裂解物的获取，对加入的溶解细胞的生理盐水的体积进行了进一步的限定，经过试验探究，得到第(2)步中溶解于传代细胞生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为2：1；第(3)步中溶解沉淀a且含有动物细胞裂解液的生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为2：1；第(4)步中分别溶解第(3)步的细胞悬液a和第(4)步的细胞悬液b的生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为1，以及溶解最终裂解物的生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为2：1。
目前来说，超声处理和反复冻融是常用的两种获得细胞裂解物方法，但是该种方法获得的细胞裂解物中均只能得到60％左右的有效蛋白物质，为了进一步提高人脂肪间充质干细胞裂解物的获取效率，本发明在超声处理和反复冻融的基础上，将超声处理和反复冻融结合，并加入极少量的动物细胞裂解液。经过多次试验探究，得到各种条件的最优参数，进而最大程度地提高人脂肪间充质干细胞裂解物的获取量，进而提高利用脂肪间充质干细胞治疗难愈性创面的治疗效果，缩短治疗周期。
进一步地，所述第(1)步中获取的原代间充质干细胞的传代培养方式为用0.25％胰蛋白酶和生理盐水以1:1比例混合的混合液对原代间充质干细胞进行传代培养。
通过采用上述方法方案，胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，合适的胰蛋白酶的浓度对于细胞的传代培养有重要的作用，且不同组织或者细胞对胰蛋白酶的作用反应不一样。本发明中利用浓度为0.25％的胰蛋白酶和生理盐水以1：1的比例混合后的溶液作为人脂肪组织细胞传代培养过程中的消化液，经过实践，在此浓度下的消化液下细胞传代培养效果明显好于其他浓度的消化液下的培养效果。
进一步地，所述第(1)步中获取的原代间充质干细胞的传代培养至p3代细胞。
通过采用上述方法方案，经过试验发现，传代细胞中的第三代细胞具有较高的细胞活性和形态稳定性，具有更高含量的具有有效作用的蛋白成分，更适合进行裂解物的提取，因此选择p3代细胞作为获取人脂肪间充质干细胞裂解物的原细胞。
进一步地，将所述第(2)步中的冻融操作重复三次。
通过采用上述方法方案，为了进一步提高对于人脂肪间充质干细胞裂解物的获取效率更高，将上述冻融操作重复三次。
进一步地，所述第(2)步中的冻融操作的加热时间为20min。
进一步地，所述第(3)步中的超声处理的时间为10min。
通过采用上述方法方案，经过试验探究，冻融操作的加热时间为20min、超声处理的时间为10min的条件下，对于人脂肪间充质干细胞裂解物的获取效率更高。
综上所述，本发明提供了一种人脂肪间充质干细胞裂解物的获取与纯化方法，在超声处理和反复冻融的基础上，将超声处理和反复冻融结合，并加入极少量的动物细胞裂解液。经过多次试验探究，得到各种条件的最优参数，进而最大程度地提高人脂肪间充质干细胞裂解物的获取量，进而提高利用脂肪间充质干细胞治疗难愈性创面的治疗效果，缩短治疗周期。
具体实施方式
本发明的试验方法和检测方法中，如无特别说明，均为常规方法；试验中所用器具仪器皆可通过商业途径获得。本发明的人脂肪组织样品来自于吸脂术后且经过d-hank’s溶液清洗的人脂肪组织；用到的动物细胞裂解液(animalcelllysissolution)购自上海泽叶生物科技有限公司。
本发明提供了一种人脂肪间充质干细胞裂解物的获取与纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)细胞获取：取人脂肪组织样品，用pbs缓冲液洗涤人脂肪组织，并剪裁成1mm3小块，用0.15％i型胶原酶消化45min，1200r/min离心5min后收集细胞沉淀，弃去上清液；
(2)细胞传代：向第(1)步获得的细胞沉淀样品中加入包含10％胎牛血清的f12/dmem培养基，吹打细胞沉淀，并于37℃、5％的co2培养箱中培养24h后，当细胞生长至70％-80％融合时，将获得的脂肪间充质干细胞用0.25％胰蛋白酶和生理盐水以1:1比例混合的混合液进行传代培养，并传至p3代细胞；
(3)初步裂解：将第(2)步获得的p3代细胞调整细胞浓度为1×106-6×106，溶解于生理盐水中，所用生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为2：1，于-80℃冰箱中冷冻至完全冻结，后置于40℃温度条件下加热20min，重复上述冻融操作三次，在4℃、3000rpm下离心5min，得到细胞悬液a和沉淀a，收集细胞悬液a，得到初步裂解物；
(4)深度裂解：向第(3)步获得的沉淀a中加入含有体积浓度为0.1％的动物细胞裂解液的生理盐水，所用生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为2：1，于振幅为20％、4℃的超声条件下超声处理10min，在4℃、3000rpm下离心5min，得到细胞悬液b和沉淀b，收集细胞悬液b，得到深度裂解物，弃去沉淀b；
(5)裂解物纯化：将第(3)步获得的细胞悬液a和第(4)步获得的细胞悬液b分别用生理盐水溶解并混合，所用生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为1：1，得到混合裂解液；
将混合裂解液于4℃、3000rpm下离心5min，得到细胞悬液c和沉淀c，弃去沉淀c，收集细胞悬液c，得到最终裂解物，将最终裂解物用生理盐水溶解，所用生理盐水的体积(ml)与第(1)步中人脂肪组织样品质量(g)的比例为2：1，在4℃条件下保存，备用。
以下结合实施例、对比例以及各例中脂肪间充质干细胞的分离结果对本发明作进一步详细说明。
实施例
实施例1
本实施例提供了一种人脂肪间充质干细胞裂解物的获取与纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)细胞获取：取500mg人脂肪组织样品，用pbs缓冲液洗涤人脂肪组织，并剪裁成1mm3小块，用0.15％i型胶原酶消化45min，1200r/min离心5min后收集细胞沉淀，弃去上清液；
(2)细胞传代：向第(1)步获得的细胞沉淀样品中加入包含10％胎牛血清的f12/dmem培养基，吹打细胞沉淀，并于37℃、5％的co2培养箱中培养24h后，当细胞生长至70％-80％融合时，将获得的脂肪间充质干细胞用0.25％胰蛋白酶和生理盐水以1:1比例混合的混合液进行传代培养，并传至p3代细胞；
(3)初步裂解：将第(2)步获得的p3代细胞调整细胞浓度为1×106，溶解于1ml生理盐水中，于-80℃冰箱中冷冻30min至完全冻结，后置于40℃的水浴锅中加热20min，重复上述冻融操作三次，在4℃、3000rpm下离心5min，得到细胞悬液a和沉淀a，收集细胞悬液a，得到初步裂解物；
(4)深度裂解：向第(3)步获得的沉淀a中加入1ml含有体积浓度为0.1％的动物细胞裂解液的生理盐水，于振幅为20％、4℃的超声波粉碎机中超声处理10min，在4℃、3000rpm下离心5min，得到细胞悬液b和沉淀b，收集细胞悬液b，得到深度裂解物，弃去沉淀b；(5)裂解物纯化：将第(3)步获得的细胞悬液a和第(5)步获得的细胞悬液b分别用0.5ml生理盐水溶解并混合，得到混合裂解液：
将混合裂解液于4℃、3000rpm下离心5min，得到细胞悬液c和沉淀c，弃去沉淀c，收集细胞悬液c，得到最终裂解物，将最终裂解物用1ml生理盐水溶解，在4℃条件下保存，备用。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于将第(3)步中获得的p3代细胞调整细胞浓度为2×106，其余步骤以及参数均与实施例1给出的步骤和参数相同。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于将第(3)步中获得的p3代细胞调整细胞浓度为4×106，其余步骤以及参数均与实施例1给出的步骤和参数相同。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于将第(3)步中获得的p3代细胞调整细胞浓度为6×106，其余步骤以及参数均与实施例1给出的步骤和参数相同。
对比例对比例1
本对比例提供了现有技术中的一种人脂肪间充质干细胞裂解物的获取与纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)细胞获取：取500mg人脂肪组织样品，用pbs缓冲液洗涤人脂肪组织，并剪裁成1mm3小块，用0.15％i型胶原酶消化45min，1200r/min离心5min后收集细胞沉淀，弃去上清液；
(2)细胞传代：向第(1)步获得的细胞沉淀样品中加入包含10％胎牛血清的f12/dmem培养基，吹打细胞沉淀，并于37℃、5％的co2培养箱中培养24h后，当细胞生长至70％-80％融合时，将0.25％胰蛋白酶加入获得的脂肪间充质干细胞中进行传代培养；
(3)裂解物获取：将第(2)步获得的传代细胞调整细胞浓度为1×106，溶解于1ml生理盐水中，于-80℃冰箱中冷冻30min至完全冻结，后置于25℃室温条件下30min，在4℃、3000rpm下离心5min，得到细胞悬液a1和沉淀a1，收集细胞悬液a，得到裂解物，在4℃条件下保存，备用。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于将第(3)步中获得的p3代细胞调整细胞浓度为2×106，其余步骤以及参数均与对比例1给出的步骤和参数相同。
对比例3
本对比例与实施例1的不同之处在于将第(3)步中获得的p3代细胞调整细胞浓度为4×106，其余步骤以及参数均与对比例1给出的步骤和参数相同。
对比例4
本对比例与实施例1的不同之处在于将第(3)步中获得的p3代细胞调整细胞浓度为6×106，其余步骤以及参数均与对比例1给出的步骤和参数相同。
对比例5
本对比例提供了现有技术中的一种人脂肪间充质干细胞裂解物的获取与纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)细胞获取：取500mg人脂肪组织样品，用pbs缓冲液洗涤人脂肪组织，并剪裁成1mm3小块，用0.15％i型胶原酶消化45min，1200r/min离心5min后收集细胞沉淀，弃去上清液；
(2)细胞传代：向第(1)步获得的细胞沉淀样品中加入包含10％胎牛血清的f12/dmem培养基，吹打细胞沉淀，并于37℃、5％的co2培养箱中培养24h后，当细胞生长至70％-80％融合时，将0.25％胰蛋白酶加入获得的脂肪间充质干细胞中进行传代培养；
(3)裂解物获取：将第(2)步获得的传代细胞调整细胞浓度为1×106，溶解于1ml生理盐水中，于振幅为20％、4℃的超声波粉碎机中超声处理10min，在4℃、3000rpm下离心5min，得到细胞悬液b1和沉淀b1，收集细胞悬液b1，得到裂解物，在4℃条件下保存，备用。
对比例6
本对比例与实施例5的不同之处在于将第(3)步中获得的p3代细胞调整细胞浓度为2×106，其余步骤以及参数均与对比例5给出的步骤和参数相同。
对比例7
本对比例与实施例5的不同之处在于将第(3)步中获得的p3代细胞调整细胞浓度为4×106，其余步骤以及参数均与对比例5给出的步骤和参数相同。
对比例8
本对比例与实施例5的不同之处在于将第(3)步中获得的p3代细胞调整细胞浓度为6×106，其余步骤以及参数均与对比例5给出的步骤和参数相同。
利用bca蛋白浓度测定试剂盒针对利用上述实施例1-4以及对比例1-8制备得到的裂解物中的蛋白成分进行检测，bca蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术(beyotimebiotechnology)产品编号为p0012s，将上述实施例1-4以及对比例1-8条件下提取的裂解液加入96孔板中，37℃培养箱中培养15min，加入bca试剂，利用酶标仪在526nm下测定吸光度，并利用bca蛋白浓度测定试剂盒给出的蛋白标准液制定的标准曲线得出蛋白浓度，针对实施例1-4以及对比例1-8制备得到的裂解液的检测结果如表1所示。
表1实施例1-4以及对比例1-8制备的裂解液的蛋白检测结果
由表1可知，通过实施例1-4与对比例1-8的对比可知，在人脂肪间充质干细胞的细胞浓度在1×106-6×106范围内，利用本发明提供的方法获得的人脂肪间充质干细胞裂解物的浓度均大于利用对比例提供的方法获得的人脂肪间充质干细胞裂解物的浓度。相比现有技术，本发明提供的人脂肪间充质干细胞裂解物的获取与纯化方法能够大大提高人脂肪间充质干细胞裂解物的获取量。通过提高人脂肪间充质干细胞裂解物的获取量，进而提高利用脂肪间充质干细胞治疗难愈性创面的治疗效果，缩短治疗周期。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域方法人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。